Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-12. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:39Z : No. of bitstreams: 1 000837967_20170212.pdf: 232550 bytes, checksum: a1094395aeb571a1e335ad7f2c585852 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-02-17T11:23:26Z: 000837967_20170212.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-02-17T11:24:29Z : No. of bitstreams: 1 000837967.pdf: 3734694 bytes, checksum: 58e85e2f06e28ba5f8c69ee9e98eefee (MD5) / O clone metagenômico B5pl37 (inserto de 23 Kb) foi obtido por meio de uma prospecção por PCR para o conjunto gênico de Policetídeos Sintases tipo II (PKSII) em uma biblioteca cosmidial de amostra de solo de bosque de eucaliptos (S.E.). As PKSII são responsáveis pela produção de inúmeras moléculas bioativas, dentre os quais se destacam os antibióticos policetídicos. Parte da sequência do inserto (cobertura de 27-43%) apresentou similaridade de 77-78% com bactérias da família Streptomycetaceae (ferramenta BlastN, Genbank). Além da PKS II, a anotação gênica permitiu identificar genes relacionados à degradação de compostos lignocelulósicos importantes para a produção de combustíveis de segunda geração (2G): uma β- glicosidase, uma celulase e uma Multicopper oxidase (MCO). Considerando a importância industrial destes genes, este trabalho teve como objetivo a caracterização in silico e in vitro/vivo dos mesmos. As análises in silico auxiliaram a identificar a arquitetura do sítio ativo (modelo de estrutura proteica obtida por homologia) e famílias enzimáticas (com base em agrupamentos fenéticos com sequências de enzimas de atividade conhecida). Quanto às análises in vitro/vivo, foram realizados experimentos de expressão em vetor pET28a em Escherichia coli para as enzimas celulase (linhagens de E.coli BL21; C41 e Artics) e β-glicosidase (E.coli BL21), enquanto o gene MCO foi submetido à síntese in vitro para um estudo posterior. Foi feita a caracterização cinética da β-glicosidase (melhor rendimento na expressão e purificação), que obteve os parâmetros catalíticos: Vmax de 0,79 μM/min; km de 0,46 mM.. Os respectivos valores de temperatura e pH ótimos para a enzima foram 37°C e pH7-7,5; e a enzima foi capaz de manter uma atividade acima de 80% para uma faixa de pH 6,5-8,0 e temperatura 35- 40°C. Com relação à PKSII, foram iniciados os processos preparatórios para a... / The Clone metagenomic B5pl37 (insert of 23kb length) was obtained by a PCR prospect for gene set Polyketide Synthases type II (PKSII) in a library cosmidial eucalyptus grove soil sample (SE). The PKSII are responsible for producing many bioactive molecules, among which the antibiotics were noticeable. Part of the sequence of the insert (27-43% coverage) showed similarity of 77-78% with bacteria Streptomycetaceae family (BLASTN tool, Genbank). In PKS II gene annotation was possible to identify genes related to the degradation of lignocellulosic important compounds for the production of second generation biofuel (2G): A β-glucosidase, a cellulose and a Multicopper oxidase (MCO). Considering the industrial importance of these genes, this study aimed to characterize in silico and in vitro /in vivo thereof. The in silico analyzes helped identify the architecture of the active site (protein structure obtained by homology) and enzyme families (based on phenetic groups with sequences of known enzyme activity). The in vitro / vivo experiments were performed in pET28a expression vector in Escherichia coli for cellulase (E. coli strains BL21; Artics and C41) and β-glucosidase (E. coli BL21), while the gene MCO in vitro synthesis for a subsequent study it was submitted. We had done the kinetic characterization of β- glucosidase (best performance in the expression and purification), which obtained the catalytic parameters: Vmax 0.79 uM / min; km from 0.46 mM. The respective temperature and the pH optimum for the enzyme was 37 ° C and pH7-7,5; and the enzyme was able to maintain an activity above 80% at a pH of 6.5-8.0 and temperature range 35-40 ° C. With respect to PKSII, the preparatory processes have been started to insert the expression in the same host specialized for expression of Streptomyces coelicolor antibiotic M1152 (courtesy of Juan P. Gomez-Escribano, John Innes Centre, Norwich, UK). Cosmidial exchange vector was carried out ...

