A produção in vitro de embriões expõe o concepto a condições diferentes do ambiente intra-tubárico-uterino. A alta tensão de oxigênio durante o cultivo in vitro induz estresse oxidativo mediante aumento dos níveis das espécies reativas de oxigênio. A condição de estresse oxidativo altera a expressão de RNAm e miRNAs, podendo comprometer vias de interação materno-embrionária. Recentemente, os exossomos têm sido descritos como um mecanismo complementar de transporte de RNAm e miRNAs, que beneficiam a comunicação bidirecional materno-embrionária. Portanto, além do estudo dos próprios embriões, a análise dos exossomos isolados do meio de cultivo da PIVE também é relevante. Comumente são utilizados dois modelos de cultivo na PIVE, a alta tensão (20%) e a baixa tensão (5%) de oxigênio. A hipótese deste estudo é que a alta tensão de oxigênio no cultivo embrionário gera uma condição de estresse oxidativo que causa alterações de expressão de RNAm e miRNAs presentes nos embriões e nos exossomos. Além disso, o estresse oxidativo exerceria efeito sobre o padrão de secreção destes exossomos. Para testar essa hipótese este estudo produziu embriões bovinos in vitro cultivados em diferentes tensões de oxigênio. Os embriões foram coletados no dia 7 e os meios de cultivo, para isolamento os exossomos, foram coletados nos dias 3 e 7 do cultivo. Os blastocistos cultivados em alta tensão de oxigênio apresentaram um aumentou dos níveis de EROs através de análise de fluorescência. Este resultado validou o modelo de estresse oxidativo para embriões. Os resultados iniciais indicaram que apesar do miR-199a-5p, descrito como possível regulador dos genes alvos ERBB2 e ERBB3, ter apresentado maior expressão nos embriões cultivados em alta tensão, os transcritos ERBB2 e ERBB3 e a proteína ERBB2 não apresentaram diferença significativa entre os grupos. Uma vez que não se estabeleceu uma relação de regulação entre o miR-199a-5p e o gene alvo ERBB2 para os embriões bovinos, este estudo se voltou para a análise de outros 96 RNAm e 378 miRNAs, destes 40 RNAm e 8 miRNAs apresentaram alterações significativas entre os embriões cultivados em alta e baixa tensão de oxigênio. Entre as principais funções alteradas estão associadas à resposta ao estresse oxidativo, proliferação e diferenciação celular, remodelação epigenética, apoptose, metabolismo e reconhecimento materno-fetal. Por fim, com o objetivo de compreender um panorama maior dos efeitos do estresse oxidativo, este estudo se propôs a analisar o padrão de expressão e os miRNAs do conteúdo dos exossomos do meio de cultivo. O estresse oxidativo alterou tanto a concentração dos exossomos quanto a expressão dos mRNAs, em ambos os dias do desenvolvimento embrionário (D3 e D7). Dentre os miRNAs, destaca-se o miR-210 que foi considerado por este trabalho como biomarcador não invasivo da condição de normoxia no cultivo in vitro de embriões bovinos. Em conclusão, esse estudo não elucidou como o estresse oxidativo altera a interação materno-embrionária em embriões produzidos in vitro em diferentes condições de tensão de oxigênio, mas gerou conhecimentos adicionais sobre do desenvolvimento embrionário bovino e os efeitos da alta tensão de oxigênio. / The in vitro embryo production exposes the concept to conditions different from the intra-tubal-uterine environment. The high oxygen tension during in vitro production induces the oxidative stress by increasing the concentration of reactive oxygen species. The oxidative stress condition changes the mRNA and miRNAs expression, it can compromise pathways of maternal-embryonic interaction. Recently, the exosomes have been described as a complementary mechanism of mRNA and miRNAs transport, which improve the bidirectional maternal-embryonic communication. Therefore, the studies of the embryos and exosomes isolated from the IVP culture medium are relevant. Two cultivation models are usually used in IVP, the high tension (20%) and the low tension (5%) of oxygen. The hypothesis of this study is that the high oxygen tension in the embryonic culture generates an oxidative stress condition that causes changes in the mRNA and miRNAs expression. In addition, this oxidative stress is able to modulate the secretion pattern of the exosomes isolated from IVP embryos. To test this hypothesis, this study produced in vitro bovine embryos developed at different oxygen tensions. The embryos were sampled on day 7 and the culture media, for exosomes isolation, were collected on days 3 and 7 of the embryo development. Blastocysts cultured in high oxygen tension showed increased levels of ROS through fluorescence analysis. This result validated the oxidative stress model for embryos. In order to understand the