Submitted by Biblioteca de Pós-Graduação em Geoquímica BGQ (bgq@ndc.uff.br) on 2018-02-06T14:17:14Z No. of bitstreams: 1 Tese Christiane Monte 2017.pdf: 1803168 bytes, checksum: fcf5354cecebc3cc273db52007aaab5e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-06T14:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Christiane Monte 2017.pdf: 1803168 bytes, checksum: fcf5354cecebc3cc273db52007aaab5e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Universidade Federal Fluminense. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Geoquímica, Niterói, RJ / RESUMO A ressuspensão sedimentos pode alterar a biodisponibilidade dos contaminantes metálicos, podendo colocar em risco a biota. Esta hipótese foi testada em duas Baías – Guanabara e Sepetiba, no Rio de Janeiro, sendo a Guanabara dividida em cinco áreas. Em ambas as Baías há contaminação por metais-traço, na Guanabara um dos principais problemas é a contaminação dos sedimentos por Hg, enquanto na de Sepetiba é por Cd e Zn, ambas a Baías recebem efluentes domésticos e industriais. Assim, o objetivo geral deste estudo foi avaliar os efeitos da ressuspensão de sedimentos na região do Saco do Engenho (Baía de Sepetiba) e os estuários dos rios Meriti e Iguaçu, os Portos do Rio e de Niterói e a APA de Guapimirim (Baía de Guanabara) e o possível aumento da biodisponibilidade de metais-traço (Cd, Cu,Fe, Hg, MeHg, Mn, Ni, Pb e Zn). Em Sepetiba foram coletadas 12 amostras próximas ao Saco do Engenho, e foram submetidas a dois intervalos de tempo de ressuspensão (1h e 24h). Grandes concentrações de Zn e Cd foram encontradas na região, com o resultado da extração sequencial HCl 1 mol L-1 e após o método US EPA 3051 foi aplicado o índice de mudança na biodisponibilidade (BCI) que mostrou-se ser uma boa ferramenta no monitoramento do risco de sedimentos contaminados por metais associados à atividade de dragagem. Na Baía de Guanabara foram cinco pontos, um para cada área com três réplicas e foram submetidas a seis intervalos de ressuspensão ( 30min, 1h, 3h, 6h,12h e 24h). O Hg e o MeHg foram determinados em duas áreas da Baía (Meriti e Porto do Rio) e apesar das concentrações serem maiores no Meriti, o percentual de metilação foi quatro vezes maior no Porto Rio em relação ao Meriti, sendo a matéria orgânica e a granulometria, os reguladores da dinâmica do Hg. No estuário do Rio Iguaçu, foi aplicado o mesmo tipo de extração sequencial aplicado em Sepetiba e com apenas dois intervalos de ressuspensão (1h e 24h), e os resultados mostraram variação no gradiente estuarino e aumento na biodisponibilidade dos contaminantes metálicos após a ressuspensão. Foram realizados bioensaios terrestres com os sedimentos das cinco áreas da Baía de Guanabara com oligoquetas terrestres da espécie Eiseinia andrei , os bioensaios mostraram que os metais regulam a mortalidade das oligoquetas para quatro áreas, e há a influência da sazonalidade na mortalidade das oligoquetas, assim como a influência da espacialização dentro da Baía. Entretanto, na área menos contaminada houve a menor concentração letal 50% (CL50), que provavelmente foi provocada por outro fator, assim como houve o engordamento dos animais após a exposição, que pode estar relacionado à salinidade da região o outro fator desconhecido. Em Sepetiba, os resultados evidenciam que a ressuspensão afeta a biodisponibilidade de diferentes metais, principalmente no primeiro intervalo de tempo (1 hora), refletindo mudanças abruptas em função da exposição a condições oxidantes. Na Guanabara, houve uma oscilação entre os intervalos, entretanto para o MeHg no Porto do Rio houve metilação a partir do intervalo de 3h. / The resuspension of sediments can change the bioavailability of mettalic contaminants, could increase risk to biota. This hypothesis was tested in two bays- Gananbara and Sepetiba, in Rio de Janeiro, being the Guanabara divided into five areas. In both Bays there is contamination by trace metals, in the Guanabara, one of the main is the contamination of sediments by Hg, while Sepetiba, it’s for Cd and Zn, both bays receives domestics and industrial sewage. Therefore, the general aims of this study was evaluate the effects of resuspension of sediments in Saco do Engenho area (Sepetiba Bay) e and estuaries of Meriti and Iguaçu river, the ports of Rio and Niterói and Protect Area of Guapimirim ( Guanabara Bay) and the possible increase of bioavailability of trace metals(Cd, Cu,Fe, Hg, MeHg, Mn, Ni, Pb e Zn).In Sepetiba were collected 12 samples near to Saco do Engenho, and were submitted to 2 time intervals of resuspension (1h and 24h). Higher concentrations of Zn and Cd were found in the area, with result of sequential extraction HCl 1 mol L-1 and after US EPA 3051 method was applied the bioavailability change index (BCI), which showed to be a good tool to monitoring of risk of contaminated sediments by metals associated to dredging activity. In the Gaunabara Bay were five points, one for each areawith 3 replicated e and were submitted to six time intervals of resuspension( 30min, 1h, 3h, 6h,12h e 24h). The Hg and MeHg were analyzes in two areas of Bay (Meriti and Porto do Rio), and although of concentrations were higher in Meriti, the percentage of methylation was four times higher in port of Rio than Meriti, being, the organic matter and grain size the regulators of Hg dynamics. In the estuary of Iguaçu River, was applied the same type of extraction sequence applied in Sepetiba and with only two time intervals of resuspension(1h e 24h), and the results showed variation in estuarine gradient and increase bioavailabilityof mettalic contaminats after resuspension. Were performed terrestrial bioassays with sediments of five areas of Guanabara Bay with earthworms Eiseinia andrei, the bioassays showed which metals regulates the earthworms mortality for 4 areas, and there is the influence of seasonal in mortality, as influence of specialization into Bay. However, in the area the less contaminated area there was the lowest lethal concentration 50% (LC 50), probably was caused another factor, as there was fattening of animal after exposition, can be associated to salinity of region or unknown another factor. In Sepetiba, the results evidenced the resupension affected the bioavailability of different metals, mainly in the first interval (1 hour), reflecting abrupt changes due to exposure to oxidizing conditions. In the Guanabara, there was one oscillation between time intervals, however for MeHg in port of Rio there was methylation from 3 hours time interval.