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-12-01T15:11:09Z No. of bitstreams: 1 Dis_ICS_Ana Camila Mendes Andrade.pdf: 4035300 bytes, checksum: 69141acbb749819aaa3f01943a33691f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-01T15:11:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dis_ICS_Ana Camila Mendes Andrade.pdf: 4035300 bytes, checksum: 69141acbb749819aaa3f01943a33691f (MD5) / FAPESB / A Caatinga é a única região natural exclusivamente brasileira, sendo, no entanto, a área menos conhecida dentre os demais biomas. Pouco se sabe sobre a diversidade microbiana da Caatinga e menos ainda sobre o potencial biotecnológico desta região, no que diz respeito, por exemplo, à bioprospecção enzimática. Um dos principais grupos de enzimas de interesse biotecnológico são as hidrolases, que catalisam a hidrólise de ligações covalentes da matéria orgânica e por isso podem ser aplicadas na conversão da biomassa vegetal, para a produção de biocombustíveis. Apesar das hidrolases representarem as principais enzimas com aplicações biotecnológicas para esse fim, outros grupos de enzimas envolvidas no metabolismo de carboidratos (CAZymes) também detém um papel importante neste processo. O presente trabalho se propõe a utilizar a abordagem metagenômica para analisar amostras de água do rio Paraguaçu e amostras de solo de uma localidade da Chapada Diamantina, quanto à presença de enzimas potencialmente aplicáveis na bioconversão de biomassa vegetal. O DNA metagenômico extraído das amostras foi sequenciado pelo método shotgun e foram realizadas duas estratégias de anotação: a anotação pela tecnologia de subsistemas e a anotação baseada em regiões conservadas das sequências de CAZymes. Observou-se que o solo e a água apresentaram diferenças nos seus perfis taxonômicos e na distribuição dos subsistemas e das famílias de CAZymes que predominaram em cada ambiente. O subsistema de carboidratos foi o mais abundante no solo e o segundo com maior contribuição na água. Os subsistemas clustering-based e de aminoácidos e derivados também estiveram dentre os mais representativos nos dois ambientes. Em relação às classes de CAZymes, as glicosil hidrolases foram dominantes no solo (~44%) enquanto que as glicosil transferases foram mais frequentes na água (~50%). Em relação aos principais táxons associados às CAZymes, a classe Planctomycetia apresentou contribuição de 29% nas amostras de solo e Alphaproteobacteria contribuiu com 27% nas amostras de água. O mesmo não aconteceu ao analisar a estrutura da comunidade microbiana total, na qual Actinobacteria foi a classe dominante no solo e Betaproteobacteria na água. Os resultados encontrados indicam o potencial biotecnológico da Caatinga. Determinados grupos de enzimas identificados no solo e na água podem desempenhar atividades na degradação de substratos de interesse industrial, como o amido, o xilano, a lignina e outros compostos lignocelulósicos, tornando este bioma uma interessante fonte para bioprospecção.

Made available in DSpace on 2016-03-07T19:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-05. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T19:25:25Z : No. of bitstreams: 1 000857837.pdf: 711884 bytes, checksum: c40009896f0753484b5a333e5ddc9b46 (MD5) / Desde a expansão da indústria, a partir da revolução industrial, a população mundial tem crescido de forma exponencial. Este aumento populacional aliado aos avanços tecnológicos constantes alavancou o consumo mundial de energia. Este cenário tem incentivado países do mundo todo a buscar alternativas para aumentar a produção de energia. Uma das alternativas adotadas são os biocombustíveis, onde o etanol tem lugar de destaque. Para tanto, a degradação de biomassa vegetal, para a liberação dos açúcares estruturais da fibra vegetal para fermentação, tem se intensificado. O etanol é o principal biocombustível brasileiro e o uso de biomassa vegetal é uma alternativa para o aumento de sua produção. No entanto, a ação enzimática ineficiente na degradação de polissacarídeos estruturais impede a produção industrial. Uma solução é a prospecção de enzimas degradantes de biomassa e um ambiente para esta busca pode ser o rúmen. O qual é um ambiente rico em micro-organismos que degradam a lignocelulose. Considerando que cerca de 99% dos micro-organismos não são passíveis ao cultivo tradicional, a fim de romper com estas limitações foi usada a abordagem metagenômica neste estudo para caracterização de genes com potencial para degradar biomassa e também para avaliação da diversidade taxonômica do ambiente ruminal bovino. Foram coletadas amostras de rúmen de um gado Nelore para a obtenção de DNA, que posteriormente foi sequenciado pelo sequenciador HiScan SQ (Illumina). Foram obtidas 65 milhões de sequências, cada uma com 100 pb, que foram analisadas no servidor MG-RAST. Para montar o perfil taxonômico deste metagenoma foram usados três bancos de dados na análise das sequências: Ribossomal database Project (RDP), que encontrou 18 filos na