O produto comercial CI Disperse Blue 291 (CI DB291) é amplamente utilizado pela industria têxtil. Estudos mostram que corantes dinitrofenilazo são genotóxicos no ensaio de Ames/Salmonella, mas há poucos estudos sobre seus efeitos em células eucariontes. Este trabalho teve como objetivo investigar a genotoxicidade e citotoxicidade do corante DB291 em células humanas em cultura, bem como vias pelas quais o corante atua levando aos efeitos tóxicos. O corante comercial foi purificado por HPLC-DAD e utilizado para incubação com células HepG2 (5-100 µM por 3-72 h). A citotoxicidade foi avaliada pelos ensaios de XTT, corante cristal violeta, lactato desidrogenase extracelular e consumo de glicose. A geração de ROS intracelular foi verificada pela emissão de fluorescência da 2\',7\'-diclorofluoresceína. Análises de ciclo celular, fragmentação do DNA, potencial de membrana mitocondrial (Ψ) e cálcio intracelular foram realizadas por citometria de fluxo. A produção de ATP foi mensurada por quimiluminescência. Níveis de 8-oxodG e 5-mdC foram avaliados por HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-UV, respectivamente. A expressão da enzima DNMT1 foi avaliada por western blot. Um produto de biotransformação foi identificado e caracterizado estruturalmente por MS/MS e 1H-RMN. A exposição ao corante DB291 diminuiu significativamente a sobrevivência das células em um modo tempo- e dose-dependente (IC50 = 74 µM), com a concomitante formação de um produto de biotransformação reduzido. A morte celular ocorreu sem lise da membrana plasmática. Nas células expostas, foi observado aumento da atividade enzimática mitocondrial, acompanhado por um aumento da taxa de consumo de glicose. Índices elevados de ATP, Ψ e cálcio foram verificados após a incubação das células com concentrações crescentes do corante. Alterações mitocondriais e o processo de biotransformação impeliram a aumento na produção de ROS intracelular, 8-oxodG e fragmentação do DNA. O dano ao DNA induziu a parada no ciclo celular e super-expressão de DNMT1, seguido por hipometilação global do DNA no ciclo celular subsequente. Os resultados obtidos apontam pela primeira vez para a toxicidade do corante DB291 via biotransformação, com alterações mitocondriais e indução de estresse oxidativo. / The commercial CI Disperse Blue 291 (CI DB291) is widely used by textile industry. It is mutagenic in the Ames/S. typhimurium assay, but there are few studies showing its effects in eukaryotic cells. We evaluated here the toxicity of CI DB291 in the human HepG2 cell line. The commercial dye was purified by HPLC-DAD and used for incubation with HepG2 cells (5-100 µM for 3-72 h). Cytotoxicity was assessed by the XTT, crystal violet dye, extracellular lactate dehydrogenase and glucose consumption assays. ROS formation was assessed by 2\',7\'-dichlorofluorescein fluorescence. Analyses of cell cycle, DNA fragmentation, mitochondrial membrane potential (Ψ) and intracellular calcium were analyzed by flow cytometry. ATP level was measured by chemiluminescence. Levels of 8-oxodG and 5-mdC were evaluated by HPLCESI-MS/MS and HPLC-UV, respectively. DNMT1 expression was assessed by western blot. A biotransformation product was identified and structurally characterized by MS/MS and 1H-NMR. DB291 significantly decreased cell survival in a time- and dose-dependent manner (IC50 = 74 µM), with concomitant formation of a reduced biotransformation product. Plasma membrane lysis did not occur. Increased mitochondrial enzymatic activity, accompanied by increase in glucose consumption rate, was observed in cells incubated with DB291. Elevated ATP, Ψ, and intracellular calcium was verified after cell incubation with increasing dye concentrations. Mitochondrial changes and the biotransformation process accounted for the observed raise in intracellular ROS, 8-oxodG, and DNA fragmentation. DNA damage induced cell cycle arrest and DNMT1 overexpression, followed by DNA hypomethylation in the subsequent cell cycle. Results point for the first time to toxicity of the dye through biotransformation, mitochondrial changes, and oxidative stress.