Alterações no padrão normal de metilação do DNA têm sido caracterizadas como um importante mecanismo na gênese de neoplasias. Esta modificação do DNA é denominada de epigenética uma vez que altera o padrão de expressão das células sem alterar a seqüência do DNA. No câncer, as alterações epigenéticas observadas consistem na hipermetilação das ilhas CpG nos promotores dos genes acompanhada de uma hipometilação global dos dinucleotídeos CpG dispersos pelo genoma. Este evento mostra geralmente ser câncer-específico, ou seja, alguns genes que são metilados em um tipo de câncer, não o são na maioria dos outros tipos. O objetivo deste projeto foi identificar, através da construção de bibliotecas subtrativas de RaSH, genes silenciados por metilação nas linhagens de câncer de cabeça e pescoço FaDu, UM-SCC-14A, UM-SCC-17A e UM-SCC-38 e que possuem expressão induzida após o tratamento com o agente demetilante 5-aza-2-deoxicitidina. Uma vez que a metilação leva a diminuição gradual da expressão gênica, o método RT-PCR semi-quantitativo foi utilizado para validação da expressão diferencial dos genes candidatos PLAU, CD82, RBBP4, AOF2, TMSB10, HSPA5 e LAMC2 nas linhagens não tratadas e tratadas com o agente demetilante 5-aza-2-deoxicitidina. Para todos os genes candidatos foi observado aumento na expressão gênica após o tratamento em pelo menos uma das quatro linhagens. Na linhagem UM-SCC-14 A, os genes CD82, RBBP4, AOF2, HSPA5 e LAMC2 mostraram aumento na expressão após o tratamento com o agente demetilante, sendo que o gene LAMC2 também mostrou esse aumento de expressão na linhagem UM-SCC-17A. Na linhagem UM-SCC-38A todos os genes mostraram aumento de expressão após o tratamento. Embora novos estudos sobre a metilação da região promotora dos genes selecionados sejam necessários, aumentam as evidências de que os genes selecionados sejam regulados pelo mecanismo de metilação e que estejam metilados nas linhagens estudadas. / Abnormalities on the normal pattern of DNA methylation have been caracterized as an important mechanism on carcinogenesis. This modification is called epigenetic and can be defined as a heritable change in gene expression that is not accompanied by changes in DNA sequence. The epigenetic alterations observed on cancer include hypermethylation of selected CpG island gene promoters and simultaneous global hypomethylation. The aim of this project was to identify, by rapid subtraction hybridization, genes silenced by methylation on head and neck cancer lineages with alterations on gene expression after the treatment with 5-aza-2-deoxycytidine. The cancer lineages we used for our experiments were: FaDu, UM-SCC-14A, UM-SCC-17A e UM-SCC-387A and seven genes (PLAU, CD82, RBBP4, AOF2, TMSB10, HSPA5 and LAMC2) were analysed by semiquantitative RT-PCR and for all of them an increaseament of gene expression was observed. For the UM-SCC-14A lineage, the genes CD82, RBBP4, AOF2, HSPA5 and LAMC2 were upregulated after the treatment with demethylating agent as well as LAMC2 was uperegulated on UM-SCC-17A. For the UM-SCC-38A lineage all the genes showed increased expression after the treatmente with -aza-2-deoxycytidine. Our work is another evidence that some genes may be regulated by methylation during carcinogenesis.