amostra; Greengenes, que encontrou 16 filos; e SILVA Small SubUnit (SSU) onde foram encontrados 22 filos. Dentre todos os filos encontrados o Firmicutes foi o... / Since the expansion of industry through the Industrial Revolution, the world population has increased unprecedented. This rise together the constant technological advances leveraged the world's energy consumption. This scenario has encouraged countries around the world to seek alternatives to higher energy production, being the biofuels one of the adopted alternatives, which ethanol has excelled. Therefore, the plant biomass degradation for the release of structural sugars from plant fiber fermentation has intensified. Ethanol is the main Brazilian biofuel and the use of plant biomass is an alternative for increasing its production. However, inefficient enzymatic action in the degradation of structural polysaccharides prevents industrial production. One solution is the prospect of biomass degrading enzymes and an environment for this search may be the rumen, which is an environment rich in microorganisms that degrade lignocellulose. Whereas about 99% of the microorganisms are not amenable to traditional growth, in order to break these limitations was used a metagenomics approach in this study to characterize genes with potential to degrade biomass and to evaluate the taxonomic diversity of bovine rumen environment. Rumen samples were collected from Nelore cattle for obtaining total DNA, which was subsequently sequenced by SQ HiScan (Illumina) sequencer. Sixtyfive million sequences were obtained, each with a 100 bp, which were analyzed by MG-RAST server. In order to mount the taxonomic profile of this metagenomic we used three databases on the analysis of sequences: Ribosomal Database Project (RDP), which found 18 phyla in the sample; GreenGenes, which found 16 phyla; and SILVA Small subunit (SSU) which found 22 phyla. Among all the phyla, Firmicutes was the most abundant, followed by Bacteroidetes and Proteobacteria by the three databases. For the functional analysis were used five databases for prospecting glycoside Hydrolases ...

Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Janete Aparecida Desidério / Banca: Tiago Santana Balbuena / Banca: André Ricardo de Lima Damásio / Banca: Igor Polikarpov / Resumo: O clone metagenômico B5pl37 (inserto de 23 Kb) foi obtido por meio de uma prospecção por PCR para o conjunto gênico de "Policetídeos Sintases tipo II" (PKSII) em uma biblioteca cosmidial de amostra de solo de bosque de eucaliptos (S.E.). As PKSII são responsáveis pela produção de inúmeras moléculas bioativas, dentre os quais se destacam os antibióticos policetídicos. Parte da sequência do inserto (cobertura de 27-43%) apresentou similaridade de 77-78% com bactérias da família Streptomycetaceae (ferramenta BlastN, Genbank). Além da PKS II, a anotação gênica permitiu identificar genes relacionados à degradação de compostos lignocelulósicos importantes para a produção de combustíveis de segunda geração (2G): uma β- glicosidase, uma celulase e uma "Multicopper oxidase" (MCO). Considerando a importância industrial destes genes, este trabalho teve como objetivo a caracterização in silico e in vitro/vivo dos mesmos. As análises in silico auxiliaram a identificar a arquitetura do sítio ativo (modelo de estrutura proteica obtida por homologia) e famílias enzimáticas (com base em agrupamentos fenéticos com sequências de enzimas de atividade conhecida). Quanto às análises in vitro/vivo, foram realizados experimentos de expressão em vetor pET28a em Escherichia coli para as enzimas celulase (linhagens de E.coli BL21; C41 e Artics) e β-glicosidase (E.coli BL21), enquanto o gene MCO foi submetido à síntese in vitro para um estudo posterior. Foi feita a caracterização cinética da β-glicosidase (melhor rendimento na expressão e purificação), que obteve os parâmetros catalíticos: Vmax de 0,79 μM/min; km de 0,46 mM.. Os respectivos valores de temperatura e pH ótimos para a enzima foram 37°C e pH7-7,5; e a enzima foi capaz de manter uma atividade acima de 80% para uma faixa de pH 6,5-8,0 e temperatura 35- 40°C. Com relação à PKSII, foram iniciados os processos preparatórios para a... / Abstract: The Clone metagenomic B5pl37 (insert of 23kb length) was obtained by a PCR prospect for gene set "Polyketide Synthases type II" (PKSII) in a library cosmidial eucalyptus grove soil sample (SE). The PKSII are responsible for producing many bioactive molecules, among which the antibiotics were noticeable. Part of the sequence of the insert (27-43% coverage) showed similarity of 77-78% with bacteria Streptomycetaceae family (BLASTN tool, Genbank). In PKS II gene annotation was possible to identify genes related to the degradation of lignocellulosic important compounds for the production of second generation biofuel (2G): A β-glucosidase, a cellulose and a Multicopper oxidase (MCO). Considering the industrial importance of these genes, this study aimed to characterize in silico and in vitro /in vivo thereof. The