Der aus der in Frankreich kultivierten Meeres-Kiefer (Pinus pinaster) gewonnene und standardisierte Rindenextrakt Pycnogenol enthält neben Procyanidinen auch weitere polyphenolische sekundäre Naturstoffe und ist zudem weltweit als USP-gelistetes Nahrungsergänzungsmittel kommerziell erhältlich. Der Konsum von polyphenolreichen Lebensmitteln ist ebenso wie die Einnahme von Pycnogenol mit einer Vielzahl von positiven Effekten bei verschiedenen pathophysiologischen Prozessen assoziiert. Dazu zählen beispielsweise antioxidative oder antiinflammatorische Wirkungen, welche sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet werden konnten. Bislang gelang es nach der Einnahme des Extraktes nicht alle in Humanserum oder -plasma detektierten Substanzen zu identifizieren; zudem ist nicht geklärt, von welchen Stoffen konkret eine Bioaktivität ausgeht oder ob diese durch synergistische Effekte zustande kommt. Aus diesen Gründen sollten in der vorliegenden Arbeit im Rahmen einer Klinischen Studie bislang nicht beschriebene Analyten in Humanserum mittels UHPLC-qTOF-MS charakterisiert werden. Hierbei wurde ein ungerichteter, metabolomischer Ansatz gewählt. Die Studienproben der Proband*innen wurden dabei also ohne etwaige Restriktionen analysiert, beispielsweise hinsichtlich möglicher Molekülstrukturen oder der Retentionszeiten der detektierten Analyten. Näher betrachtet werden sollten Analyten, die in einer individuellen Serumprobe nach Beginn der viertägigen Pycnogenol-Einnahme neu auftraten. In Anschluss an eine Probenvorbereitung mittels methanolischer Proteinpräzipitation im sauren Milieu konnten in dem Humanserum der Proband*innen im ESI-Positiv-Modus fünf und im ESI-Negativ-Modus 23 interessante Analyten nachgewiesen werden, die auf die Einnahme von Pycnogenol zurückzuführen waren. Elf dieser Substanzen konnte eine Struktur zugeordnet werden, wobei alle ausschließlich als Sulfatkonjugate vorlagen. Zu diesen zählten neben Zimtsäure-Derivaten wie Ferulasäure-Sulfat zudem Flavonoide, z. B. Taxifolin-Sulfat, aber auch Phenylvaleriansäure-Abkömmlinge, beispielsweise Hydroxydihydroxyphenylvaleriansäure-Sulfat, sowie Vertreter aus der Gruppe der Benzoesäuren und weitere Aromaten wie z. B. Pyrogallol-Sulfat oder Protocatechusäure-Sulfat. Nach unserem besten Wissen war der Aspekt der ausschließlichen Sulfatierung neuartig. Wie aufgrund des interindividuell variablen Metabolismus zu erwarten, insbesondere durch das enterale Mikrobiom, war die Verteilung dieser sogenannten Marker innerhalb der 15 Studienteilnehmenden sehr heterogen. Nicht jeder Marker wurde bei jeder Person erfasst; die Spannweite reichte dabei von einem Teilnehmenden im Falle des mikrobiellen Metaboliten Hydroxyphenylvaleriansäure-Sulfat bis hin zu 14 Proband*innen bei einer nicht-identifizierbaren, jedoch wahrscheinlich endogenen Substanz im ESI-Positiv-Modus. Am häufigsten wurden die elf zuordenbaren Analyten vier Stunden nach der Einnahme von Pycnogenol über einen Zeitraum von vier Tagen bestimmt. Im Anschluss sollte die Bioaktivität dieser Substanzen in einem endothelialen Zellkulturmodell untersucht werden. Das Endothel wurde als Zielstruktur gewählt, da eine endotheliale Dysfunktion in der Pathogenese einer Reihe von Krankheiten mit ausgeprägter Mortalität und Morbidität eine bedeutende Rolle spielt. Zudem wurde bereits eine positive Wirkung auf die Endothelfunktion nach der Einnahme von Pycnogenol beschrieben, wobei bis dato der Mechanismus auf molekularer Ebene unklar war. Die Charakterisierung der Sulfatkonjugate bezüglich ihrer Bioaktivität ex vivo mit humanen Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) gestaltete sich herausfordernd. Initial sollte untersucht werden, inwiefern diese Substanzen einer durch einen Entzündungsstimulus hervorgerufenen Schädigung der endothelialen Glycocalyx entgegenwirken oder diese vermeiden können. Allerdings ließen sich mit den verschiedenen inflammatorischen Stimuli Lipopolysaccharid (LPS), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Wasserstoffperoxid bezüglich Konzentration und Inkubationsdauer keine reproduzierbaren Kulturbedingungen für eine valide ELISA-Quantifizierung des endothelialen Markers Heparansulfat etablieren. Im Anschluss erfolgte unter dem Einfluss einer TNF-α-Stimulation ein orientierendes Screening mit den Monosubstanzen Ferulasäure und Protocatechusäure bzw. mit deren Sulfatkonjugaten in Konzentrationen von 0,1 und 0,5 µM. Dabei zeigten die Konjugate beider Analyten bei der niedrigeren Konzentration tendenziell eine glycocalyx-protektive Wirkung, welche