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Dendritic cells (DCs) are the sentinels of the immune system. They mature at the encounter of the appropriate stimuli or danger signals, which induce them to perform pro-inflammatory antigen presentation to naïve and memory T cells, resulting in inflammation. Remaining in an immature state however, DCs acquire a tolerogenic phenotype. When activated by TLR ligands, DCs undergo metabolic re-programming and switch to TBK1/IKKe/AKT-induced glycolysis at the early activation phase, which is sustained due to nitric oxide (NO)-mediated inhibition of mitochondrial metabolism at the later activation phase. Targeting DC activation in the view of promoting less activated or tolerogenic DCs could be an approach to reduce or abrogate inflammation in settings such as solid organ transplant rejection or in autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE). In this thesis, we present data pertaining to three different approaches for targeting DC activation including 1) the use of ethyl p / Microbiology and Immunology

Die Arbeit beschäftigt sich mit dem Problem der Fettlebererkrankung. In der Einleitung wird auf die aktuelle Relevanz der Gesundheitsstörung und Therapiemöglichkeiten eingegangen, insbesondere durch das, in der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 gebräuchliche Biguanid Metformin. Der Bezug zu molekularbiologischen Signalwegen wird hergestellt und verschiedene in vitro Modellsysteme werden vorgestellt. Anschließend wird auf die Herkunft und genetische Besonderheiten der verwendeten primären Maushepatozyten und Hepatomzellen eingegangen, bevor die angewandten Methoden vorgestellt werden. Zum Einsatz kam in dieser Arbeit vor allem die Lipidmessung mittels Fettrot, um das Ausmaß an Steatosis quantifizierbar zu machen. Im Ergebnisteil folgen zuerst Versuche zur Zytotoxizität der einzelnen Chemikalien und deren Einfluss auf intrazelluläre Energieniveaus, bevor der Einfluss auf die hepatozellulären Fetteinlagerungen im Detail untersucht wird. Unterstützt werden die Ergebnisse durch mikroskopische Bilder der Hepatozyten, welche die beschriebenen Effekte verdeutlichen. Insgesamt konnten folgende Thesen aufgestellt werden: • Zwischen primären Hepatozyten von Wildtyp- und Knockout-Mäusen, bestehen nach 24 stündiger Kultivierung Unterschiede bezüglich des intrazellulären Lipidgehaltes, welche sich nach 72 stündiger Kultivierungszeit nivellieren. • Metformin- und Fructoseinkubation senken den intrazellulären ATP-Gehalt, gleichzeitige Anwesenheit von Metformin und Glucose vermindern den Effekt. • Durch 72-stündige Inkubation der primären Hepatozyten und Behandlung mit Metformin konnte der intrazelluläre Lipidgehalt um circa 40% gesenkt werden. • Durch 72-stündige Inkubation der primären Hepatozyten mit Glucose konnte der intrazelluläre Lipidgehalt um circa 100% gesteigert werden. • Bei humanen Hepatomzellen (HuH7) konnte kein Metformin- und kein Glucoseeffekt beobachtet werden. • Der LXR-Agonist TO901317 wirkt auf den intrazellulären Lipidgehalt Metformin entgegen.