in silico analyzes helped identify the architecture of the active site (protein structure obtained by homology) and enzyme families (based on phenetic groups with sequences of known enzyme activity). The in vitro / vivo experiments were performed in pET28a expression vector in Escherichia coli for cellulase (E. coli strains BL21; Artics and C41) and β-glucosidase (E. coli BL21), while the gene MCO in vitro synthesis for a subsequent study it was submitted. We had done the kinetic characterization of β- glucosidase (best performance in the expression and purification), which obtained the catalytic parameters: Vmax 0.79 uM / min; km from 0.46 mM. The respective temperature and the pH optimum for the enzyme was 37 ° C and pH7-7,5; and the enzyme was able to maintain an activity above 80% at a pH of 6.5-8.0 and temperature range 35-40 ° C. With respect to PKSII, the preparatory processes have been started to insert the expression in the same host specialized for expression of Streptomyces coelicolor antibiotic M1152 (courtesy of Juan P. Gomez-Escribano, John Innes Centre, Norwich, UK). Cosmidial exchange vector was carried out ... / Doutor

As compostagens abrigam uma grande riqueza microbiológica, englobando populações com distintos requerimentos e tolerâncias fisiológicas que se sucedem ao longo do processo de biodegradação aeróbica da matéria orgânica e que resultam na elevação espontânea de temperatura até 80° C. Com a utilização de abordagens de metagenômica e metatranscritômica, investigamos a composição e a diversidade taxonômica, bem como as funções metabólicas de comunidades microbianas da compostagem termofílica do Parque Zoológico de São Paulo. Foram analisadas amostras em série temporal de duas composteiras (ZC3 e ZC4), as quais exibiram temperaturas entre 50ºC-75ºC ao longo de 99 dias do processo. Verificamos que a degradação de toda a biomassa foi realizada essencialmente por bactérias, e que a estrutura e composição das comunidades microbianas variam ao longo do processo, com elevada abundância relativa das Ordens Clostridiales, Bacillales e Actinomycetales, assim como observado em outros sistemas de compostagem. Entre os organismos abundantes no processo, identificamos unidades taxonômicas operacionais (OTUs) referentes a organismos não-cultiváveis e/ou com genoma ainda desconhecido. O genoma parcial de uma destas OTUs foi reconstruído, a qual provavelmente pertence a um novo gênero da ordem Bacillales. A dinâmica do processo de compostagem foi evidenciada pela variação do número de OTUs e do índice de diversidade filogenética ao longo do tempo, sendo que o início do processo e a fase após a revira apresentaram a maior diversidade. Os resultados indicam que o processo de revira (aeração da massa de composto) impacta fortemente a estrutura e a composição da microbiota e que a desconstrução da biomassa vegetal ocorre de forma sinérgica e sequencial. A variedade de microrganismos e de funções metabólicas ativas na compostagem termofílica reforça o seu potencial de ser uma promissora fonte de bactérias e enzimas termorresistentes úteis em processos industriais. / Composting harbors considerable microbial richness, comprising populations with distinct physiological requirements and tolerances that succeed one another throughout the aerobic biodegradation of the organic matter, resulting in spontaneous temperature rise up to 80° C. Using metagenomic- and metatranscritomic-based approaches, we investigated the composition and taxonomic diversity as well as metabolic functions of microbial communities of a thermophilic composting operation in the São Paulo Zoo Park. We have analyzed time-series samples from two composting cells (ZC3 and ZC4) which exhibited sustained thermophilic profile (50°C-75°C) over 99 days of the process. We found that all biomass degradation was essentially performed by bacteria. The structure and composition of microbial communities vary throughout the process with a high relative abundance of Clostridiales, Bacillales and Actinomycetales, as observed in other composting systems. Among the organisms abundant in the process, we identify Operational Taxonomic Units (OTUs) of uncultivated organisms or with unknown genomes. The partial genome of one of these OTUs was obtained and shown to belong probably to a new genus of Bacillales. Our time-series data showed that the number of OTUs and phylogenetic diversity index changed during composting revealing the dynamics of the process, with the beginning and the stage after turning procedure presenting the highest diverse microbiota. These results indicate that the turning procedure (compost aeration) strongly impacts the microbiota structure and composition and that the deconstruction of the biomass occurs synergistically and sequentially. The huge diversity of microorganisms and metabolic functions active in thermophilic composting strengthen its potential as a promising source of new bacteria and thermostable enzymes that may be helpful in industrial processes.