bei der höheren Konzentration jedoch nicht mehr beobachtet werden konnte. Die endotheliale Permeabilität wurde mittels eines FITC-Dextran-Permeabilitäts-Assays untersucht. Hiermit sollte ebenfalls ein möglicher endothel-protektiver Einfluss der sulfatierten Substanzen unter entzündlichen Bedingungen (TNF-α-Stimulation) beleuchtet werden. Jedoch konnte weder bei Ferulasäure oder Protocatechusäure noch bei deren Sulfatkonjugate oder Taxifolin in diesem Modell ein Einfluss auf die endotheliale Barrierefunktion erfasst werden. Ursprünglich war abschließend geplant in einem ex vivo-Modell die Humanserum-Proben mit dem darin enthaltenen Gemisch aus möglicherweise bioaktiven Metaboliten direkt im Zellkulturmodell auf ihre Wirkung zu testen. Dies hat den Vorteil, dass simultan synergistische Effekte und Einflüsse der Matrix untersucht werden können und ausschließlich in vivo erreichbare Konzentrationen eingesetzt werden. Aufgrund der limitierten Verfügbarkeit der Studienproben und der oben geschilderten heterogenen Ergebnisse wurde auf eine weitere Analyse im Rahmen eines ex vivo-Modells verzichtet. Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach der Einnahme von Pycnogenol resorbierte Bestandteile und Metabolite in Humanserum ausschließlich als Sulfatkonjugate vorlagen. Zudem wurde bezüglich der Evaluation der endothelialen Bioaktivität durch Polyphenole eine Grundlage für weitere Untersuchungen geschaffen. Damit konnte ein Beitrag zur pharmakokinetischen und -dynamischen Charakterisierung von Pycnogenol geleistet werden. / Pycnogenol is a standardized bark extract from the French maritime pine Pinus pinaster, which is monographed in the USP as a dietary supplement. The main components are procyanidins as well as other polyphenolic secondary metabolites. The consumption of polyphenol-rich food or extracts is associated with miscellaneous beneficial effects in different pathophysiological processes. This accounts for the intake of Pycnogenol as well, which exhibits antioxidant and antiinflammatory effects both in vitro and in vivo. So far, not all analytes detected in human serum or plasma could be identified after ingestion of the bark extract; additionally, the exact bioactive compounds are unknown as well as probable synergistic effects. Therefore, the aim of the present thesis was the UHPLC-qTOF-MS-identification of previously unidentified analytes in human serum of fifteen volunteers in a clinical study. Study samples were analyzed using an untargeted, metabolomic approach without any predefined restrictions regarding possible chemical structures or the retention times of the detected analytes. Analytes which were tracked in individual serum samples after the start of a four-day course of Pycnogenol-intake were to be further characterized. Human serum of the subjects was analyzed by UHPLC-qTOF-MS after protein precipitation with methanol acidified with formic acid. In total, five analytes in ESI positive mode and 23 in negative mode were detected, which were related to the intake of Pycnogenol. Eleven of these substances were assigned a molecular structure, all of them were exclusively sulfate conjugates. These included cinnamic acid derivates such as ferulic acid sulfate as well as flavonoids, e.g., taxifolin sulfate, but also phenylvaleric acid metabolites, for example hydroxydihydroxyphenylvaleric acid sulfate, and additionally benzoic acids and other aromatic compounds such as pyrogallol sulfate or protocatechuic acid sulfate. To the best of our knowledge, the exclusive presence of sulfate conjugates has never been reported before. The distribution and presence of the features differed greatly within the study participants. This fact was to be expected based on marked interindividual variable metabolism, especially by gut microbiota. Not every analyte was detected in every subject; hydroxyphenylvaleric acid sulfate was identified in only one person, whereas an unknown marker appeared in 14 subjects in ESI positive mode, which was presumably an endogenous compound. Most of the eleven analytes mentioned above were detected four hours after the last ingestion of a 4-day-course. Subsequently, a comprehensive characterization of these compounds with respect to their effects on the endothelium in a cell culture model was planned. Endothelial dysfunction plays a significant role in the pathogenesis of a variety of diseases with marked mortality and morbidity. For this reason, the endothelium was chosen as a target for these assays. Several beneficial effects on endothelial