Introduction The adult brain exhibits low regenerative ability. Stem cell-based transplantation approaches have been largely unsuccessful, due to the difficulty to recapitulate the complex cytoarchitecture of the central nervous system (CNS). eNSCs are a new therapeutic option as pharmacological activation and increase of their number in vivo is accompanied by powerful neuroprotection in various disease models. Hes3 is expressed in both proliferating and quiescent NSCs, which makes it a useful biomarker for NSC identification. Direct injections of insulin in the adult brain increase the number of eNSCs and promote rescue of injured neurons via a novel molecular mechanism, the STAT3-Ser/Hes3 Signaling Axis. This molecular pathway with the STAT3-Ser phosphorylation at its core regulates Hes3 and together they form a merging point for several signals including insulin receptor activation. Main aim and Hypothesis Beyond the brain, STAT3-Ser/Hes3 signaling regulates various plastic cell populations in other organs of the endocrine/neuroendocrine system. In the pancreas, Hes3 is expressed in islets cells and regulates their growth, regeneration, and insulin release. Hes3 is also expressed in mouse hypothalamic tanycytes, which are diet responsive cells and play a very crucial role for the communication between the brain and the endocrine system. Also, Hes3 is expressed in the adrenal gland (both in the cortex and medulla); cultured adrenal progenitors express Hes3 and various treatments that induce Hes3 expression promote their growth. Therefore, STAT3-Ser/Hes3 Signaling may be involved in tissue problems that result from metabolic dysfunction. Metabolic syndrome often results in diabetes (Type I, Type II) and insulin resistance, suggesting that eNSCs may be affected by the condition. There is evidence that obesity induces inflammatory reactions in the hypothalamus, leading to NSC loss. However, it is not clear if damage to NSCs is also directly linked to insulin signaling disruption. Results Our results show that various parameters affect Hes3 levels in the brain. Aging decreased Hes3 mRNA expression. Type I diabetes increased Hes3 expression. Type II diabetes decreased Hes3 expression. Thus, we conclude that eNSCs are modulated by diabetes in an age-dependent manner. We also investigated whether common medication for metabolic related dysfunction also affects Hes3 expression in the adult brain. Indeed, our results show that metformin decreases Hes3 expression in the mouse hypothalamus. To address whether metformin has a direct effect on NSCs we treated primary mouse fNSCs with metformin. Metformin decreases cell number, proliferation and affects cell morphology, giving a more differentiated appearance (large, flat cell body with wider projections). Hes3 expression increases significantly at 72 hours of treatment. The metformin result opens the question if the increase in the Hes3 expression is a direct effect of the signal transduction pathways activated by metformin or due to a stress reaction. To address this we treated NSCs with exendin-4, another diabetes drug that we previously showed to both elevate Hes3 expression and cell number using a mouse insulinoma cell line (MIN6). Exendin-4 increases fNSC cell number but it did not affect the morphology. Similar to metformin proliferation was not affected. Hes3 expression increased significantly at 72 hours of treatment as well. This result indicates the distinctive action of the drugs on the STAT3-Ser/Hes3 signaling pathway. Specifically it dissociates Hes3 levels from other cellular parameters. Importantly it shows that two common diabetes medications have very different effects on NSCs. Because Hes3 is strongly regulated by metabolic parameters and medication we addressed potential roles of Hes3 using an established Hes3 null mouse line. Hes3 null mice exhibit no obvious phenotypes under normal conditions. However, we previously showed that when stressed by chemical induced damage, they exhibit low regenerative potential in the pancreas and brain. To identify additional phenotypes, we performed a phenotypic analysis of the Hes3 null mouse line under normal diet and HFD conditions (which induced type II diabetes). We found mild phenotypes that relate to the nervous system, the immune system and metabolism. At the molecular level, Hes3 deletion affects the expression of other genes within the Hes superfamily in the adult mouse brain. However, we did not observe these molecular differences in the HFD