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Introdução: Mecanismos epigenéticos, como a metilação de DNA, desempenham um papel importante na neurobiologia da depressão. Enquanto o estresse aumenta a metilação de DNA e reduz a expressão de genes envolvidos na plasticidade neuronial, inibidores de DNA metiltransferases (DNMTi), enzimas que catalisam a metilação de DNA, aumentam rapidamente a expressão gênica e induzem efeitos tipo-antidepressivos em modelos animais. Considerando, ainda, que antidepressivos convencionais podem interferir com mecanismos epigenéticos, este trabalho testou a hipótese de que drogas DNMTi induzem efeito tipo-antidepressivo agudo e sustentado em modelos animais. Além disso, avaliamos se o efeito de antidepressivos convencionais e de DNMTis sobre os níveis de mRNA e de metilação de DNA em diferentes genes associados a depressão e regulados por mecanismos epigenéticos (BDNF, TrkB, 5-HT1A, NMDA e AMPA) em estruturas encefálicas (hipocampo dorsal, ventral e córtex pré-frontal) de animais submetidos a modelo animal de depressão. Métodos: Para tanto, ratos Wistar foram submetidos ao modelo do desamparo aprenddo [learned helplessness, LH, pré-teste (PT), 40 choques inescapáveis nas patas]. Os animais receberam injeções sistêmicas de DNMTi (5-AzaD ou RG108), antidepressivos (imipramina ou fluoxetina), ou veículo, por 1 ou 7 dias, e foram submetidos a sessão teste do desamparo aprendido (T, 30 choques escapáveis) no último dia. Adicionalmente, um grupo independente foi submetido ao mesmo protocolo experimental e sacrificados 1 h após a última injeção. As estruturas encefálicas foram dissecadas para posterior análise molecular [imunoprecipitação de DNA metilado (meDIP) e quantificação de RNAm por qRT-PCR). Resultados: O estresse dos choques nas patas aumentou o número de falhas no teste. O tratamento com DNMTi agudamente, assim como com antidepressivos (tratamento repetido), foi capaz de atenuar essas alterações comportamentais, efeito considerado tipo-antidepressivo nesse modelo. Ainda, o estresse aumentou a metilação de DNA e reduziu os níveis de RNAm para BDNF e TrkB, enquanto que o tratamento com RG108 atenuou essas alterações moleculares no córtex pré-frontal de ratos. Conclusão: Os presentes resultados indicam que DNMTi, diferente de antidepressivos convencionais, são capazes de induzir rápido e sustentado efeito tipo-antidepressivo. Além disso, BDNF e TrkB parecem ser importantes para a resposta comportamental induzida pela inibição de DNMTs no córtex pré-frontal de ratos submetidos ao LH. / Introduction: Epigenetic mechanisms, such as DNA methylation, are thought to play an important role in the neurobiology of depression. While stress increases DNA methylation and decreases the expression of genes involved in neuronal plasticity, DNA methyltransferases inhibitors (DNMTi) increases gene expression and induces antidepressant-like effects in animal models. Considering that conventional antidepressants could interfere with epigenetic mechanisms, this work tested the hypothesis that acute treatment with DNMTi would induce acute and long-lasting antidepressant-like effects. Furthermore, we evaluated whether the stress could induce changes in the mRNA and DNA methylation levels in different genes involved with depression and regulated by epigenetic mechanisms (BDNF, TrkB, 5-HT1A, NMDA and AMPA) in different brain structures [dorsal hippocampus, ventral hippocampus and prefrontal cortex (PFC)] and whether such changes would be attenuated by systemic treatment with DNMTi (acutely) and antidepressants (chronically). Methods: Male Wistar rats were submitted to the learned helplessness model (LH; pretest session, 40 inescapable foot shocks). The animals received systemic injection the DNMTi (5-AzaD or RG108), antidepressants (imipramine or fluoxetine) or vehicle for one or seven days and were submitted to the LH test (30 escapable foot shocks) in the last day. Additionally, one independent group were submitted to the same experimental protocol and sacrificed one hour after last injection for collection of brain samples to further molecular analyses (methylated DNA immunopreciptation and mRNA levels by qRT-PCR). Results: Exposure to inescapable footshocks increased the number of escape failures in the test. Treatment with DNMTi (acute), as well as with antidepressants (repeated treatment), attenuated stress-induced behavioral responses, an antidepressant-like effect in this model. Moroever, stress increased DNA methylation and decreased RNAm levels of BDNF and TrkB, while treatment with RG108 attenuated molecular changes induced by stress in rat PFC. Conclusion: The present results indicate that DNMTi, different from conventional antidepressants, are able to induce rapid and sustained antidepressant-like effects. In addition, BDNF and TrkB appear to be important for behavioral response induced by inhibition of DNMTs in the rat PFC submitted to the LH.