Os tumores odontogênicos são um grupo heterogéneo de lesões formadas a partir de tecidos que dão origem ao dente. A metilação do ADN, uma adição covalente de um grupo metilo na posição 5 de carbono de um nucleótideo de citosina, é considerado um importante regulador da expressão génica. A adição do radical metil é catalisada por ADN metiltransferases (DNMTs). Embora alguns estudos epigenéticos tenham sido realizados em tumores odontogênicos, um estudo com os três tipos de DNMTs em vários membros desse grupo está em falta. Este estudo analisa a expressão de DNMTs em tumores odontogênicos. Amostras de vinte ameloblastomas, dez Calcificante tumores odontogênicos císticos, dez calcificados tumores epiteliais, dez tumor odontogênico adenomatóide, dez tumores odontogênicos queratocísticos, quatro fibromas ameloblásticos, dois fibro-odontoma ameloblástico, quatro fibroma centrais odontogênicos, sete tecidos de fibromas odontogênicos periféricos e dez mixomas odontogênicos foram incluídos. DNMT1, 3A e 3B foram expressas no núcleo e / ou citoplasma de todos os tumores odontogênicos. A alta expressão de DNMTs em células de tumor odontogênico sugere metilação como um mecanismo importante para este grupo de tumores. / Odontogenic tumours are a heterogeneous group of lesions formed from tissues that give rise to the tooth. DNA methylation, a covalent addition of a methyl group to the 5-carbon position of a cytosine nucleotide, is considered an important regulator of gene expression. The addition of the methyl radical is catalyzed by DNA methyltransferases (DNMTs). Although some epigenetic studies have been conducted in odontogenic tumours, a study with the three types of DNMTs in several different members of this group is missing. This study analyzes the expression of DNMTs in odontogenic tumours. Formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples of twenty ameloblastomas, ten calcifying cystic odontogenic tumors, ten calcifying epithelial tumors, ten adenomatoid odontogenic tumors, ten keratocystic odontogenic tumors, five ameloblastic fibromas, two ameloblastic fibro-odontoma, four central odontogenic fibroma, seven peripheral odontogenic fibroma and ten odontogenic mixoma were included. DNMT1, 3A and 3B were expressed in the nucleus and/or cytoplasm of all odontogenic tumours. The high expression of DNMTs in odontogenic tumour cells suggests methylation as an important mechanism for this group of tumours.

A produção in vitro de embriões expõe o concepto a condições diferentes do ambiente intra-tubárico-uterino. A alta tensão de oxigênio durante o cultivo in vitro induz estresse oxidativo mediante aumento dos níveis das espécies reativas de oxigênio. A condição de estresse oxidativo altera a expressão de RNAm e miRNAs, podendo comprometer vias de interação materno-embrionária. Recentemente, os exossomos têm sido descritos como um mecanismo complementar de transporte de RNAm e miRNAs, que beneficiam a comunicação bidirecional materno-embrionária. Portanto, além do estudo dos próprios embriões, a análise dos exossomos isolados do meio de cultivo da PIVE também é relevante. Comumente são utilizados dois modelos de cultivo na PIVE, a alta tensão (20%) e a baixa tensão (5%) de oxigênio. A hipótese deste estudo é que a alta tensão de oxigênio no cultivo embrionário gera uma condição de estresse oxidativo que causa alterações de expressão de RNAm e miRNAs presentes nos embriões e nos exossomos. Além disso, o estresse oxidativo exerceria efeito sobre o padrão de secreção destes exossomos. Para testar essa hipótese este estudo produziu embriões bovinos in vitro cultivados em diferentes tensões de oxigênio. Os embriões foram coletados no dia 7 e os meios de cultivo, para isolamento os exossomos, foram coletados nos dias 3 e 7 do cultivo. Os blastocistos cultivados em alta tensão de oxigênio apresentaram um aumentou dos níveis de EROs através de análise de fluorescência. Este resultado validou o modelo de estresse oxidativo para embriões. Os resultados iniciais indicaram que apesar do miR-199a-5p, descrito como possível regulador dos genes alvos ERBB2 e ERBB3, ter apresentado maior expressão nos embriões cultivados em alta tensão, os transcritos ERBB2 e ERBB3 e a proteína ERBB2 não apresentaram diferença significativa entre os grupos. Uma vez que não se estabeleceu uma relação de regulação entre o miR-199a-5p e o gene alvo ERBB2 para os embriões bovinos, este estudo se voltou para a análise de outros 96 RNAm e 378 miRNAs, destes 40 RNAm e 8 miRNAs apresentaram alterações significativas entre os embriões cultivados em alta e baixa tensão de oxigênio. Entre as principais funções alteradas estão associadas à resposta ao estresse oxidativo, proliferação e diferenciação celular, remodelação epigenética, apoptose, metabolismo e reconhecimento materno-fetal. Por fim, com o objetivo de compreender um panorama maior dos efeitos do estresse oxidativo, este estudo se propôs a analisar o padrão de expressão e os miRNAs do conteúdo dos exossomos do meio de cultivo. O estresse oxidativo alterou tanto a concentração dos exossomos quanto a expressão dos mRNAs, em ambos os dias do desenvolvimento embrionário (D3 e D7). Dentre os miRNAs, destaca-se o miR-210 que foi considerado por este trabalho como biomarcador não invasivo da condição de normoxia no cultivo in vitro de embriões bovinos. Em conclusão, esse estudo não elucidou como o estresse oxidativo altera a interação materno-embrionária em embriões produzidos in vitro em diferentes condições de tensão de oxigênio, mas