function in vitro and in vivo had already been reported after Pycnogenol-ingestion, although the precise mechanism at the molecular level was not known. The ex vivo bioactivity characterization of the sulfate conjugates in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was challenging. Initially, it was planned to investigate a probable protection from endothelial glycocalyx damage induced by different inflammatory stimuli. Heparan sulfate, an integral part of the endothelial glycocalyx, was chosen to be the target for ELISA-quantification. However, the establishment of reproducible cell culture conditions was not possible, neither with the application of lipopolysaccharide (LPS) nor tumor necrosis factor α (TNF-α) or hydrogen peroxide. A screening performed with both sulfated and unconjugated ferulic acid and protocatechuic acid at a concentration of 0.1 and 0.5 μM did not show any promising result regarding protection of the endothelium under TNF-α initiated inflammation. At the lower concentration, both sulfate conjugates appeared to exhibit a slight glycocalyx-protective effect, whereas this was not observed at higher concentration. Subsequently, endothelial permeability was assessed under inflammatory conditions (stimulation with TNF-α) by FITC-dextran-transport. Neither ferulic acid nor protocatechuic acid or their sulfate conjugates nor taxifolin protected the endothelial barrier function in this model. Originally, it was planned to evaluate human serum samples containing all possibly bioactive compounds in an ex vivo model; in this set up, human serum is applied directly to cell culture in order to examine effects. Firstly, synergistic actions of different analytes and the effect of matrix on bioactivity can be measured. Secondly, only physiologic relevant concentrations are used. However, due to the limited availability of the study samples and the previously mentioned heterogeneous results, this approach was not further pursued. As a summary, the present work revealed that absorbed components and metabolites after the ingestion of Pycnogenol were exclusively present as sulfate conjugates in human serum. In addition, a base for further bioactivity studies of polyphenols with respect to endothelial function was established. Therefore, this work contributed to the pharmacokinetic and pharmacodynamic characterization of Pycnogenol.

Marine sponge-associated actinomycetes are considered as promising source for the discovery of novel biologically active compounds. Metabolomics coupled multivariate analysis can efficiently reduce the chemical redundancy of re-isolating known compounds at the very early stage of natural product discovery. This Ph.D. project aimed to isolate biologically active secondary metabolites from actinomycetes associated with different Mediterranean sponges with the assistance of metabolomics tools to implement a rapid dereplication and chemically distinct candidate targeting for further up-scaling compounds isolation. This study first focused on the recovery of actinomycetes from marine sponges by various cultivation efforts. Twelve different media and two separate pre-treatments of each bacterial extract were designed and applied to facilitate actinomycete diversity and richness. A total of 64 actinomycetes were isolated from 12 different marine sponge species. The isolates were affiliated to 23 genera representing 8 different suborders based on nearly full-length 16S rRNA gene sequencing. Four putatively novel species belonging to the genera Geodermatophilus, Microlunatus, Rhodococcus, and Actinomycetospora were identified based on a sequence similarity <98.5% to validly described 16S rRNA gene sequences. 20% of the isolated actinomycetes was shown to exhibit diverse biological properties, including antioxidant, anti-Bacillus sp., anti-Aspergillus sp., and antitrypanosomal activities. The metabolomics approaches combined with the bioassay results identified two candidate strains Streptomyces sp. SBT348 and Streptomyces sp. SBT345 for further up-scaling cultivation and compounds isolation. Four compounds were isolated from Streptomyces sp. SBT348. Three of these compounds including the new cyclic dipeptide petrocidin A were previously highlighted in the metabolomics analyses, corroborating the feasibility of metabolomics approaches in novel compounds discovery. These four compounds were also tested against two pathogen microorganisms since the same activities were shown in their crude extract in the preliminary bioassay screening, however none of