A suplementação com ácido fólico (AF) apresenta efeitos quimiopreventivos, porém, pode aumentar o risco de desenvolvimento e acelerar a progressão do câncer se ocorrer em doses elevadas ou após a ocorrência de lesões pré-neoplásicas (LPN). O AF é essencial na síntese de novo de purinas e timidalato e consequentemente na síntese, replicação e reparo do DNA, proliferação celular e apoptose. Assim, a deficiência pode implicar em danos ao DNA e erros na sua replicação e reparo, processos importantes na carcinogênese, onde as células apresentam taxas de replicação e divisão aceleradas, e é possível que a suplementação module estes processos. Além disso, como AF ocupa uma posição de destaque no metabolismo dos grupamentos metila pode exercer efeitos sobre a hipometilação global do DNA e o aumento da expressão de proto-oncogenes como o c-myc, fenômenos característicos da hepatocarcinogênese. Assim, objetivando-se avaliar os efeitos do AF na promoção da hepatocarcinogênese em ratos Wistar, desenvolveu-se o modelo do \"Hepatócito Resistente\" e administrou-se por entubação gástrica diariamente, durante 5 semanas, o AF (0,16; 0,32; ou 0,64 mg / 100 g de peso / dia) ou água (0,25 mL / 100 g de peso / dia). Então, avaliou-se as LPN hepáticas presentes visíveis à macroscopia e microscopia (GST-P), a proliferação celular (BrdU) e a apoptose (microscopia de fluorescência) no tecido hepático ao redor das LPN e nas LPN persistentes e em remodelação, a intensidade de danos ao DNA (\"Cometa\" alcalino), e o padrão de metilação global (Dot Blot) e a expressão do c-myc (RT-PCR) especificamente em LPN microdissecadas. Apesar de não ter alterado a incidência e multiplicidade das LPN, o tratamento com AF 0,32 mg / 100 g promoveu um aumento na porcentagem de lesões &#8805; 1 mm e o com AF 0,64 mg / 100 g a diminuição na porcentagem dessa lesões com relação ao grupo água (p<0,05). De modo semelhante, observou-se na análise das LPN GST-P positivas que o AF 0,32 mg / 100 g promoveu aumento e o AF 0,64 mg / 100 g inibiu o processo carcinogênico, embora não se tenha observado diferenças significantes no número, área e porcentagem da área do corte ocupada pelas LPN. Apesar de não ter modulado significativamente o desenvolvimento das LPN, o AF nas doses de 0,32 e 0,64 mg / 100 g inibiu a proliferação celular nas LPN persistentes (p<0,05). A contagem dos corpúsculos apoptóticos permitiu constatar uma possível inibição da apoptose nas LPN persistentes e em remodelação com caráter dose-dependente (p>0,05). De acordo com a análise do comprimento dos cometas, houve um aumento dos danos ao DNA no modelo de hepatocarcinogênese e ausência de efeito do AF nesse processo (p>0,05). O padrão de metilação global do DNA e a expressão do c-myc nas LPN microdissecadas não foram significativamente alterados pelo tratamento com diferentes doses de AF, embora, em geral, se tenha observado uma tendência dos tratamentos com AF promoverem hipometilação e aumento da expressão de c-myc. Os resultados obtidos, em conjunto, auxiliaram na caracterização das ações paradoxais (inibitórias e promotoras) que o AF apresenta na etapa de promoção da carcinogênese, de forma que a dose e o estágio do desenvolvimento neoplásico em que se inicia a suplementação demonstraram ser críticos e, por isso, indicam necessidade de cautela acerca da fortificação com o AF, uma das maiores intervenções de saúde pública que expôs a população a elevadas concentrações de AF sintético. / Folic acid (FA) supplementation shows chemopreventive effects, however, it may increase the risk of development and accelerate cancer progression in case of high doses or after preneoplastic lesions (PNL) are established. FA is essential on de novo synthesis of purine and thymidalate and, consequently, on DNA synthesis, replication and repair, cell proliferation and apoptosis. Thus, its deficiency may cause DNA damage and replication and repair mistakes, important processes on carcinogenesis, where cells present high replication rates and accelerated division, and is possible that supplementation modulates these processes. Besides, as FA has a central role on methyl group metabolism, it may have effects on hepatocarcinogenesis peculiar events such as DNA global hypomethylation and on the increased expression of proto-oncogenes like c-myc. Objecting the evaluation of FA effects during hepatocarcinogenesis promotion in Wistar rats, the \"Resistant Hepatocyte\" model was developed and water (0.25 mL / 100 g BW / day) or FA (0.16; 0.32; or 0.64 mg / 100 g BW / day) were supplemented daily by gavage for 5 weeks. Then, hepatic PNL detected by macroscopy and microscopy (GST-P), cell proliferation (BrdU) and