effect of oxidative stress on the pathways of maternal-embryonic interaction, this study aimed to analyze the ERBB signaling pathway. Despite the fact that miR-199a-5p, described as a possible regulator of the ERBB2 and ERBB3 target genes, showed higher expression in embryos cultured under high tension, the ERBB2 and ERBB3 transcripts and the ERBB2 protein showed no significant difference between high and low oxygen tension groups. Since a regulatory relationship between miR-199a-5p and the ERBB2 target gene was not established for bovine embryos, this study turned to the analysis of other 96 mRNAs and 378 miRNAs, out of 40 mRNAs and 8 miRNAs showed significant changes among the groups. The main altered functions are the response to oxidative stress, cell proliferation and differentiation, epigenetic remodeling, apoptosis, metabolism and maternal-fetal recognition. Finally, in order to understand the bigger picture of oxidative stress effect we analyze the secretion pattern and the miRNA content of the exosomes from culture medium of IVP embryos. Oxidative stress change both, the exosome concentration and the miRNA expression (at D3 and D7). Among the miRNAs, we highlight the miR-210 that was considered by this work as a non-invasive biomarker of the normoxia condition in the in vitro culture of bovine embryos. In conclusion, this study did not elucidate how oxidative stress changes the maternal-embryonic interaction in IVP embryos, but it generated additional knowledge about bovine embryonic development and the high oxygen tension effects.

Orientador: Carmen Silvia Bertuzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T17:41:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_CintiaMarques_M.pdf: 2054933 bytes, checksum: 39195c141e4cd2e600f9454a1cfc8781 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A síndrome de Down (SD) é uma aberração cromossômica atribuída à presença de três cópias dos genes localizados no cromossomo 21. Ocorre com uma freqüência estimada de um indivíduo em 600 nascidos vivos e de uma em 150 concepções. Os mecanismos relacionados com a não-disjunção do cromossomo 21 não foram ainda elucidados e embora a idade materna avançada seja um fator de risco, a maioria das crianças com SD nasce de mães com menos de 30 anos. Um mecanismo proposto para explicar a não-disjunção cromossômica consiste na hipometilação do centrômero levando à formação anormal do cinetócoro e ligação anormal dos microtúbulos. Tal mecanismo teria uma etiologia multifatorial e entre os fatores genéticos estariam as variantes polimórficas de enzimas envolvidas no metabolismo do folato. A via bioquímica do folato pode influenciar a estabilidade do DNA de dois modos: o primeiro está relacionado com a função que o folato desempenha na transferência de unidades de 1-carbono para a biosíntese de novo de nucleotídeos. Baixa concentração intracelular de 5, 10-metilenoTHF leva a uma diminuição da síntese de timidilato e a incorporação errônea de dUTP durante a replicação do DNA; o segundo modo envolve a produção de S-adenosilmetionina (SAM), o principal doador de grupos metil para a maioria das reações de metilação, incluindo a metilação CpG. Baixa concentração intracelular de 5,10-metilenoTHF é associado com baixa produção de SAM e conseqüentemente com a hipometilação do DNA. Diante disso, o objetivo do trabalho foi determinar se os polimorfismos MTHFD-1 1958G>A, TCII 776C>G, MTR 2756A>G, MTRR 66 A>G, RFC-1 80G>A e SHMT-1 1420C>T representam fatores de risco para gestações com SD. Para isso foi realizada a técnica de PCR utilizando 200 amostras de DNAs de mães de portadores de SD (MSD) e 340 amostras de DNAs controles seguida por digestão enzimática dos produtos obtidos e análise estatística dos resultados. Comparando a distribuição genotípica no grupo MSD e controle foi observado que o polimorfismo TCII 776C>G apresentou uma diferença estatisticamente significativa: ?2 (2) = 13,10 e p=0,0014. Nossos resultados indicam que mulheres com genótipo heterozigoto para o polimorfismo TCII 776C>G possuem um risco duas vezes maior de gerarem crianças com SD / Abstract: Down syndrome is a chromosome abnormality caused by the presence of three copies of genes located in the chromosome 21. It occurs in an estimated frequency of one out of 600 liveborns and one out of 150 conceptions. The mechanism related to the non-disjunction of the chromosome 21 has not been totally understood and even though the mother's age is a risk factor, most DS children are born to mothers aged less than 30. One mechanism proposed to explain the chromosome non-disjunction is the centromeic hypomethylation that causes abnormal formation of kinetochore and abnormal links of the