Orientador: Fabio Marcio Squina / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T21:44:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Buchli_Fernanda_M.pdf: 4527154 bytes, checksum: 3262f15a20dc87dfa1272cb774a61703 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Biomassa vegetal tem sido reconhecida como uma potencial fonte de açúcares fermentescíveis para a produção de biocombustível, principalmente pelo crescente incentivo do uso de fontes renováveis de combustíveis e sustentabilidade. Atualmente, no Brasil, o etanol é quase exclusivamente produzido pela fermentação da sacarose, um açúcar que pode ser facilmente extraído da cana-de-açúcar, esse etanol produzido a partir da sacarose é chamado de etanol de primeira geração. O processo de extração dos açúcares da biomassa da cana, através da hidrólise enzimática para a produção do chamado etanol de segunda geração, ainda apresenta um baixo rendimento e elevado custo de produção. O objetivo deste trabalho foi à busca por enzimas capazes de promover uma degradação mais eficiente, contribuindo para a viabilidade da produção do bioetanol de segunda geração. Para este estudo foi utilizada uma abordagem de metagenômica e metaproteômica. A análise metagenômica baseou-se em uma amostra de solo de canavial a qual teve seu DNA extraído e sequenciado. Em paralelo utilizou-se este solo para o estabelecimento de dois consórcios microbianos utilizando o bagaço de cana-de-açúcar como única fonte de carbono, estes consórcios também foram sequenciados. As sequências foram anotadas e analisadas na plataforma MG-Rast. Para a abordagem metaproteômica foram utilizadas proteínas extraídas diretamente do solo e o secretoma de ambos os consórcios. A análise do sequenciamento revelou a predominância de bactérias, que representaram 94,86% do metagenoma de solo de canavial, sendo o filo Proteobacteria o grupo mais abundante em todos os metagenomas avaliados. Durante as análises foi possível observar mudanças populacionais entre os metagenomas, a exemplo, as classes Bacteroidia, Alphaproteobacteria e Gammaproteobacteria se mostraram mais abundantes nos metagenomas dos consórcios do que do solo. Analisando as proteínas identificadas nas análises de metaproteômica pertencentes à família das glicosil hidrolases nota-se uma predominância das hemicelulases seguida das celulases entre as enzimas mais abundantes identificadas para as três comunidades analisadas. Dentre as celulases identificadas as mais abundantes foram a GH1, GH3 e GH9, entres as hemicelulases as mais abundantes foram GH2, GH43 e GH51. As análises de metagenômica e metaproteômica sugerem que os consórcios apresentam um enriquecimento das enzimas de interesse e revelam o potencial destas comunidades para prospecção de novas enzimas envolvidas na degradação da biomassa lignocelulósica / Abstract: Plant Biomass has been recognized as a potential source of fermentable sugars for biofuel production, mainly by the growing concern with renewable fuels and sustainability. Ethanol is currently almost exclusively produced by fermentation of sucrose, a sugar that can be easily extracted from sugar cane and thus, this process is called first generation ethanol. The process of extracting the sugars from sugarcane biomass, through enzymatic hydrolysis to produce the so-called second-generation ethanol, still has a low yield and high cost process. The objective of this study was to search for enzymes capable of promoting a more efficient degradation, making possible the production of second generation bioethanol. We used the metagenomic and metaproteomic approaches. The metagenomic analysis was based on a soil sample of sugar cane which had its DNA extracted and sequenced. In parallel the soil was used to establish two microbial consortia using sugarcane bagasse as a sole carbon source, these consortia were also sequenced. The sequences were annotated and analyzed in MG-Rast platform. Proteins extracted directly from soil and the secretome of both consortia were used for metaproteomic approach. The sequencing analysis revealed the predominance of bacteria, representing 94.86 % of the soil metagenome, phylum Proteobacteria is the most abundant group in all metagenomas reviews. During the analysis it was observed population changes between the metagenomes, we notice some groups that seem to be more abundant in consortia¿s metagenomes than in soil. Between these enriched classes of microorganisms we have the Bacteroidia, Alphaproteobacteria and Gammaproteobacteria classes. Among the proteins identified in the metaproteomic 61% of the soil¿s proteins represent glycosyl hydrolases and 25% glycosyl transferases, the consortia presented a similar profile. Analyzing the enzymes belonging to the family of glycoside hydrolases we can notice a predominance of hemicellulases then cellulases among the most abundant enzymes identified for the three communities. Among the most abundant cellulases identified were