apoptosis (fluorescence microscopy) on surrounding tissue, persistent and remodeling PNL, DNA damage (alcaline Comet assay), DNA global methylation pattern (Dot Blot) and c-myc expression (RT-PCR) specifically in microdissected PNL were evaluated. Even though FA treatment was not able to change incidence and multiplicity of PNL, the treatment with 0.32 mg / 100 g of FA increased the percentage of lesions &#8805; 1 mm whereas with 0.64 mg / 100 g of FA diminished the percentage of these lesions, compaired to the water group (p<0.05). Similarly, it could be observed in PNL positive GST-P analysis that FA 0.32 mg / 100 g enhanced and FA 0.64 mg / 100 g inhibited the carcinogenic process, although it was not possible to detect significant differences on number, size and area of liver section occupied by GST-P positive PNL. Despite the fact that PNL development was not significantly modulated by FA, FA 0.32 and 0.64 mg / 100 g dosages inhibited cell proliferation on persistent PNL (p<0.05). The apoptotic body count allowed to identify a possible dosage-dependent apoptosis inhibition on persistent and remodeling PNL (p>0.05). According to the analysis of comet length, the hepatocarcinogenesis model increased DNA damage but FA showed lack of effect on this process (p>0.05). DNA global methylation pattern and c-myc expression in microdissected PNL were not significantly altered by treatment with different dosages of FA, although a trend towards promotion of hypomethylation and increase on c-myc expression was observed. Altogether, the obtained results helped to characterize the paradoxical action (both inhibitory and promoting) that FA has on carcinogenesis promotion step, in such a way that the dosage and the stage of neoplastic development in which supplementation begins seems to be critical, highlighting the necessity of caution with FA fortification, one of the biggest public health interventions taken that exposes the population to high concentrations of synthetic FA.

O principal objetivo deste trabalho é o de estabelecer uma estratégia confiável relacionada a genotoxicidade, proteção genômica e recombinação mitótica em Aspergillus nidulans. A genotoxicidade foi induzida por vapor de benzeno e, para testar a proteção genômica, a soja foi usada devido às suas propriedades anticarcinogênicas muito conhecidas. O principal resultado obtido foi que a soja transgênica mostrou maiores propriedades antigenotóxicas do que a soja tradicional. Isto foi duplamente confirmado, tanto através de estratégias de genética clássica, como molecular. Além disso, cada experimento foi repetido três vezes. Principais conclusões foram as seguintes: a) estabelecimento de um protocolo adequado para atender às complexidades dos eventos epigenéticos e, b) a aplicação desse tal protocolo e experimentos afins para testar outros agentes ambientais suspeitos de apresentarem propriedades antigenotóxicas, ou que precisem de sua identificação como tal. Evidentemente, levando-se em conta a grande preocupação relacionada aos alimentos transgênicos e aos muitos produtos de biotecnologia, que entram no mercado, o elenco de prováveis candidatos aos tipos de testes apresentados, será muito grande. Como os resultados obtidos sugerem íntima relação entre metilação de DNA eucariótico, a recombinação mitótica e outros eventos danosos às células, os eventos envolvidos serão epigeneticamente discutidos. / Main aim is to provide a reliable approach to deal with the aspects related to induced genotoxicity, genomic protection and eukaryotic mitotic recombination in Aspergillus nidulans. Genotoxicity was benzene fumes induced, and to test genomic protection soybean has been used on account of its putative anticarcinogenic properties. Main outcome is that transgenic soybean bears higher antigenotoxic properties than traditional soybean. This has been twofold confirmed through basic genetic approaches and molecular approaches, as well. In addition, each experimental approach has been three times repeated. Additional important outcomes are: a- establishment of a reliable protocol to deal with the complexities of the epigenetic events, and b- likely use of present protocol and experimental set-up to test other environmental agents of which antigenotoxic properties are either suspected, or need precise identification. Evidently, on account of present wide concern the transgenic foodstuffs, and many other biotechnological products, as well, are obvious candidates for similar approaches. Obtained results suggest close relationships among eukaryotic DNA methylation, mitotic recombination, and other cells damaging events reputedly leading to carcinogenesis.