microtubules. Such a mechanism is thought to have a multifactorial etiology and among the genetic factors are polymorphic variants of enzymes involved in folate metabolism. The biochemical pathway of the folate influnces the DNA stability in two ways: the first is related to the role of folate in one carbon unit transfer during "de novo" synthesis of nucleotides. Low levels of 5, 10-methylenetetrahydrofolate (5, 10-methyleneTHF) lead to a decrease in thymidylate synthesis and the misincorporation of the dUTP during replication of DNA; the second way involves the production of S-adenosyl methionine (SAM), the main donor of methyl to most methylation processes, incluing CpG methylation. Low intracellular 5,10-methyleneTHF is associated with low SAM production and consequently with DNA hypomethylation. Therefore, the purpose of the study was determining if the polymorfisms MTHFD-1 1958G>A, TCII 776C>G, MTR 2756A>G, MTRR 66A>G, RFC-1 80G>A e SHMT-1 1420C>T represent risk factors for DS pregnancies. So we used techniques of PCR followed by restriction enzyme analysis of 200 DNAs of mothers of DS children (MSD) and 340 DNAs of control mothers with statistic analyses of the results. Comparing the genotypic distribution in the groups MSD and control it has been observed that polymorphism TCII 776C>G showed a statistically remarkable difference: ?2 (2) = 13,10 e p=0,0014. Our results show that women that have heterozigote genotype for polymorphism TCII 776C>G have two times higher risk of generating DS children / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Os tumores extra-axias do sistema nervoso são de localização extra-cerebral e na maioria das vezes benignos; meningiomas, schwanomas e metástases fazem parte deste grupo. O aparecimento de um tumor ocorre a partir do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas nas células. Para entender o mecanismo molecular da progressão tumoral e a formação de metástases é indispensável identificar os genes que acumulam essas alterações. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo analisar o perfil de metilação dos genes TP16, TP53, DAL-1, GSTP-1, MEN-1, NDRG2 e das DNA metiltransferases 3A, 3B e 3L e sua associação com os tumores extra-axiais e ainda, avaliar, através de um estudo caso-controle, a influência dos SNPs TP53 Pro47Ser e Arg72Pro, EGF + 61, GSTP-1 Ile105Val e WRN Cys1367Arg no desenvolvimento e prognóstico desses tumores. A técnica utilizada para a análise de hipermetilação foi a MSP, e através dela observamos que a atividade das DNMTs não está associada à metilação dos tumores extra-axiais e ainda, os perfis de metilação das DNMTs de novo não estão associados com alterações no padrão de metilação dos genes TP16, TP53, DAL-1, GSTP-1, MEN- 1 e NDRG2. Observamos que a metilação do gene TP53 está associada principalmente aos tumores de maior grau de malignidade, a uma deficiência na resposta a tratamentos e, conseqüentemente, a um maior número de óbitos. A metilação do gene TP16 está envolvida mais freqüentemente na formação de schwanomas e a de NDRG2 na progressão dos meningiomas. A análise de polimorfismos foi realizada através da técnica de PCR-RFLP e observamos diferenças nas distribuições genotípicas entre pacientes e controles nos SNPs TP53 Pro47Ser e Arg72Pro, EGF + 61 e GSTP-1 Ile105Val, onde as variantes Ser47, Pro72, EGF G61 e Val105 foram observadas com maior freqüência entre os portadores de tumores extra-axiais. Dessa forma, estas variantes podem ser fatores de susceptibilidade para o desenvolvimento dos tumores. / The extra-axial brain tumors have extra-brain localization and in most of the time they are benign, meningiomas, schwannomas and metastasis are included in this group. The appearance of a tumor occurs because of the accumulation of genetic and epigenetic alterations in the cells. In order to understand the molecular mechanism of the tumor progression and the metastasis formation it is important to identify the genes that accumulate the alterations. Thereby, the objective of this study was to analyze the methylation profile of the genes TP16, TP53, DAL-1, GSTP-1, MEN-1, NDRG2 and the DNA methyltransferases 3A, 3B and 3L and their association with the extra-axial brain tumors. Another purpose was to determine, in a case-control study, the roles of the TP53 Pro47Ser and Arg72Pro, EGF + 61, GSTP-1 Ile105Val and WRN Cys1367Arg SNPs in the development and prognosis of these tumors. We used the MSP to screen the hypermethylation profile and we observed no association between the DNMTs activity and the hypermethylation of the tumors. We also did not find association between the methylation of the DNMTs de novo and alterations in the methylation profile of the genes