them displayed the expected activities, which may ascribe to the insufficient amount obtained. Streptomyces sp. SBT345 yielded 5 secondary metabolites, three of which were identified as new natural products, namely strepthonium A, ageloline A and strepoxazine A. Strepthonium A inhibited the production of Shiga toxin produced by enterohemorrhagic Escherichia coli at a concentration of 80 μM, without interfering with the bacterial growth. Ageloline A exhibited antioxidant activity and inhibited the inclusion of Chlamydia trachomatis with an IC50 value of 9.54 ± 0.36 μM. Strepoxazine A displayed antiproliferative property towards human promyelocytic HL-60 cells with an IC50 value of 16 μg/ml. 11 These results highlighted marine sponges as a rich source for novel actinomycetes and further exhibited the significance of marine sponge-associated actinomycetes as promising producers of novel biologically active compounds. The chemometrics coupled metabolomics approach also demonstrated its feasibility and efficacy in natural product discovery. / Schwamm-assoziierte Actinomyceten stellen eine vielversprechende Quelle für die Entdeckung neuer, biologisch aktiver Verbindungen dar. Metabolomik gekoppelte multivariate Datenalyse kann die erneute Isolation bekannter chemischer Verbindungen in einem frühen Stadium drastisch reduzieren und der Entdeckung neuer Naturstoffe dadurch effizienter machen. Das Ziel dieser Arbeit war es, biologisch aktive Sekundärmetabolite aus Actinomyceten, welche mit Mittelmeerschwämmen assoziiert sind, zu isolieren. Mithilfe von Werkzeugen aus der Metabolomik soll eine schnelle Dereplikation sowie gezielte Auswahl an chemischen Verbindungen implementiert werden um diese nachfolgend und in hohem Durchsatz isolieren zu können. Diese Promotions-Arbeit konzentriert sich zunächst auf die Isolation von Actinomyceten aus marinen Schwämmen mittels verschiedener Kultivierungsmethoden. Zwölf verschiedene Medien sowie zwei unterschiedliche Vorbehandlungen der bakteriellen Extrakte wurden angewendet, um die Kultivierung diverser Actinomyceten zu ermöglichen. Insgesamt konnten damit 64 Actinomyceten aus 12 unterschiedlichen Schwämmen isoliert worden. Mithilfe der Sequenzierung von 16S rRNA Sequenzen konnten diese bakteriellen Isolate 23 Gattungen und 8 Unterordnungen zugewiesen werden. Aufgrund von Sequenzähnlichkeiten <98.5% wurden 4 neue Arten identifiziert, welche zu den folgenden Gattungen gehören: Geodermatophilus, Microlunatus, Rhodococcus and Actinomycetospora. 20% der isolierten Actinomyceten wurde gezeigt, die verschiedene biologische Eigenschaften aufweisen, einschließlich antixocidativer, antibakterieller, Fungiziden Eigenschaften sowie ihrer anti- Trypanosomen -Aktivitäten. Mithilfe metabolomischer Methoden und Bioassays konnten zwei bakterielle Stämme, Streptomyces sp. SBT348 und Streptomyces sp. SBT345, für deren Kultivierung und Isolierung chemischer Verbindung identifiziert werden. Aus dem Stamm Streptomyces sp. SBT348 konnten vier neue Verbindungen isoliert werden, darunter ein neues, zyklisches Dipeptid Petrocidin A. Drei dieser Verbindungen, einschließlich Petrocidin A, wurden bei der Datenanalyse der Metabolomik hervorgehoben. Das bestätigte die Durchführbarkeit metabolomischer Methoden für die Entdeckung neuer Verbindungen. Allerdings zeigte keine Verbindung die erwarteten Aktivitäten. Das könnte darauf zurückgeführt werden, dass die erhaltenen Mengen unzureichend waren. In Streptomyces sp. SBT345 konnten fünf Sekundärmetabolite identifiziert werden, von welchen drei - Strepthonium A, Ageloline A und Strepoxazine A - als neue Naturstoffe identifiziert werden konnten. Durch Strepthonium A in einer Konzentration von 80 µM konnte die Produktion des Shiga-Toxins in Escherichia coli gehemmt werden, ohne dessen bakterielles Wachstum zu beeinflussen. Ageloline A wirkte antioxidativ und hemmte Chlamydia trachomatis mit einem IC50 Wert von 9.54 ± 0.36 µM. Strepoxazine A zeigte eine wachstumshemmende Wirkung gegenüber HL-60 Zellen (humane Promyelozytenleukämie-Zellen) bei einem IC50 Wert von 16 µg/ml. Die Ergebnisse zeigen auf, dass marine Schwämme viele bisher unbekannte Actinomyceten beherbergen. Diesen Actinomyceten ist eine hohe Bedeutung beizumessen, da sie eine vielversprechende Quelle für neue, biologisch aktive Verbindungen darstellen. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der methodische Ansatz via chemometrischer und metabolomischer Methoden gut durchführbar und effizient ist und daher für die Entdeckung von Naturstoffen sehr gut geeignet ist.