Orientador: Adriane Pinto Wasko / Coorientador: Claudia Aparecida Rainho / Resumo: Em contraste ao padrão de cromossomos sexuais de mamíferos (XX/XY), as aves apresentam um sistema de determinação sexual em que os machos representam o sexo homogamético (ZZ) e as fêmeas constituem o sexo heterogamético (ZW). Adicionalmente, embora mamíferos apresentem um mecanismo de compensação de dose, a inativação completa de um dos cromossomos Z não é observada em machos de aves e, portanto, estes possuem um maior nível de expressão de vários genes presentes nesse cromossomo. A despeito disso, um mecanismo ainda não completamente esclarecido de compensação de dose parcial em aves resulta em expressão equivalente entre os sexos para alguns genes do cromossomo Z. A região MHM (Male Hypermethylated), localizada no cromossomo Z de Galliformes, está associada a um padrão de hipermetilação em machos e hipometilação em fêmeas, levando à síntese de um RNA não-codificante longo (lncRNA) somente em fêmeas. A presença deste lncRNA é associada ao aumento da expressão de genes próximos à região MHM em fêmeas, o que parece resultar em uma compensação de dose local entre os sexos. Dado que, até o momento, segmentos MHM foram somente identificados em Galiformes e Anseriformes, o presente estudo visou isolar e caracterizar esta região em Galliformes (galinha doméstica, codorna européia, peru) e também em Struthioniformes (avestruz), Strigiformes (coruja-orelhuda, corujinha-do-mato, coruja-da-igreja, coruja-buraqueira), Piciformes (tucanuçu), Psittaciformes (arara-azul-grande) e Apodiform... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-04T14:53:59Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1981370 bytes, checksum: 073d461bd0c895a458664955c646a988 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T14:53:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1981370 bytes, checksum: 073d461bd0c895a458664955c646a988 (MD5) Previous issue date: 2016-03-18 / Epigenetic is the study of inherited and reversible changes in functional genome that do not alter the sequence of nucleotide bases. Modulate gene expression mainly by interference of external factors, such as smoking. MicroRNAs are a family of small post transcriptional regulatory RNAs genes which expression can also be controlled by DNA methylation.The aim of this study was to investigate the influence of smoking on the methylation and hydroxymethylation status of global DNA and specific sites of miR-9-3 and miR-137 genes in the healthy oral mucosa. Samples of oral epithelial cells were collected using mouthwash from a population of 95 individuals who were divided into three groups according to smoking status: never (n=30), current (n=29) and former smokers (n=36). Genomic DNA was extracted, and global DNA methylation and hydroxymethylation was performed using an ELISA-based technique; DNA methylation at specific sites of miR-9-3 and miR-137 was performed using methylation-specific PCR. Higher levels of global DNA methylation were found in current smokers with over 15 years of consumption, but no differences were found in relation to global DNA hydroxymethylation. Global DNA methylation was higher than the hydroxymethylation level but they were not correlated in the oral mucosa. For specific sites, the miR-137 promoter had partially methylated DNA in all groups and miR-9-3 hypomethylation was detected in current smokers in comparison to never and former smokers. There were no differences in epigenetic marks analyzed in relation to gender and age. We concluded that smoking habits were capable of inducing changes in global DNA methylation and miR-9-3 promoter methylation status. / Epigenética é o estudo das mudanças herdadas e reversíveis no genoma funcional que não alteram a sequência de bases nucleotídicas. Modulam a expressão gênica principalmente por interferência de fatores externos, como o tabagismo. Os microRNAs constituem uma família de pequenos RNAs reguladores pós transcripcionais da expressão gênica também controlados pela metilação do DNA. O objetivo deste estudo foi investigar a influência do fumo sobre o perfil de metilação e hidroximetilação global do DNA, e o perfil de metilação em sítios específicos dos genes miR-9-3 e miR-137 na mucosa bucal de indivíduos sem alterações clínicas visíveis. Para tanto, amostras de células bucais foram obtidas por bochecho de 95 indivíduos, os quais foram divididos em três grupos de acordo com o hábito de fumar: não fumantes (n=30), fumantes (n=29) e ex-fumantes (n=36). O DNA genômico foi extraído e a análise da metilação e hidroximetilação global foi realizada pelo teste ELISA e a metilação nos sítios específicos dos genes pela técnica de PCR específica para metilação. As análises estatísticas foram