gerou conhecimentos adicionais sobre do desenvolvimento embrionário bovino e os efeitos da alta tensão de oxigênio. / The in vitro embryo production exposes the concept to conditions different from the intra-tubal-uterine environment. The high oxygen tension during in vitro production induces the oxidative stress by increasing the concentration of reactive oxygen species. The oxidative stress condition changes the mRNA and miRNAs expression, it can compromise pathways of maternal-embryonic interaction. Recently, the exosomes have been described as a complementary mechanism of mRNA and miRNAs transport, which improve the bidirectional maternal-embryonic communication. Therefore, the studies of the embryos and exosomes isolated from the IVP culture medium are relevant. Two cultivation models are usually used in IVP, the high tension (20%) and the low tension (5%) of oxygen. The hypothesis of this study is that the high oxygen tension in the embryonic culture generates an oxidative stress condition that causes changes in the mRNA and miRNAs expression. In addition, this oxidative stress is able to modulate the secretion pattern of the exosomes isolated from IVP embryos. To test this hypothesis, this study produced in vitro bovine embryos developed at different oxygen tensions. The embryos were sampled on day 7 and the culture media, for exosomes isolation, were collected on days 3 and 7 of the embryo development. Blastocysts cultured in high oxygen tension showed increased levels of ROS through fluorescence analysis. This result validated the oxidative stress model for embryos. In order to understand the effect of oxidative stress on the pathways of maternal-embryonic interaction, this study aimed to analyze the ERBB signaling pathway. Despite the fact that miR-199a-5p, described as a possible regulator of the ERBB2 and ERBB3 target genes, showed higher expression in embryos cultured under high tension, the ERBB2 and ERBB3 transcripts and the ERBB2 protein showed no significant difference between high and low oxygen tension groups. Since a regulatory relationship between miR-199a-5p and the ERBB2 target gene was not established for bovine embryos, this study turned to the analysis of other 96 mRNAs and 378 miRNAs, out of 40 mRNAs and 8 miRNAs showed significant changes among the groups. The main altered functions are the response to oxidative stress, cell proliferation and differentiation, epigenetic remodeling, apoptosis, metabolism and maternal-fetal recognition. Finally, in order to understand the bigger picture of oxidative stress effect we analyze the secretion pattern and the miRNA content of the exosomes from culture medium of IVP embryos. Oxidative stress change both, the exosome concentration and the miRNA expression (at D3 and D7). Among the miRNAs, we highlight the miR-210 that was considered by this work as a non-invasive biomarker of the normoxia condition in the in vitro culture of bovine embryos. In conclusion, this study did not elucidate how oxidative stress changes the maternal-embryonic interaction in IVP embryos, but it generated additional knowledge about bovine embryonic development and the high oxygen tension effects.

A hipermatilação aberrante de regiões gênicas promotoras foi recentemente sugerida como meio de detecção do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. Neste estudo nós avaliamos o status de metilação de um painel de 7 genes já relatados na literatura e sua correlação com lesões orais malignas e cancerizáveis de boca. Inicialmente, nós utilizamos amostras de enxágues salivares de pacientes com lesões benignas, displásicas e malignas para determinar a hipermetilação em regiões gênicas promotoras em pacientes de alto risco. Uma avaliação clínica de risco foi realizada e correlacionada com o diagnóstico histológico e status dos biomarcadores. A partir dos resultados analisados nas lesões intraorais, o gene DCC, que obteve a melhor performance entre os 7 genes, foi testado em lesões de queilite actínica e carcinoma epidermoide de lábio. Foram realizadas reações de PCR específica para metilação, quantitativa (Q-MSP) para os 7 genes (CCNA1, MGMT, MINT31, TIMP3, P16, DAPK, DCC) em enxágues salivares de 191 pacientes com lesões intraorais, e do gene DCC em 39 lesões de lábio. Análises de regressão logística e curva ROC foram utilizadas para avaliar a associação do status de metilação com o diagnóstico histológico e para estimar a acurácia da classificação respectivamente, nas amostras de enxágue salivar. Na análise multivariada, o diagnóstico displasia/ câncer foi associado com a idade (OR=1.3, 95% CI= (1.01-1.6, p=0.014) e a metilação do painel de 7 genes (OR=2.2, 95% CI=(1.34.0), p=0.006); a metilação do DCC também foi fortemente associada (OR=3.3, 95% CI=(1.7-6.6), p=0.004). Na análise multivariada, o diagnóstico histológico foi independentemente associado com a metilação do painel de 7 genes (OR=2.0, 95% CI=(1.1-3.6), p=0.027) ou do DCC (OR=2.8, 95% CI=(1.4-5.7), p=0.004). Uma nova análise, excluindo pacientes com diagnóstico prévio de câncer (n=30), e levando em conta uma classificação clínica de risco, foi realizada. Na análise univariada, DCC (OR=2.6, 95% CI=(1.1-6.1), p=0.026) e a classificação clínica de risco (OR=2.5, 95% CI=(1.3-5.1), p=0.008) foram associados com o diagnóstico de displasia/ câncer, e permaneceram significante na análise multivariada (DCC: OR=2.5, 95% CI= (1.1- 6.0), p=0.037, classificação de risco: OR=2.5, 95% CI=(1.2-5.0), p=0.012). A classificação clínica de risco identificou