Phäochromozytome und Paragangliome (PPGL) sind seltene, katecholaminproduzierendeTumore des chromaffinen Gewebes. Die Erkrankung ist durch die Überproduktion von Katecholaminen gekennzeichnet und kann lebensbedrohliche Folgen haben. Die dieser Arbeit zugrunde liegende Studie untersuchte die interindividuellen Unterschiede im Metabolitenprofil bei Patient*innen mit PPGL im Vergleich zu Kontrollen mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und einem Targeted Metabolomic Ansatz. Targeted Metabolomics beschreibt die Messung und Quantifizierung von im Voraus definierten Metaboliten in einer Probe. Von den 188 gemessenen Metaboliten zeigten vier Metabolite eine signifikanten Veränderung zwischen den Gruppen (Histidin, Threonin, LysoPC a C28:0 und Summe der Hexosen). Für alle vier Metabolite wurde ein Zusammenhang mit Katecholaminen im Urin beziehungsweise Metanephrinen im Plasma nachgewiesen. Subgruppenanalysen zeigten weitere Hinweise auf geschlechts- und phänotypspezifische Unterschiede im Metabolitenprofil zwischen Patient*innen mit PPGL und Kontrollen. / Pheochromocytomas and paragangliomas (PPGL) are rare, catecholamine-producing tumors arising from chromaffin cells. The disease is characterized by the overproduction of catecholamines and can have life-threatening consequences. The study on which this work is based investigated the interindividual differences in metabolite profiles in patients with PPGL compared to controls using liquid chromatography-mass spectrometry and a targeted metabolomics approach. Targeted metabolomics describes the measurement and quantification of predefined metabolites. Of the 188 metabolites measured, four metabolites showed a significant change between groups (histidine, threonine, LysoPC a C28:0 and sum of hexoses). A significant correlation with urinary catecholamines and/ or plasma metanephrines was identified for this metabolites. Subgroup analyses showed further evidence of sex- and phenotype-specific differences in metabolite profiles between patients with PPGL and controls.

Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle des Metabolismus in der Entstehung und Progression des Hepatozellulären Karzinoms (HZK). Der Schwerpunkt der Studie liegt auf Veränderungen zentraler Stoffwechselwege, unter anderem der Glykolyse, der Gluconeogenese, des Citratzyklus und anderer Prozesse des Zellstoffwechsels. Umfassende Multiomikanalysen, wie etwa Proteomik, Metabolomik und gezielte Genomsequenzierung wurden angewandt, um in vivo die Mechanismen der HZK Entstehung zu verstehen. Es wurden zwei Systeme untersucht: das ASV-B Mausmodell und klinische Patientenproben. Die Kohorte bestehend aus Biopsien und Resektaten von 95 Patienten umfasste 47 Fälle von HZK und 48 Fälle ohne HZK. Das Proteom des Mausmodells und der Patientenkohorte zeigen eine deutliche Herabregulierung wesentlicher Energie bereitstellender Kreisläufe im HZK: Glykogenstoffwechsel, de novo Synthese von Glukose, Glutaminaufnahme in den Citratzyklus, des weiteren sind 60% der Enzyme des Citratzyklus, und des Transports von Pyruvat in Mitochondrien im HZK herabreguliert. In dieser Arbeit wurde ein Isoformenwechsel auf mehreren Ebenen des zentralen Kohlenstoffmetabolismus gezeigt. Sowohl das Mausmodell, als auch die Gewebeproben von HZK-Patienten weisen Isoformenwechsel der Phosphoglyzeratmutasen und der Pyruvatkinasen auf. Die Hauptmerkmale finden sich sowohl in Modellmäusen, als auch in Patienten, und stellen so einen universalen metabolomischen Fingerabdruck des HZK dar. Darüber hinaus demonstriert diese Studie, dass die Proteomanalyse von bioptischen Material ein aussagekräftiges und ausreichendes molekular-diagnostisches Instrument für die Krebsforschung ist: die Proteomanalyse von Lebermaterial erlaubt die Unterscheidung von Tumorgewebe und tumorfreien Proben und die Dokumentation des Krankheitsverlaufs. / The present work evaluates the role of metabolism in development and progression of hepatocellular carcinoma (HCC). This study focuses on changes of central metabolic pathways, including glycolysis, gluconeogenesis, tricarboxylic acid (TCA) cycle and other processes involved in cellular metabolism and known to be dysregulated during