TP16, TP53, DAL-1, GSTP-1, MEN-1 and NDRG2. We observed that TP53 hypermethylation was associated with the high grade tumors, a poor response to the treatments and, consequently, the high number of obits. The TP16 methylation was involved with the shwannomas formation and the NDRG2 gene was involved in the meningiomas progression. For the polymorphism analysis, we used the PCR-RFLP technique and we observed differences in the genotype distributions between cases and controls of TP53 Pro47Ser and Arg72Pro, EGF + 61 and GSTP-1 Ile105Val SNPs, where the variants Ser47, Pro72, EGF G61 and Val105 were more frequent in patients than in controls. Thus, these variants can be important factors of susceptibility to the tumor development.

O comportamento materno é essencial para a sobrevivência e desenvolvimento do filhote mamífero. Durante a prenhez, as fêmeas recebem estímulos sensoriais e hormonais capazes de modificar e preparar o cérebro da mãe para o início dos padrões de comportamento materno (por exemplo, aumentando o número neurônios produtores de oxitocina no hipotálamo). Estudos têm identificado o hipotálamo como o principal responsável por estas mudanças, porém outras áreas do cérebro também estão envolvidas no processo do comportamento materno. Peg3, um gene marcado paternalmente expresso, é conhecido por controlar o comportamento materno em camundongos. Fêmeas nocautes para o gene Peg3 falham em aumentar a ingestão de alimentos, na ejeção de leite e em algumas atividades maternais, como placentofagia e construção do ninho. Este estudo teve como objetivo determinar os padrões de metilação da região diferencialmente metilada de Peg3 (Peg3DMR) de animais da raça Nelore de bovinos em diversas áreas do cérebro. Amostras foram coletadas das seguintes áreas: córtex frontal, occipital, temporal e parietal, hipocampo e hipotálamo, num total de 8 animais (4 machos e 4 fêmeas). O padrão de metilação destas amostras foi analisado pelo protocolo COBRA (do inglês, Combined Bisulfite-Restriction Analysis), que combina a modificação do DNA por bissulfito de sódio, amplificação por PCR e digestão por enzima de restrição. Foram encontrados diferentes padrões de metilação entre as amostras, ocorrendo uma predominância de hipometilação entre as amostras do sexo masculino, e padrões mais variados nas amostras do sexo feminino. As variações nos padrões de metilação ocorreram de maneira mais marcante entre as amostras de uma mesma região cerebral de diferentes animais, do que entre as amostras de várias regiões de um mesmo animal. Os resultados indicam que pode haver uma variação no status de imprinting em nível populacional, porém estudos com um número maior de amostras são necessários para a verificação da significância estatística destas variações. / The maternal behavior is essential to survival and development of mammalian offspring. Throughout pregnancy, females receive sensory and hormonal stimuli which promote modifications and prepare the mothers brain to the onset of maternal behavior patterns (for example, by increasing numbers of neurons producing oxytocin in the hypothalamus). Studies have identified the hypothalamus as the main responsible for these changes, but other areas of the brain are also involved in the maternal behavior process. Peg3, an imprinted paternally expressed gene, is known to control maternal behavior in mice. Peg3 knockout females failed in increasing food intake, milk ejection and some maternal activities as placentofagia and nest building. This study aimed to determine the methylation patterns of the differently methylated region of Peg3 (DMR-Peg3) of animals from Nellore cattle breed in several areas of the brain. Samples were collected from the following areas of cattle brain: the frontal, occipital, temporal and parietal cortices, hippocampus and hypothalamus, in a total of 8 animals (4 males and 4 females). The methylation pattern of these samples was analyzed by the protocol COBRA (Combined Bisulfite-Restriction Analysis), which combines DNA modification by sodium bisulfite, PCR amplification and digestion by restriction enzymes. It was found different methylation patterns among the samples. There was a predominance of hypomethylation among male samples, while different patterns were found among the female samples. Variation in the methylation patterns was more markedly observed among samples of the same cerebral region among different animals, then among samples of several regions within an animal. The results suggest that there may be a variation in the imprinting status at a population level, but further assays, with an increased number of samples are needed to verify the statistical significance of this variation.