the GH1, GH3 and GH9, among hemicellulases the most abundant were GH2, GH43 and GH51. The metagenomic and metaproteomic analyzes suggest that consortia have an enrichment of the enzymes of interest and reveal the potential of these communities to search for new enzymes involved in the degradation of lignocellulosic biomass / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Zanoni Dias, Guilherme Pimentel Telles / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-23T01:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peixoto_BrunoMalveira_M.pdf: 1497265 bytes, checksum: 9127980450af9b4a7d8fe679c48f2310 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Metagenômica é o estudo genético de uma amostra ambiental, e permite a análise de organismos incultiváveis em laboratório. É uma área de estudo nova e possui muitos desafios computacionais, com poucas ferramentas dedicadas disponíveis. O objetivo deste trabalho é realizar um estudo metagenômico da diversidade de organismos microbianos de amostras da unidade de compostagem da Fundação Parque Zoológico de São Paulo, analisando e comparando os programas e métodos existentes. O estudo das comunidades microbianas que ali vivem é de grande importância para um melhor entendimento do papel biológico desses organismos. Dados simulados foram testados para validar os métodos utilizados com os dados reais e os resultados mostram que mesmo programas conhecidos são sensíveis aos bancos de dados de referência que utilizam / Abstract: Metagenomics is the genetic study of an environmental sample, and allows the analysis of non-culturable organisms. It is a new area of genetic study and has many computational challenges, with few dedicated tools available. The objective of this work is to realize a metagenomic study of the microbial diversity of samples from the composting unit of Fundação Parque Zoológico de São Paulo, analyzing and comparing existing programs and methods. The study of the microbial communities that live there is of great importance to a better understanding of the biological role of these organisms. Simulated data were tested to validate the methods we used with the real data and the results show that even well-known tools are biased by the reference databases it uses / Mestrado / Ciência da Computação / Mestre em Ciência da Computação

Orientador: Fabio Marcio Squina / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T12:41:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarez_ThabataMaria_D.pdf: 22982311 bytes, checksum: 1bc2a260df2bfab4948ffb299f13a63f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Devido à necessidade do desenvolvimento de fontes de energias renováveis é de grande interesse a descoberta de novas enzimas envolvidas na desconstrução da parede celular vegetal para a produção de bicombustíveis. A metagenômica é uma poderosa ferramenta para a descoberta de novos genes em comunidades microbianas que não são passíveis de cultivo pelas técnicas tradicionais. Neste contexto, o objetivo desta tese foi o desenvolvimento de estratégias metagenômicas para prospecção de novas enzimas atuantes na degradação da biomassa vegetal no metagenoma de solo de canavial bem como a caracterização funcional das mesmas. A biblioteca metagenômica construída com DNA extraído de um consórcio microbiano especializado na degradação de bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor e deslignificado foi empregada nos experimentos de triagem funcional de alto desempenho. Como resultado, foram identificados três clones positivos com atividade celulolítica e dois clones com atividade xilanolítica. A análise dos insertos de cada um dos clones resultou na localização de ORFs cujas sequências de aminoácidos apresentaram identidade com domínios conservados de glicosil hidrolases da família 5 (celulases E-1 e E-2), família 6 (celulase E-3), família 10 (xilanase X-1) e família 16 (glicosil hidrolase X-2). A celulase E-1 apresentou em sua estrutura além do domínio catalítico, E-1 Cat, um domínio de ligação a carboidratos, denominado E-1 CBM, que não apresentou identidade de sequência com domínios conservados conhecidos. A análise funcional do E-1 CBM revelou tratar-se de um CBM específico para cadeias de glucano com grau de polimerização mínimo de cinco unidades de glicose. Ensaios de atividade enzimática em diferentes substratos mostraram que E-1 Cat atuou especificamente na hidrólise das ligações glicosídicas do tipo ß(1,4) entre resíduos de glicose. Os maiores valores de atividade enzimática foram obtidos em pH 7,0 e temperatura de 50ºC. Os parâmetros cinéticos calculados em CMC foram Km igual a 6,05 ± 0,37 mg/mL, Vmax de 42,51 ± 1,2 ?mol/min/mg e eficiência catalítica kcat/Km de 4,06 mL/mg/s. A enzima apresentou termoestabilidade a 40ºC por cinco horas. A atividade enzimática de E-1 Cat em celulose cristalina e bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor resultou na liberação de açúcares solúveis, evidenciando