cancer formation. Comprehensive multiomics analyses, such as proteomics, metabolomics and targeted genome sequencing, were applied in order to better understand HCC developmental mechanisms in vivo. Two main systems were studied: the ASV-B mouse model and clinical samples from human patients. The human cohort was composed of biopsy and surgery material from 95 patients: 47 HCC and 48 non-HCC. Proteomic data from both mice and humans show a clear downregulation of the main energy-producing pathways in HCC. Glycogen metabolism, de novo glucose synthesis, glutamine uptake to the TCA cycle, approximately 60% of enzymes of TCA cycle, and transport of pyruvate to mitochondria are downregulated in HCC. An isoform switch at various levels of central carbon metabolism was demonstrated in this work. Both mice and humans with HCC reveal isoform switches at the level of phosphoglycerate mutases and pyruvate kinases. The key features are found in both mouse and human, showing a universal metabolic HCC fingerprint. This study also demonstrates that proteomic analysis of the bioptate material is a strong and sufficient molecular diagnostic tool for research in cancer: the proteomic analysis of liver material allows the distinction of tumor samples from non-tumor samples and also to track the level of disease progression. Targeted genome sequencing revealed that no clear distinction between cancer and precancerous conditions could be made exclusively from the mutation analysis. Human metabolomic data remains inconclusive, possibly due to the different sources of tissue samples.

Inositolpyrophosphate (PP-InsPs) sind eine wichtige Gruppe eukaryotischer Botenstoffe, die mit verschiedenen Prozessen wie Apoptose, Phosphathomeostase und Insulinsignalkaskaden verknüpft sind. Trotz ihrer Entdeckung vor mehr als 20 Jahren bleibt es eine Herausforderung, die Signalmechanismen dieser Moleküle zu verstehen. Ursachen dafür sind der limitierte Zugang zu synthetischen PP-InsPs und ein Mangel an allgemein zugänglichen analytischen Methoden. Daher wurden in dieser Arbeit chemische und analytische Verfahren entwickelt, um unser Verständnis von diesen Molekülen sowohl auf ein biochemischer als auch auf zelluläre Ebene zu verbessern. Um der Knappheit an synthetischen PP-InsPs entgegen zu wirken, wurde eine hocheffiziente chemoenzymatische Synthese entwickelt, bei der mehr als 100 mg aller wesentlichen PP-InsPs aus Säugern hergestellt werden konnten. Parallel wurde ein neues analytisches Werkzeug entwickelt, dass Konzentrationen von PP-InsPs in komplexen Proben quantifizieren konnte. Mittels Enzymkatalyse konnten 13C-markiertes myo-inositol und 13C-markierte PP-InsPs hergestellt werden und niedrige Konzentrationen mit nuklearer Magnetresonanzspektroskopie detektiert werden. In vitro waren diese Verbindungen sehr nützlich, um PP-InsP Kinasen von Pflanzen und Säugern zu charakterisieren. Endogene Konzentrationen von PP-InsPs konnten durch metabolisches Markieren mit 13C-markiertem myo-inositol in humanen Zelllinien quantifiziert werden. Letztendlich wurde mittels eines neuen entwickelten proteomischen Ansatzes endogene Proteinpyrophosphorilierung, eine von PP-InsP eingebaute posttranslationale Proteinmodifikation, in menschlichen Zelllinien zum ersten Mal nachgewiesen. Zusammenfassend haben die aufgelisteten chemischen und analytischen Werkzeuge ein hohes Potenzial unser Verständnis der Signalmechanismen hinter den diversen Phänotypen der PP-InsPs zu stärken und Forschungsarbeit in dieser Richtung zu beschleunigen. / Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of second messengers that intersect with a wide range of processes in eukaryotic cells including phosphate homeostasis, insulin signaling and apoptosis. Despite their discovery more than two decades ago, elucidating the underlying signaling mechanisms remains a significant challenge. Therefore, a new set of chemical and analytical methods was developed here to improve our understanding of these intriguing molecules on the biochemical and cellular level. To overcome the shortage of synthetic PP-InsPs, a highly efficient and scalable chemoenzymatic approach was designed and the major mammalian PP-InsPs could be obtained in