Alterações no padrão normal de metilação do DNA têm sido caracterizadas como um importante mecanismo na gênese de neoplasias. Esta modificação do DNA é denominada de epigenética uma vez que altera o padrão de expressão das células sem alterar a seqüência do DNA. No câncer, as alterações epigenéticas observadas consistem na hipermetilação das ilhas CpG nos promotores dos genes acompanhada de uma hipometilação global dos dinucleotídeos CpG dispersos pelo genoma. Este evento mostra geralmente ser câncer-específico, ou seja, alguns genes que são metilados em um tipo de câncer, não o são na maioria dos outros tipos. O objetivo deste projeto foi identificar, através da construção de bibliotecas subtrativas de RaSH, genes silenciados por metilação nas linhagens de câncer de cabeça e pescoço FaDu, UM-SCC-14A, UM-SCC-17A e UM-SCC-38 e que possuem expressão induzida após o tratamento com o agente demetilante 5-aza-2-deoxicitidina. Uma vez que a metilação leva a diminuição gradual da expressão gênica, o método RT-PCR semi-quantitativo foi utilizado para validação da expressão diferencial dos genes candidatos PLAU, CD82, RBBP4, AOF2, TMSB10, HSPA5 e LAMC2 nas linhagens não tratadas e tratadas com o agente demetilante 5-aza-2-deoxicitidina. Para todos os genes candidatos foi observado aumento na expressão gênica após o tratamento em pelo menos uma das quatro linhagens. Na linhagem UM-SCC-14 A, os genes CD82, RBBP4, AOF2, HSPA5 e LAMC2 mostraram aumento na expressão após o tratamento com o agente demetilante, sendo que o gene LAMC2 também mostrou esse aumento de expressão na linhagem UM-SCC-17A. Na linhagem UM-SCC-38A todos os genes mostraram aumento de expressão após o tratamento. Embora novos estudos sobre a metilação da região promotora dos genes selecionados sejam necessários, aumentam as evidências de que os genes selecionados sejam regulados pelo mecanismo de metilação e que estejam metilados nas linhagens estudadas. / Abnormalities on the normal pattern of DNA methylation have been caracterized as an important mechanism on carcinogenesis. This modification is called epigenetic and can be defined as a heritable change in gene expression that is not accompanied by changes in DNA sequence. The epigenetic alterations observed on cancer include hypermethylation of selected CpG island gene promoters and simultaneous global hypomethylation. The aim of this project was to identify, by rapid subtraction hybridization, genes silenced by methylation on head and neck cancer lineages with alterations on gene expression after the treatment with 5-aza-2-deoxycytidine. The cancer lineages we used for our experiments were: FaDu, UM-SCC-14A, UM-SCC-17A e UM-SCC-387A and seven genes (PLAU, CD82, RBBP4, AOF2, TMSB10, HSPA5 and LAMC2) were analysed by semiquantitative RT-PCR and for all of them an increaseament of gene expression was observed. For the UM-SCC-14A lineage, the genes CD82, RBBP4, AOF2, HSPA5 and LAMC2 were upregulated after the treatment with demethylating agent as well as LAMC2 was uperegulated on UM-SCC-17A. For the UM-SCC-38A lineage all the genes showed increased expression after the treatmente with -aza-2-deoxycytidine. Our work is another evidence that some genes may be regulated by methylation during carcinogenesis.