sua potencial aplicação em processos de conversão da biomassa vegetal. Ensaios de atividade em diferentes substratos mostraram que X-1 apresentou maior atividade enzimática em xilana não ramificada, nas condições de pH e temperatura de 6,0 e 45ºC, respectivamente. Os parâmetros cinéticos calculados utilizando como substrato xilana de madeira de faia foram Km de 2,18 ± 0,13 mg/mL, Vmax de 1.435 ± 30,4 ?mol/min/mg e kcat/Km de 496,32 mL/mg/s. Em relação à termoestabilidade, a enzima se manteve estável a 40ºC e 50ºC por seis horas. A hidrólise de substratos complexos com X-1 resultou na liberação de xilooligossacarídeos, xilobiose e xilose, que são compostos que apresentam potencial aplicação nas indústrias alimentícias e de biocombustíveis. Os resultados obtidos neste estudo validaram a abordagem metagenômica desenvolvida para a descoberta de novos genes codificantes para glicosil hidrolases. Além disso, a estratégia descrita nesta tese pode ser estendida para a descoberta de uma miríade de bioprodutos de interesse biotecnológico / Abstract: Due to the necessity of development of renewable sources of energy, it is of great interest the discovery of novel enzymes involved in plant cell wall deconstruction for biofuels production. Metagenomics is a powerful tool for the discovery of novel genes in microbial communities that are not liable to cultivation by traditional techniques. In this context, the aim of this thesis was the development of metagenomic strategies for prospection of novel enzymes involved in plant biomass degradation in sugarcane field soil metagenome and functional characterization of the identified enzymes. The metagenomic library constructed with DNA extracted from a microbial consortium specialized in degradation of steam exploded delignified sugarcane bagasse was used in the experiments of high-performance functional screening. As a result, we identified three positive clones with cellulolytic activity and two clones with xylanolytic activity. The analysis of the inserts from each clone resulted in the location of ORFs whose amino acid sequences showed identity to conserved domains of glycoside hydrolase family 5 (cellulases E-1 and E-2), family 6 (cellulase E-3), family 10 (xylanase X-1) and family 16 (glycoside hydrolase X-2). Cellulase E-1 exhibited in addition to the catalytic domain, E-1 Cat, a carbohydrate binding module, called E-1 CBM, which showed no sequence identity with known conserved domains. Functional analysis of E-1 CBM showed that it is a CBM specific for glucan chains with a degree of polymerization of at least five units of glucose. Assays with a set of different substrates revealed that E-1 Cat hydrolyzed specifically ß(1,4) glycoside bonds between glucose residues. The highest value of enzymatic activity was obtained at pH 7.0 and temperature of 50°C. The kinetic parameters Km, Vmax and catalytic efficiency kcat/Km calculated using CMC were 6.05 ± 0.37 mg/mL, 42.51 ± 1.2 ?mol/min/mg and 4.06 mL/mg/s, respectively. The enzyme showed thermal stability at 40°C for five hours. The enzymatic activity of E-1 Cat in crystalline cellulose and steam exploded sugarcane bagasse resulted in the release of soluble sugars, demonstrating its potential application in processes of biomass conversion. The xylanase X-1 showed higher enzyme activity in debranched xylan, in reactions conducted in pH 6.0 and temperature of 45°C. The kinetic parameters Km, Vmax and catalytic efficiency kcat/Km calculated using beechwood xylan were 2.18 ± 0.13 mg/mL, 1,435 ± 30.4 ?mol/min/mg and 496.32 mL/mg/s, respectively. In relation to thermal stability, the enzyme was stable at 40°C and 50°C for six hours. The hydrolysis of complex substrates resulted in the release of xylo-oligosaccharides, xylobiose and xylose, which are compounds that have potential application in food and biofuels industries. The results of this study validated the metagenomic approach developed for the discovery of novel genes coding for glycoside hydrolases. Moreover, the strategy described in this work can be extended to the discovery of a myriad of byproducts of biotechnological interest / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Eduardo Bagagli / Resumo: O reino fungi é constituído por amplos grupos de organismos com reconhecida importância ecológica, industrial ou médica. O solo é um importante reservatório para microrganismos, especialmente fungos, que atuam na decomposição e reciclagem de nutrientes ou se associam com animais e plantas em relações simbióticas ou causando patogenias. Ainda são poucos os estudos relacionados a estrutura do micobioma, sendo rasa a compreensão da diversidade e ecologia de fungos. A compreensão dos padrões de distribuição da diversidade fúngica é essencial para mensurar as mudanças naturais e antrópicas relacionadas a estas comunidades, tal como entender a ecologia e epidemiologia dos fungos considerados patogênicos. Neste trabalho caracterizamos a