displasia/ câncer com a sensibilidade de (95% CI=4171%) e especificidade de 66% (95% CI= 5775%). A sensibilidade da classificação clínica de risco combinada com a metilação do painel de 7 genes melhorou, chegando a 71% (95% CI=5683%) e com a metilação do DCC chegou a 69% (95% CI=5481%). O status de metilação do painel de 7 genes, como também o DCC como um marcador individual, foi independentemente associado com o diagnóstico histológico em enxágues salivares. Nas lesões labiais não foi possível observar a mesma correlação entre o status de metilação do gene DCC e o diagnóstico histológico, provavelmente, devido a diferente etiologia das lesões intraorais e labiais. Os resultados mostram a potencial habilidade destes biomarcadores em prever o risco de presença de lesões intraorais cancerizáveis, usando uma abordagem não invasiva, além do potencial de melhorar a eficiência da classificação clínica de risco. Mas reforça a diferente etiologia das lesões intraorais e labiais e a necessidade de diferentes marcadores para essas lesões. / Aberrant promoter hypermethylation has been recently proposed as a means for detection of HNSCC in salivary rinses. Here we evaluate the ability of a previously reported 7-gene methylation panel status to correlate with premalignant and malignant oral lesions. We used a large prospective cohort of salivary rinses obtained from patients with benign, dysplastic, and cancer diagnoses to determine promoter hypermethylation in high-risk patients. Clinical risk assessment was performed and correlated with histological diagnosis and biomarker status. Also, a cohort of lip lesions was selected and methylation status of DCC gene was correlated with histology. Quantitative methylation-specific PCR (Q-MSP) was performed analyzing methylation status of 7 genes (CCNA1, MGMT, MINT31, TIMP3, P16, DAPK, DCC) in salivary rinses of 191 patients with oral lesion and 39 lip lesions. Logistic regression and receiver operating characteristic (ROC) analyses were used to examine the association of methylation status with histologic diagnosis and to estimate classification accuracy, respectively. On univariate analysis, diagnosis of dysplasia/cancer was associated with age (OR=1.3, 95% CI= (1.01-1.6, p=0.014) and 7-gene panel methylation (OR=2.2, 95% CI=(1.34.0), p=0.006); DCC methylation was also strongly associated (OR=3.3, 95% CI=(1.7-6.6), p=0.004). On multivariable modeling, histologic diagnosis was independently associated with 7 gene panel (OR=2.0, 95% CI=(1.1-3.6), p=0.027) or DCC (OR=2.8, 95% CI=(1.4- 5.7), p=0.004) methylation. A subset analyzed (n=161) without prior biopsy proven malignancy received clinical risk classification based on lesion examination. On univariate analysis, DCC (OR=2.6, 95% CI=(1.1-6.1), p=0.026) and clinical risk classification (OR=2.5, 95% CI=(1.3-5.1), p=0.008) were associated with diagnosis of dysplasia/cancer, and remained significant on multivariate analysis (DCC: OR=2.5, 95% CI= (1.1-6.0), p=0.037, risk classification: OR=2.5, 95% CI=(1.2-5.0), p=0.012). Clinical risk classification identified dysplasia/cancer with a sensitivity of 56% (95% CI=4171%) and specificity of 66% (95% CI= 5775%). The sensitivity of clinical risk classification combined with 7-gene panel methylation improved to 71% (95% CI=56 83%) and with DCC methylation improved to 69% (95% CI=5481%). The 7-gene panel methylation, as well DCC as a single marker, was independently associated with histologic diagnosis in salivary rinses. No correlation was found between DCC methylation status and histologic diagnosis of lip lesions, probably due different etiology of oral and lip lesions. The results show the potential ability of these biomarkers to predict risk for presence of oral premalignancy and malignancy using a non-invasive approach using salivary rinse and can improve the efficiency of clinical risk classification. Also, reinforces the different etiologic origins of intraoral and lip lesions and the need of different markers for these lesions.

Modificações epigenéticas tais como metilação do DNA, constituem um mecanismo especial de regulação da expressão gênica envolvido em muitas situações patológicas. Padrões alterados de metilação do DNA são comuns em cânceres e infecções virais. A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção fúngica sistêmica, causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. O Brasil é detentor do maior número de casos na América do Sul. A doença apresenta envolvimento pulmonar primário com disseminação para mucosa oral, pele, sistema retículo-endotelial e glândulas suprarrenais. As lesões orais são caracterizadas por hiperplasia eritematosa finamente granular, salpicadas com hemorragias pontuais chamadas de estomatite moriforme. A finalidade deste estudo foi identificar perfis diferenciais de metilação do DNA em pacientes com e sem lesão oral na PCM. A identificação destes perfis foi baseada na estratégia de MS-AP-PCR (Amplificação arbitrária sensível a metilação). O DNA, extraído do sangue total de pacientes com e sem lesão oral, foi digerido com as enzimas de restrição Hpa II e Msp I. Os produtos da digestão foram amplificados pela técnica de PCR, utilizando iniciadores arbitrários. Foi obtido um perfil diferencial de metilação após a amplificação do DNA de pacientes sem lesão de boca, comparado ao perfil de pacientes com lesão de boca. A banda diferencialmente expressa foi purificada, clonada e os plasmídeos obtidos P5, P6 e P7 foram analisados pelo software PhredPhrap e na ferramenta BLASTN para