realizadas pelo software BioEstat 5.0 ao nível de significância de 5%. Os dados mostraram que indivíduos fumantes por um período superior a 15 anos apresentaram maior nível de metilação global que não fumantes e ex-fumantes. Não foram detectadas diferenças em relação ao nível de hidroximetilação global entre os grupos. O nível de metilação global apresentou-se maior quando comparado ao nível de hidroximetilação global, porém esses níveis não estão correlacionados na mucosa oral. Em relação aos sítios específicos, o gene miR-137 apresentou-se parcialmente metilado em todos os grupos, e o miR-9-3 mostrou uma tendência a hipometilação no grupo de indivíduos fumantes em comparação aos não fumantes e ex-fumantes. Não foram observadas diferenças nas marcas epignéticas analisadas em relação a gênero e idade. Conclui-se que o hábito de fumar pode modificar o perfil de metilação global do DNA e no promotor do gene miR-9-3.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-05T14:37:36Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 798401 bytes, checksum: 41671bb8b384bd28413ef4c5851e99ce (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-05T14:37:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 798401 bytes, checksum: 41671bb8b384bd28413ef4c5851e99ce (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / It is well established that solar UV radiation can cause mutations in DNA and increase the risk of developing skin cancer. However, little is known about the ability of UV radiation to cause epigenetic changes in the skin. DNA methylation, characterised by the addition of a methyl group in cytosines within CpG dinucleotides, can modify gene transcription, leading to decreased expression or even silencing of a gene. Epigenetic changes could represent an important pathway by which environmental factors influence aging and disease risks, with a tissue-specific manner. Epithelial keratins are called cytokeratins, the main function of cytokeratins is to maintain the integrity and mechanical stability through cell-cell contacts with epithelial tissue. The aim of this study was to investigate the sun exposure influence on DNA methylation status in the cytokeratin 14 (KRT14) and 19 (KRT19) genes of skin cells of subjects whithout history of skin disease. Skin biopsies were obtained by punch of sun-exposed (outer forearm) and sun-protected areas (inner arm) from 30 corpses of the Brazilian Services of Death Investigation. The KRT14 gene DNA methylation analysis was performed using Methylation-Specific PCR (MSP), and the KRT19 gene DNA methylation analysis was performed using Methylation-Sensitive Restriction Enzymes (MSRE) of sun-exposed and sun-protected skin areas. Statistical analysis showed no significant differences between sun-protected and sun-exposed areas and the most frequently methylated condition for CpG studied for KRT14 and KRT19 genes (p> 0.05; McNemar). We conclude that sun exposure does not induce changes in DNA methylation status in the KRT14 and KRT19 genes. / Pesquisas tem mostrado que a radiação UV do sol pode causar mutações no DNA e aumentar o risco para o desenvolvimento de câncer de pele. Entretanto, ainda pouco se sabe sobre a capacidade da radiação UV em causar alterações epigenéticas na pele. A metilação do DNA é caracterizada pela adição do grupo metil em uma citosina precedida por uma guanina (dinucleotídeo CpG), o que pode alterar a transcrição gênica, diminuindo a expressão ou silenciando um gene. Alterações epigenéticas podem representar um importante caminho de como os fatores ambientais influenciam no envelhecimento e no desenvolvimento de certas doenças de maneira tecido específica. Queratinas epiteliais são chamadas de citoqueratinas, e sua principal função é manter a integridade e estabilidade mecânica do tecido epitelial. Neste trabalho investigamos se há influência da exposição solar sobre o perfil de metilação de DNA nos genes das citoqueratinas 14 (KRT14) e (KRT19), em células da pele de indivíduos sem histórico de doenças de pele. Biopsias de pele foram obtidas através de um Punch circular da de área exposta e não exposta ao sol de 30 cadáveres do Serviço de Verificação de Óbito. A análise de metilação do gene KRT14 foi realizada pelo método de PCR Específica para Metilação (MSP), e para o gene KRT19 foi realizado o método de Restrição Enzimática Sensível à Metilação (MSRE) das áreas expostas e protegidas do sol. A análise estatística mostrou que não há diferenças significativas entre as regiões exposta e não exposta ao sol, sendo a condição metilada a mais frequente tanto para o gene KRT14 quanto para o gene KRT19 (p>0,05; McNemar). Assim, concluímos que não há influência da exposição solar no perfil de metilação de DNA nos genes KRT14 e KRT19.