condition, suggesting an interplay between metabolic parameters (possibly, circulating insulin) and the regulation of Hes/Hey genes in the brain. Our data suggest a broad range of roles for Hes3, particularly under abnormal conditions. Conclusions Our work establishes that multiple parameters of metabolic state as well as diabetes medication affect Hes3 expression in the brain. Metabolic syndrome is a risk factor for many neurological disorders such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and Multiple Sclerosis. It is important to understand at the molecular and cellular level how metabolic dysfunction affects the brain. Here, we introduced a new cellular biomarker and signaling component that is greatly regulated in metabolic dysfunction.:1 Introduction 18 1.1 The ''plastic brain'': Neural Stem Cells, progenitors and precursors 19 1.2 Functional adult neurogenesis 19 1.3 NSCs in conventional and nonconventional regions of the adult brain 20 1.4 Neurodegenerative diseases, cell replacement and endogenous NSCs 21 1.5 The STAT3-Ser/Hes3 signaling axis in NSCs 24 1.6 Beyond the brain: The STAT3-Ser/Hes3 signaling axis operates in plastic cells 27 1.6.1 STAT3-Ser/Hes3 Signaling Axis in the pancreatic islet 27 1.6.2 STAT3-Ser/Hes3 Signaling Axis in the adrenal cortex and medulla 28 1.6.3 STAT3-Ser/Hes3 Signaling Axis in tanycytes of the hypothalamus? 28 1.6.4 STAT3-Ser/Hes3 Signaling: A new molecular component of the neuroendocrine system? 29 1.7 Metabolic syndrome and neurological disease 31 1.7.1 Metabolic dysfunction and Alzheimer's disease 31 1.7.2 Metabolic dysfunction and Parkinson's disease 31 1.7.3 Metabolic dysfunction and Multiple Sclerosis 32 1.7.4 Metabolism and neurodegenerative disease: Are they connected? 32 1.8 Main Aim – Hypothesis 33 2 Materials and Methods 34 2.1 Animal experiments 34 2.1.1 Animal use authorization 34 2.1.2 Genotyping 34 2.1.3 In vivo models 36 2.1.4 In vivo metabolic Analyses 36 2.1.5 Nociception 37 2.1.6 Histology 38 2.1.7 PCR and Real-Time quantitative PCR (qPCR) 39 2.1.8 Western Blot 41 2.2 Mouse phenotyping 42 2.3 Neural stem cell cultures 43 2.3.1 Preparation – Coatings 43 2.3.2 Cell Isolation and Cell Culture 43 2.3.3 Pharmacological Manipulation (Metformin – Exendin-4) 43 2.4 Heat maps 44 2.5 Statistical analyses 44 3 Results 45 3.1 Hes3 is expressed in the mouse brain 46 3.2 Aging and diabetes models alter Hes3 in the brain 48 3.2.1 Hes3 expression decreases with age 48 3.2.2 Pancreatic islet damage by streptozotocin increases Hes3 expression in the brain 48 3.2.3 High Fat Diet reduces Hes3 expression in the brain 49 3.3 Common diabetes medication affect neural stem cells (NSCs) in the brain 53 3.3.1 Metformin decreases Hes3 expression in the brain 53 3.3.2 Metformin opposes growth but increases Hes3 expression in cultured NSCs 54 3.3.3 Exendin-4 promotes growth and increases Hes3 expression in cultured NSCs 54 3.3.4 Metformin and Exendin-4 affect the STAT3-Ser/Hes3 signaling axis 59 3.4 Hes3 null mice exhibit a quasi-normal phenotype 60 3.4.1 Phenotypic Analysis - Normal Diet (ND) 60 3.4.2 Metabolism Relevant Phenotypes – HFD challenge 63 3.4.3 Phenotypic Analysis – Molecular 67 4 DISCUSSION 70 4.1 Diabetes affects the brain 71 4.2 STAT3-Ser/Hes3: a putative mediator 71 4.3 Hes3 is a special member of the Hes/Hey gene family 72 4.4 Patterns of Hes3 expression may be specific to cell type and microenvironment 72 4.5 Metabolic dysfunction and diabetes medication affect brain Hes3 73 4.5.1 Age regulates Hes3 73 4.5.2 Diabetes models regulate Hes3 expression in the brain 74 4.5.3 Metformin regulates Hes3 expression in the brain 74 4.6 Hes3 phenotyping provides clues to Hes3 functions 76 4.7 Hes3 and metabolic dysfunction: Are they connected? 77 5 Conclusions and Future Remarks 79 References 81

Das Equine Metabolische Syndrom (EMS) beschreibt einen Cluster von metabolischen Störungen, die durch Adipositas, Insulinresistenz und Hufrehe im Zusammenhang stehen. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss einer achtwöchigen oralen Supplementierung von Chrom, Metformin beziehungsweise von einer Kombination aus Chrom und Metformin auf die Insulinsensitivität und die Glukosetoleranz bei adipösen Pferden und Ponys zu untersuchen. Für diese Studie standen 24 Pferde und Ponys (14,4 ± 3,87 Jahre, 14 Stuten und 10 Wallache) mit Adipositas, Insulinresistenz und Hufrehe zur Verfügung. Während der achtwöchigen Versuchsphase bekamen die Tiere eine Heuration (1,5 kg Heu/100 kg Körpermasse (KM)) und zweimal täglich das ihnen zugewiesene Supplement (Chrom: 25 µg/kg KM, Metformin: 15 mg/kg KM, Chrom+Metformin: 25 µg/kg KM Chrom + 15 mg/kg KM Metformin in jeweils 25 g Grünmehl/100 kg KM) verabreicht. Eine vierte Gruppe erhielt als Placebo 25 g Grünmehl/100 kg KM ohne Supplement. Vor Versuchsbeginn und nach Versuchsende durchliefen die Pferde und Ponys, an zwei aufeinanderfolgenden Tagen, nach jeweils einer zwölfstündigen Fastenperiode einen kombinierten Glukose-Insulin-Toleranztest (KGIT) zur Bestimmung der Insulinsensitivität und einen oralen Glukose-Toleranz-Test (OGTT) zur Bestimmung der Glukoseabsorption und -toleranz. Im Verlauf des Versuchszeitraums konnte bei den Pferden ein durchschnittlicher Gewichtsverlust von 2,77 ± 2,99 % verzeichnet werden (Behandlung p > 0,05). Beim OGTT zeigte sich keine signifikante Veränderung der Glukose- und Insulinreaktionen zwischen Versuchsbeginn und Versuchsende. Die Seruminsulinmaximalwerte der mit Metformin und der mit Chrom+Metformin supplementierten Gruppen waren nach der Versuchszeit numerisch gesunken (Metformin Versuchsbeginn: 452 ± 642 µU/ml, Versuchsende: 202 ± 121 µU/ml; Chrom+Metformin Versuchsbeginn: 388 ± 347 µU/ml, Versuchsende: 342 ± 164 µU/ml, Behandlung p > 0,05). Im KGIT zeigten sich bei den Glukosewerten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen und zwischen den Werten vor Versuchsbeginn und nach Versuchsende. Die Seruminsulinkonzentrationen lagen im KGIT vor Versuchsbeginn bei allen Probanden zum Zeitpunkt Minute 45 über 100 µU/ml. Somit gelten alle Versuchsteilnehmer per definitionem als insulinresistent. Nach den acht Wochen Supplementierung befanden sich beim KGIT zum Zeitpunkt Minute 45, mit Ausnahme eines Probanden aus der Chrom+Metformin-Gruppe, alle Seruminsulinwerte weiterhin >100 µU/ml. Somit sind die übrigen 23 Pferde und Ponys weiterhin als insulinresistent einzustufen. Weder Chrom, noch Metformin oder die Kombination von Chrom+Metformin konnte in den hier im Versuch angewandten Dosierungen die Insulinsensitivität und Glukosetoleranz der erkrankten Pferde und Ponys verbessern.

Metformineinnahme scheint reproduktive und metabolische Funktionen bei Frauen mit PCOS zu verbessern. Die zwiespältige aktuelle Studienlage kann bisher keine konkrete Aussage liefern, ob Metformin eine erfolgreiche therapeutische Möglichkeit des Syndroms darstellt. Ziel der vorliegenden randomisierten, placebo-kontrollierten Studie war es, die Auswirkung des antihyperglykämischen Medikaments Metformin in Kombination mit Ernährungsberatung und Sport auf übergewichtige Frauen mit PCOS zu ermitteln. Besondere Aufmerksamkeit galt der Wirkung des Medikaments hinsichtlich Insulin und Glukose-Stoffwechsel, endokrinologischen und biochemischen Parametern, sowie dem Menstruationszyklus. 46 adipöse Frauen mit PCOS im Alter von 22 bis 39 Jahren und mit einem mittleren BMI von 38,1 nahmen an der Studie teil. Die verabreichte Dosis von Metformin betrug 1,5 g (3x500 mg) täglich über einen Zeitraum von 16 Wochen. Gemessen wurden Veränderungen von FSH, LH, Oestradiol, Testosteron, DHEA-S, SHBG, Cholesterol, Triglyzeriden, Insulin, Glukose, HbA1c, Leptin und IGF-I im Serum. Monatlich wurde eine Ernährungsberatung angeboten. Jede Teilnehmerin erhielt darüber hinaus individuelle dietätische Beratung. Signifikante Gewichtsreduktion (P / Use of metformin seems to improve reproductive and metabolic abnormalities in women with PCOS. However, the disparity of results in clinical studies cannot give us a conclusive answer if metformin is a new line therapy of the syndrome. The present randomised, placebo-controlled study was designed to compare the antihyperglycemic drug metformin vs. placebo combined with lifestyle modification in the treatment of polycystic ovary syndrome in obese women. Special attention was paid to the effects of this medication on insulin and glucose metabolism, endocrine and biochemical parameters, and menstrual function. Forty six obese women with PCOS, aged between 22-39 years and mean BMI 38.1 were randomized to receive either metformin (500 mg three times a day for 16 weeks) or placebo. The metformin and placebo groups were matched for age, endocrinological and metabolic parameters. Changes in FSH, LH, estradiol, testosterone, DHEA-S and SHBG, total cholesterol, triglycerides, insulin, glucose, HbA1c, leptin and IGF-I were assessed. Group therapy with aspects in nutrition and physical activity was conducted monthly. Each woman received individual counselling by a dietician. Significant (P