a obtenção de dados de mapeamento e identidade com as sequências presentes no genoma humano. O fragmento clonado no plasmídeo P5 apresentou similaridade com uma sequência de DNA presente no cromossomo 20, próxima ao gene YTHDF1. Os fragmentos clonados nos plasmídeos P6 e P7 apresentaram similaridade com sequências de DNA presentes no cromossomo 15, sendo que o fragmento P6 apresentou similaridade com uma sequência intrônica do gene RNA binding protein with multiple splicing 2” (RBPMS2) e o fragmento P7 com uma sequência intrônica do gene “diphthamine biosynthesis 6” (DPH6)”. A expressão do gene YTHDF1 em leucócitos foi testada por PCR em tempo real e não houve diferença significativa nos dois grupos de pacientes. Ainda não há descrição na literatura da correlação do gene YTHDF1 com a PCM tornando este estudo inédito e mostrando a importância da análise epigenética para conhecimento dos mecanismos celulares nas condições normais e também patológicas. / Epigenetic changes such as DNA methylation is a specific mechanism for the regulation of gene expression involved in many pathological situations. Altered patterns of DNA methylation are common in cancers and viral infections. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic fungal infection caused by a thermo-dimorphic fungus, Paracoccidioides brasiliensis. Brazil is having the largest number of cases in South America. The disease presents primary pulmonary involvement that spreads to oral mucus, skin, reticuloendothelial system, and adrenals. Oral lesions are characterized by erythematous fine granular hyperplasia, and speckled with occasional bleeding called moriform stomatitis. The purpose of this study was to identify profiles of different DNA methylation in patients with and without oral lesions in PCM. The identification of these profiles was based on the strategy of MS-AP-PCR (Methylation-Sensitive arbitrarily Primed PCR). The DNA extracted from whole blood of patients with and without oral lesions was digested with restriction enzymes: Hpa II and Msp I. The digestion products were amplified by PCR (polymerase chain reaction) using arbitrary primers. We obtained a differing profile after amplifying the DNA from patients without mouth lesions compared to the profile of patients with mouth lesions from agarose gel electrophoresis. The differently expressed band was purified and cloned, and the obtained plasmids, P5, P6 and P7, were analyzed by the softwares PhredPhrap and BLASTN tool to obtain mapping data and identify the sequences present in the human genome. The cloned fragment in the plasmid P5 showed similarity with a DNA sequence present in chromosome 20, next to the gene YTHDF1. The fragments cloned in plasmids P6 and P7 showed similarity with the DNA sequences present on chromosome 15, the P6 fragment showed similarity with an intronic sequence from the gene, “RNA binding protein with multiple splicing 2 "(RBPMS2), and the P7 fragment showed similarity with the intronic sequence of the gene "diphthamine biosynthesis 6" (DPH6) ".biosynthesis 6" (DPH6)". The YTHDF1 gene expression in leukocytes was tested by real-time PCR and no significant difference were found in both groups of patients. There is no description in the literature relating the YTHDF1 gene with PCM which has shown the importance of study epigenetic for understanding the cellular mechanisms under normal and pathological conditions.

A dengue é uma infecção viral sistêmica, autolimitada, transmitida para os humanos através da picada de mosquitos fêmeas infectadas do gênero Aedes sp. Trata-se de uma doença com grandes impactos na economia e na saúde pública, e estima-se que entre 50 a 100 milhões novas infecções ocorram anualmente em mais de 100 países. A dengue é causada pelo Dengue virus (DENV), um vírus pertencente à família Flaviviridae, com genoma composto de uma única molécula de RNA, fita simples com polaridade positiva. A infecção pelo DENV pode ser assintomática ou apresentar diferentes manifestações clínicas, como febre do dengue (FD), febre hemorrágica do dengue (FHD) e Síndrome do Choque do dengue (SCD). Dados da literatura indicam que algumas infecções virais podem causar alterações epigenéticas em seus hospedeiros, principalmente a metilação do DNA. Assim, o propósito deste trabalho foi investigar a influência da infecção pelo DENV no perfil global de metilação dos pacientes, através da técnica de MethELISA, e analisar o padrão de metilação no promotor dos genes fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interferon gama (IFN-γ). Os resultados obtidos indicam uma tendência na diminuição do percentual relativo de metilação após a infecção pelo DENV, sugerindo uma influência da infecção viral nos mecanismos epigenéticos do hospedeiro. Observou-se também uma maior taxa de desmetilação do promotor do TNF-α dos pacientes infectados em relação ao grupo controle. Em relação ao IFN-γ, não foi observada diferença no padrão de metilação do gene entre os dois grupos analisados. A meta-análise de microarranjos de DNA obtidos de pacientes infectados pelo DENV indica um aumento na expressão dos genes da Timina DNA Glicosilase (TDG) e das DNA Metiltransferases 1 e 3 (DNMT1 e DNMT3) nos pacientes infectados. Estes dados sugerem que o DENV é capaz de interferir com os mecanismos epigenéticos do hospedeiro. / Dengue fever is a systemic viral infection, self-limited, transmitted to humans through the bite of infected female mosquito from Aedes genus. It is a disease with major impacts on the economy and public