Submitted by Mariângela Bueno Cordeiro Maldonado null (maribuenocordeiro@hotmail.com) on 2017-09-01T02:02:20Z No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO 2017 - Mariangela Maldonado .pdf: 1446039 bytes, checksum: 2e08a41374d1ed14783e9142f58bdec8 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-09-01T13:59:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 maldonado_mbc_dr_araca.pdf: 1446039 bytes, checksum: 2e08a41374d1ed14783e9142f58bdec8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T13:59:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 maldonado_mbc_dr_araca.pdf: 1446039 bytes, checksum: 2e08a41374d1ed14783e9142f58bdec8 (MD5) Previous issue date: 2017-08-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo desse estudo foi identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) potencialmente sujeitos a controle epigenético exercido por metilação do DNA via seus envolvimentos na criação, remoção ou deslocamento de sítios CpG (meSNPs) e a partir de tal identificação criar um banco de dados para meSNPs, bem como determinar a possível associação desses marcadores com ilhas CpG (CGIs) e com o perfil metilacional de tecidos submetidos ao ensaio de recuperação de ilhas CpG metiladas combinado com plataformas de sequenciamento de nova geração (MIRA-seq) em bovinos. Usando as variantes anotadas para os SNPs identificados no Run5 do projeto 1000 Bull Genomes e a sequência genômica bovina de referência UMD3.1.1, identificamos e anotamos 12.836.763 meSNPs de acordo com o padrão de variação criado por cada SNP em um sítio CpG. Também analisamos a distribuição genômica desses meSNPs, sendo a maioria deles localizados em regiões intergênicas (68,00%) e intrônicas (26,32%). Globalmente, os meSNPs representam 22,53% dos 56.969.697 SNPs descritos na base de dados e 12,35% deles estão localizados em CGIs. Comparando o número observado com o número esperado de meSNPs nas CGIs e nos tecidos submetidos ao MIRA-seq, verificamos um enriquecimento médio (P<0,01) para meSNPs de 2,47 vezes em CGIs relaxadas e 1,90 vezes em CGIs rigorosas. Nos tecidos, o enriquecimento foi de 1,52 vezes em longissimus dorsi e 2,09 vezes em intestino delgado. Dez meSNPs com metilação diferencial, sendo 1 em longissimus dorsi e 9 em intestino delgado, causaram uma alteração na sequência genômica, a qual está associada ao fenótipo de eficiência alimentar em bovinos. / The aim of this study was to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) potentially subject to epigenetic control exerted by DNA methylation via their involvement in creating, removing or displacement CpG sites (meSNPs) and from this identification create a database for meSNPs, as well as to determine its possible association with CpG islands (CGIs) and the methylation profile of tissues submitted to the methylated-CpG island recovery assay combined with next generation sequencing platforms (MIRA-seq) in cattle. Using the variant annotations for SNPs identified in Run5 of the 1000 bull genomes project and the UMD3.1.1 bovine reference genome sequence assembly, we identified and classified 12,836,763 meSNPs according to the pattern of variation caused at the CpG site. We have also analyzed the genomic distribution of the meSNPs, with the majority being located in intergenic regions (68.00%) and then in introns (26.32%) and the remainder distributed among proximal promoters (3.93%), coding regions (1.27%), untranslated regions (UTRs) (0.29%), non-coding RNAs (0.11%) and splice regions (0.08%). Overall, meSNPs represent 22.53% of 56,969,697 SNPs described in the database of which 12.35% are located in CGIs. Comparing the observed number with the expected number of meSNPs in the CGIs and tissues submitted to the MIRAseq we found a mean enrichment (P<0.01) for meSNPs of 2.47 times in the relaxed CGIs and 1.90 times in the strict CGIs. In the tissues the enrichment was of 1.52 times in ribeye and 2.09 times in small intestine. Ten meSNPs, differing in methylation status, 1 in ribeye and 9 in small intestine, caused an alteration in the genomic sequence which is associated with a feed efficiency phenotype in cattle. / FAPESP: 2015/20557-5 / FAPESP: 2016/07584-6