diversidade fúngica das amostras de solo em diferentes ambientes no município de Botucatu (Brasil), descrevendo a estrutura da comunidade fúngica e mensurando a prevalência dos fungos patogênicos, mediante a técnica de Sequenciamento de Nova Geração (NGS). No sequenciamento mediante plataforma Illumina, analisamos 44 amostras provenientes de 8 ambientes diferentes, em dois períodos (outono e primavera), incluindo tocas de tatus, corujas e outros ambientes relacionados. A riqueza e diversidade variaram entre os ambientes, sendo favorecido nas amostras ambientais da floresta sazonal semidecidual e das tocas de tatus, os quais possuem uma maior cobertura vegetal. Ainda, ambientes mais antropizados, com menores efeitos de cobertura vegetal, como edifício... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Os produtos naturais microbianos (NP) tem demonstrado ser inestimáveis pontos de partida na descoberta e desenvolvimento de medicamentos aprovados pelo FDA. A abordagem tradicional para a identificação de produtos naturais microbianos exige a cultura em laboratório. Infelizmente, os métodos convencionais baseados nesta metodologia foram desestimulados devido a altas taxas de redescoberta de moléculas. Os métodos independentes de cultura que se baseiam no sequenciamento do metagenoma microbiano sugerem a ocorrência de um enorme reservatório inexplorado de clusters biossintéticos de produtos naturais (BGCs) no meio ambiente. Neste trabalho utilizamos uma metodologia baseada em PCR e barcoding amplicon-sequencing para buscar importantes famílias de produtos naturais como peptídeos não ribossomais (NRP), ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico (AHBA), dímeros de triptofano (TD), policetídeos, aminoglicosídeos e outros. Para isto desenvolvemos um script chamado SecMetPrimer que nos permitiu bioinformaticamente desenhar conjuntos de primers contendo um gradiente de degenerâncias. No total, desenhamos 165 conjuntos de primers. Os amplicons foram obtidos por PCR padrão, tendo sido concatenados barcodes específicos por amostra e sequenciados através de Illumina MiSeq. Para validar, utilizamos eDNA (environmental DNA) de bibliotecas metagenômicas, totalizando 223 milhões de clones. Através das análises bioinformáticas, as curvas de rarefação foram calculadas e a diversidade para cada família foi determinada. Foi realizada uma reamplificação dos domínios de adenilação de peptídeo não ribossomal e domínios de cetosintase de policetídeos utilizando eDNA isolado de 25 amostras diferentes coletadas em Mata Atlântica, Cerrado e ambiente marinho. Nossos dados indicaram a correlação entre distância geográfica e o tipo ecológico dos biomas. Deste modo, foi possível assim atribuir genes relacionados à clusters biossintéticos que codificam importantes produtos naturais à informações taxonômicas e metabólicas. Deste modo identificamos os melhores hotspots para busca de diversidade biossintética dentre as amostras analisadas. / Microbial natural products (NP) have proven to be invaluable starting points in the discovery and development of many drugs approved by FDA. The traditional approach to identify microbial natural products requires the culturing in the laboratory. Unfortunately, conventional culture-based methods have been deemphasized due to high rediscovery rates. Culture-independent methods applying microbial (meta)genome sequencing suggest the occurrence of an enormous untapped reservoir of natural-product-encoding biosynthetic gene clusters (BGCs) in the environment. Here we have used a PCR-based approach and barcoding ampliconsequencing derived from important families of microbial natural products such as nonribosomal peptides (NRP), polyketides (PK), 3-amino-5-hydroxybenzoic acidcontaining NPs (AHBA), tryptophan dimmers (TD), aminoglycosides, phosphonocontaining NPs and others. We have written an internal script called SecMetPrimer that allowed us to bioinformatically design sets of primers containing a range of degeneracy to amplify these genes. At the total, we designed 165 different sets of primers. The amplicons were obtained by standard PCR containing double-barcodedtarget primers and sequenced by Illumina MiSeq platform. The validation process was conducted using eDNA from metagenomic libraries containing a 223 millions of clones. The rarefaction and diversity analyses were assigned, and the best-hit primer for each family was chosen. We have re-amplified the nonribosomal peptide adenylation domains and polyketide ketosynthase domains, using as substrate environmental DNA isolated from 25 different samples collected in Atlantic Forest, Cerrado and marine environment. Our data indicate a correlation between geographic distance and biome-type, and the biosynthetic diversity found in these environments. Thus, by assigning reads to known BGCs against taxonomic and metabolic profiles, we have identified the hotspots of relevant biosynthetic diversity among the analyzed samples.