hundreds of milligram quantities and in high purity. In parallel, a new analytical tool was developed to quantify levels of PP-InsPs in complex samples. Chemoenzymatic access to 13C-labeled myo-inositol and 13C-labeled PP-InsPs enabled the detection of low concentrations of PP-InsPs using nuclear magnetic resonance spectroscopy. In vitro, these compounds were of great use for the biochemical characterization of PP-InsPs kinases from mammals and plants. Endogenous pools of PP-InsPs from human cell lines were identified and quantified by metabolic labeling with 13C-labeled myo-inositol. Finally, a new proteomics workflow towards the detection of protein pyrophosphorylation, a posttranslational modification mediated by PP-InsPs, using mass spectrometry was optimized and endogenously modified mammalian proteins could be identified for the first time and with high confidence. Taken together, the chemical and analytical tools presented here have great potential to accelerate the understanding of PP-InsP signaling and metabolism. Access to large amounts of PP-InsPs together with a reliable quantification method and the detection of endogenous protein pyrophosphorylation sites will be essential to unravel the signaling mechanisms underlying the diverse phenotypes associated with these metabolites.

In forensic autopsies, accurately estimating the postmortem interval (PMI) is crucial. Traditional methods, relying on physical parameters and police data, often lack precision, particularly after approximately two days have passed since the person's death. New methods are increasingly focusing on analyzing postmortem metabolomics in biological systems, acting as a 'fingerprint' of ongoing processes influenced by internal and external molecules. By carefully analyzing these metabolomic profiles, which span a diverse range of information from events preceding death to postmortem changes, there is potential to provide more accurate estimates of the PMI. The limitation of available real human data has hindered comprehensive investigation until recently. Large-scale metabolomic data collected by the National Board of Forensic Medicine (RMV, Rättsmedicinalverket) presents a unique opportunity for predictive analysis in forensic science, enabling innovative approaches for improving  PMI estimation. However, the metabolomic data appears to be large, complex, and potentially nonlinear, making it difficult to interpret. This underscores the importance of effectively employing machine learning algorithms to manage metabolomic data for the purpose of PMI predictions, the primary focus of this project.  In this study, a dataset consisting of 4,866 human samples and 2,304 metabolites from the RMV was utilized to train a model capable of predicting the PMI. Random Forest (RF) and Artificial Neural Network (ANN) models were then employed for PMI prediction. Furthermore, feature selection and incorporating sex and age into the model were explored to improve the neural network's performance.  This master's thesis shows that ANN consistently outperforms RF in PMI estimation, achieving an R2 of 0.68 and an MAE of 1.51 days compared to RF's R2 of 0.43 and MAE of 2.0 days across the entire PMI-interval. Additionally, feature selection indicates that only 35% of total metabolites are necessary for comparable results with maintained predictive accuracy. Furthermore, Principal Component Analysis (PCA) reveals that these informative metabolites are primarily located within a specific cluster on the first and second principal components (PC), suggesting a need for further research into the biological context of these metabolites.  In conclusion, the dataset has proven valuable for predicting PMI. This indicates significant potential for employing machine learning models in PMI estimation, thereby assisting forensic pathologists in determining the time of death. Notably, the model shows promise in surpassing current methods and filling crucial gaps in the field, representing an important step towards achieving accurate PMI estimations in forensic practice. This project suggests that machine learning will play a central role in assisting with determining time since death in the future.