Estudos recentes têm revelado que uma fração significativa do transcriptoma de eucariotos é composta por RNAs não codificadores longos (lncRNAs). Este trabalho investigou o padrão de expressão de um conjunto de lncRNAs originados a partir de regiões intrônicas de genes codificadores de proteínas em três linhagens celulares tumorais humanas utilizando microarranjos de DNA customizados. Realizamos uma série de análises in silico com a perspectiva de identificar propriedades globais desses transcritos, tais como a abundância relativa em diferentes tecidos, características evolutivas, estruturais e regulatórias, além de possíveis funções celulares. Avaliamos também a contribuição da metilação do DNA, um mecanismo de silenciamento epigenético da expressão de genes codificadores de proteínas, na regulação da expressão de lncRNAs intrônicos. Observamos que uma fração dos lncRNAs intrônicos detectados nas linhagens estudadas são conservados evolutivamente, tem padrão de expressão tecido específico, e está enriquecida em elementos regulatórios na sua extremidade 5\'. Foram identificados subconjuntos de lncRNAs intrônicos possivelmente atuando sobre genes associados a vias regulatórias importantes para o controle do desenvolvimento de organismos e ciclo celular. Comparativamente a mRNAs, uma menor proporção de lncRNAs intrônicos possui ilhas CpGs (CGIs) na vizinhança de seu início de transcrição. Apesar disso, observamos que um subconjunto desses transcritos teve sua expressão sensível ao tratamento com o agente desmetilante de DNA 5-AZA, demonstrando que lncRNAs intrônicos transcritos podem estar sujeitos a regulação transcricional mediada por metilação do DNA. Dentre os lncRNAs intrônicos regulados por metilação do DNA, destaca-se o lncRNA AS-APP, cuja expressão aumentou em 25 a 80 vezes nas linhagens celulares DU-145 e HEK293, respectivamente, após tratamento com 5-AZA. Este lncRNA possui uma CGI metilada e um promotor ativo a cerca de 4 kb de distância do seu início de transcrição conhecido. O aumento da transcrição do lncRNA AS-APP após desmetilação do DNA correlacionou-se a uma diminuição significativa dos níveis de expressão do mRNA do gene APP. Este resultado sugere uma possível ação regulatória em cis do lncRNA AS-APP no locus APP, um importante gene envolvido na doença de Alzheimer e com expressão associada ao prognóstico de alguns tipos de câncer. Os resultados obtidos neste trabalho reforçam a ideia de que lncRNAs intrônicos constituem unidades transcricionais independentes que se encontram sobre controle regulatório nos diferentes tipos celulares. Foi gerado também um catálogo de lncRNAs intrônicos regulados por metilação que permitirá a seleção de candidatos com maior potencial de relevância funcional para caracterização detalhada. / Recent studies have revealed that a significant fraction of the eukaryotic transcriptome is composed of long noncoding RNAs (lncRNAs). This work investigated the expression pattern in three human tumor cell lines of a set of lncRNAs originated from intronic regions of protein coding RNAs, using custom DNA oligoarrays. In silico analyses were performed to identify global properties of these transcripts such as relative abundance in different human tissues, regulatory, evolutionary and structural aspects, as well as their possible cellular functions. In addition, we evaluated the contribution of DNA methylation, an important epigenetic mechanism that control the expression of protein coding genes, in the regulation of intronic lncRNAs expression. We found that a fraction of the intronic lncRNAs detected in the cell lines are evolutionarily conserved, show a tissue specific expression pattern, and is enriched in regulatory elements at their 5\' end region. Subsets of intronic lncRNAs possibly acting on genes associated to important regulatory pathways controlling organism development and cell cycle were identified. A smaller proportion of intronic lncRNAs relative to mRNAs displayed CpG islands (CGI) in the vicinity of the transcription start site. Notwithstanding, we observed that a subset of these transcripts responded to treatment with the DNA demethylation agent 5-AZA, demonstrating that intronic lncRNAs may be under transcriptional regulation mediated by DNA methylation. Among intronic lncRNAs regulated by DNA demethylation, stands out AS-APP lncRNA, which was up regulated 25 to 80 times in DU-145 and HEK293 cell lines following 5-AZA treatment, respectively,. This lncRNAs has a methylated CGI and an active promoter at 4-kb upstream from its known transcription start site. Increased AS-APP lncRNA transcription following DNA demethylation correlated with a significant decrease of APP gene messenger RNA levels. This finding suggests a possible cis-regulatory action of the lncRNA AS-APP in the APP locus, an important gene involved in Alzheimer disease and whose expression is associated with prognosis of different cancer types. The results obtained in this study reinforce the idea that intronic lncRNAs constitute independent transcriptional units under regulatory control in the different cell types. It was generated a catalog of intronic lncRNAs regulated by DNA methylation that will allow the selection of candidates with higher potential of functional relevance for detailed characterization