health, and it is estimated that between 50 to 100 million new dengue infections occur annually in more than 100 countries. Dengue fever is caused by Dengue virus (DENV), a single strand positive sense RNA virus belonging to the Flaviviridae family. The DENV infection may be asymptomatic or present different clinical manifestations, such as dengue fever (DF), hemorrhagic fever (DHF) and dengue shock syndrome (DSS). Published data indicate that some viral infections can cause epigenetic changes in their hosts, especially in the DNA methylation. Thus, the aim of this study was to investigate the influence of DENV infection in global methylation profile of DENV infected patients by MethELISA technique, and analyze the pattern of methylation in the promoter of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interferon gamma (IFN-γ) genes. The results obtained show a decrease the relative methylation percentage after DENV infection, suggesting an influence of viral infection in the epigenetic mechanisms of the host. There was also detected a higher rate of demethylation of TNF-α promoter in infected patients if compared to the control group. No difference was found in the methylation frequency between the two analyzed groups regarding the IFN-γ promoter. Meta-analysis of DNA microarray indicates that patients infected with DENV shows an increase in the expression of Thymine DNA Glycosylase (TDG) and DNA methyltransferases 1 and 3 (DNMT1 and DNMT3) genes, all involved in epigenetic regulation. So, these data indicated that DENV is able to interfere with the host epigenetic mechanisms. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Os tumores extra-axias do sistema nervoso são de localização extra-cerebral e na maioria das vezes benignos; meningiomas, schwanomas e metástases fazem parte deste grupo. O aparecimento de um tumor ocorre a partir do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas nas células. Para entender o mecanismo molecular da progressão tumoral e a formação de metástases é indispensável identificar os genes que acumulam essas alterações. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo analisar o perfil de metilação dos genes TP16, TP53, DAL-1, GSTP-1, MEN-1, NDRG2 e das DNA metiltransferases 3A, 3B e 3L e sua associação com os tumores extra-axiais e ainda, avaliar, através de um estudo caso-controle, a influência dos SNPs TP53 Pro47Ser e Arg72Pro, EGF + 61, GSTP-1 Ile105Val e WRN Cys1367Arg no desenvolvimento e prognóstico desses tumores. A técnica utilizada para a análise de hipermetilação foi a MSP, e através dela observamos que a atividade das DNMTs não está associada à metilação dos tumores extra-axiais e ainda, os perfis de metilação das DNMTs de novo não estão associados com alterações no padrão de metilação dos genes TP16, TP53, DAL-1, GSTP-1, MEN- 1 e NDRG2. Observamos que a metilação do gene TP53 está associada principalmente aos tumores de maior grau de malignidade, a uma deficiência na resposta a tratamentos e, conseqüentemente, a um maior número de óbitos. A metilação do gene TP16 está envolvida mais freqüentemente na formação de schwanomas e a de NDRG2 na progressão dos meningiomas. A análise de polimorfismos foi realizada através da técnica de PCR-RFLP e observamos diferenças nas distribuições genotípicas entre pacientes e controles nos SNPs TP53 Pro47Ser e Arg72Pro, EGF + 61 e GSTP-1 Ile105Val, onde as variantes Ser47, Pro72, EGF G61 e Val105 foram observadas com maior freqüência entre os portadores de tumores extra-axiais. Dessa forma, estas variantes podem ser fatores de susceptibilidade para o desenvolvimento dos tumores. / The extra-axial brain tumors have extra-brain localization and in most of the time they are benign, meningiomas, schwannomas and metastasis are included in this group. The appearance of a tumor occurs because of the accumulation of genetic and epigenetic alterations in the cells. In order to understand the molecular mechanism of the tumor progression and the metastasis formation it is important to identify the genes that accumulate the alterations. Thereby, the objective of this study was to analyze the methylation profile of the genes TP16, TP53, DAL-1, GSTP-1, MEN-1, NDRG2 and the DNA methyltransferases 3A, 3B and 3L and their association with the extra-axial brain tumors. Another purpose was to determine, in a case-control study, the roles of the TP53 Pro47Ser and Arg72Pro, EGF + 61, GSTP-1 Ile105Val and WRN Cys1367Arg SNPs in the development and prognosis of these tumors. We used the MSP to screen the hypermethylation profile and we observed no association between the DNMTs activity and the hypermethylation of the tumors. We also did not find association between the methylation of the DNMTs de novo and alterations in the methylation profile of the genes TP16, TP53, DAL-1, GSTP-1, MEN-1 and NDRG2. We observed that TP53 hypermethylation was associated with the high grade tumors, a poor response to the treatments and, consequently, the high number of obits. The TP16 methylation was involved with the shwannomas formation and the NDRG2 gene was involved in the meningiomas progression. For the polymorphism analysis, we used the PCR-RFLP technique and we observed differences in the genotype distributions between cases and controls of TP53 Pro47Ser and Arg72Pro, EGF + 61 and GSTP-1 Ile105Val SNPs, where the variants Ser47, Pro72, EGF G61 and Val105 were more frequent in patients than in controls. Thus, these variants can be important factors of susceptibility to the tumor development.

O comportamento materno é essencial para a sobrevivência e desenvolvimento do filhote mamífero. Durante a prenhez, as fêmeas recebem estímulos sensoriais e hormonais capazes de modificar e preparar o cérebro da mãe para o início dos padrões de comportamento materno (por exemplo, aumentando o número neurônios produtores de oxitocina no hipotálamo). Estudos têm identificado o hipotálamo como o principal responsável por estas mudanças, porém outras áreas do cérebro também estão envolvidas no processo do comportamento materno. Peg3, um gene marcado paternalmente expresso, é conhecido por controlar o comportamento materno em camundongos. Fêmeas nocautes para o gene Peg3 falham em aumentar a ingestão de alimentos, na ejeção de leite e em algumas atividades maternais, como placentofagia e construção do ninho. Este estudo teve como objetivo determinar os padrões de metilação da região diferencialmente metilada de Peg3 (Peg3DMR) de animais da raça Nelore de bovinos em diversas áreas do cérebro. Amostras foram coletadas das seguintes áreas: córtex frontal, occipital, temporal e parietal, hipocampo e hipotálamo, num total de 8 animais (4 machos e 4 fêmeas). O padrão de metilação destas amostras foi analisado pelo protocolo COBRA (do inglês, Combined Bisulfite-Restriction Analysis), que combina a modificação do DNA por bissulfito de sódio, amplificação por PCR e digestão por enzima de restrição. Foram encontrados diferentes padrões de metilação entre as amostras, ocorrendo uma predominância de hipometilação entre as amostras do sexo masculino, e padrões mais variados nas amostras do sexo feminino. As variações nos padrões de metilação ocorreram de maneira mais marcante entre as amostras de uma mesma região cerebral de diferentes animais, do que entre as amostras de várias regiões de um mesmo animal. Os resultados indicam que pode haver uma variação no status de imprinting em nível populacional, porém estudos com um número maior de amostras são necessários para a verificação da significância estatística destas variações. / The maternal behavior is essential to survival and development of mammalian offspring. Throughout pregnancy, females receive sensory and hormonal stimuli which promote modifications and prepare the mothers brain to the onset of maternal behavior patterns (for example, by increasing numbers of neurons producing oxytocin in the hypothalamus). Studies have identified the hypothalamus as the main responsible for these changes, but other areas of the brain are also involved in the maternal behavior process. Peg3, an imprinted paternally expressed gene, is known to control maternal behavior in mice. Peg3 knockout females failed in increasing food intake, milk ejection and some maternal activities as placentofagia and nest building. This study aimed to determine the methylation patterns of the differently methylated region of Peg3 (DMR-Peg3) of animals from Nellore cattle breed in several areas of the brain. Samples were collected from the following areas of cattle brain: the frontal, occipital, temporal and parietal cortices, hippocampus and hypothalamus, in a total of 8 animals (4 males and 4 females). The methylation pattern of these samples was analyzed by the protocol COBRA (Combined Bisulfite-Restriction Analysis), which combines DNA modification by sodium bisulfite, PCR amplification and digestion by restriction enzymes. It was found different methylation patterns among the samples. There was a predominance of hypomethylation among male samples, while different patterns were found among the female samples. Variation in the methylation patterns was more markedly observed among samples of the same cerebral region among different animals, then among samples of several regions within an animal. The results suggest that there may be a variation in the imprinting status at a population level, but further assays, with an increased number of samples are needed to verify the statistical significance of this variation.

Os tumores odontogênicos são um grupo heterogéneo de lesões formadas a partir de tecidos que dão origem ao dente. A metilação do ADN, uma adição covalente de um grupo metilo na posição 5 de carbono de um nucleótideo de citosina, é considerado um importante regulador da expressão génica. A adição do radical metil é catalisada por ADN metiltransferases (DNMTs). Embora alguns estudos epigenéticos tenham sido realizados em tumores odontogênicos, um estudo com os três tipos de DNMTs em vários membros desse grupo está em falta. Este estudo analisa a expressão de DNMTs em tumores odontogênicos. Amostras de vinte ameloblastomas, dez Calcificante tumores odontogênicos císticos, dez calcificados tumores epiteliais, dez tumor odontogênico adenomatóide, dez tumores odontogênicos queratocísticos, quatro fibromas ameloblásticos, dois fibro-odontoma ameloblástico, quatro fibroma centrais odontogênicos, sete tecidos de fibromas odontogênicos periféricos e dez mixomas odontogênicos foram incluídos. DNMT1, 3A e 3B foram expressas no núcleo e / ou citoplasma de todos os tumores odontogênicos. A alta expressão de DNMTs em células de tumor odontogênico sugere metilação como um mecanismo importante para este grupo de tumores. / Odontogenic tumours are a heterogeneous group of lesions formed from tissues that give rise to the tooth. DNA methylation, a covalent addition of a methyl group to the 5-carbon position of a cytosine nucleotide, is considered an important regulator of gene expression. The addition of the methyl radical is catalyzed by DNA methyltransferases (DNMTs). Although some epigenetic studies have been conducted in odontogenic tumours, a study with the three types of DNMTs in several different members of this group is missing. This study analyzes the expression of DNMTs in odontogenic tumours. Formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples of twenty ameloblastomas, ten calcifying cystic odontogenic tumors, ten calcifying epithelial tumors, ten adenomatoid odontogenic tumors, ten keratocystic odontogenic tumors, five ameloblastic fibromas, two ameloblastic fibro-odontoma, four central odontogenic fibroma, seven peripheral odontogenic fibroma and ten odontogenic mixoma were included. DNMT1, 3A and 3B were expressed in the nucleus and/or cytoplasm of all odontogenic tumours. The high expression of DNMTs in odontogenic tumour cells suggests methylation as an important mechanism for this group of tumours.