Orientador: Ana Paula de Souza Pardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T15:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Planello_AlineCristiane_D.pdf: 1888206 bytes, checksum: 00e43f6f072e313fafc04b5a4406af8b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A inflamação crônica é conhecida por induzir alterações epigenéticas, em particular, alterações na metilação do DNA. A ilha CpG do gene SOCS1 tem sido observada hipermetilada em diferentes tipos de câncer e em doenças associadas à inflamação. No entanto, pouco se sabe sobre essas alterações epigenéticas associadas à periodontite crônica. A fim de abordar essa questão, nós investigamos a metilação do DNA no exon 2 da Ilha CpG do SOCS1 e sua relevância funcional para a periodontite crônica em 90 amostras de tecidos gengivais usando a técnica de comparação de melting sensível a metilação (MS-HRM). Nós observamos que a região analisa se encontra hipermetilada quando comparada com amostras de indivíduos saudáveis. Alterações na expressão no SOCS1 não foram encontradas. Posteriormente foram realizadas investigações da sequencia do SOCS1 que revelaram marcadores de enhancer na região. Analise de sítios hipersensíveis a Dnase I (Dnase I hipersensitivity site ¿ DHS), que são associados com região regulatória, mostraram um DHS dentro do exon2 do SOCS1, que cobre a mesma região estudada na técnica MS-HRM. Esse DHS correlacionou-se com vários promotores na vizinhança do SOCS1, sendo considerados os genes alvos. Fragmentos desmetilados e metilados cobrindo a região encontrada com diferença de metilação no SOCS1 foram clonados em um plasmídeo repórter que possui um promotor e é livre de qualquer CpG.. Os fragmentos desmetilados aumentaram a atividade da luciferase, demonstrando a atividade de enhancer da região. Já os fragmentos metilados, além de não exercerem atividade de enhancer, foram capazes de reprimir a função do promotor. Corroborando essas informações, foi observada correlação negativa entre a metilação no SOCS1 nas amostras com inflamação e a expressão de genes. Os dados apresentados indicam que a função principal da metilação do DNA em um enhancer é controlar sua função regulatória e consequentemente os níveis de transcrição dos genes alvo, o que pode ser evidenciado pela hipermetilação do exon do SOCS1 na inflamação crônica / Abstract: Chronic inflammation is known to induce epigenetic alterations, in particular alterations in DNA methylation. SOCS1 CpG island (CGI) has been demonstrated hypermethylated in many types of cancer and inflammation-associated diseases. However, little is known about the epigenetic changes associated with chronic periodontitis. In order to address this question, we investigated DNA methylation of oxon 2 of SOCS1 CGI and its functional relevance to chronic periodontitis in 90 gingival tissue samples using methylation sensitive high resolution melting (MS-HRM). We found this region to be hypermethylated when compared with healthy controls. No changes in gene expression were observed. Further investigations of SOCS1 sequence showed enhancer marker at SOCS1 region. Correlation analysis of Dnase I hypersensitivity site (DHS), which is associated with regulatory region, showed a DHS inside exon2 SOCS1 correlated with several promoter in the neighboring region, considered target genes. Fragments harboring the SOCS1 region found to be differentially methylated, were cloned into a CpG free-Luc reporter vector just upstream the promoter. Unmethylated and methylated fragments were tested. The unmethyalted fragment enhanced the promoter activity of the promoter. Strikingly, not only the exon2 of SOCS1 CGI presented enhancer activity but also it had its activity disrupted by DNA methylation. Accordingly, negative correlation between SOCS1 methylation and expression of neighboring genes was observed in chronic inflammation. The data indicate that the primary function of enhancer DNA methylation is to control its regulatory function and the transcription levels of enhancer target genes, which can be evidenced by exon 2 SOCS1 CGI hypermethylation on chronic inflammation / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutora em Biologia Buco-Dental

Orientador: Sérgio Roberto Peres Line / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-23T22:35:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mofatto_LucianaSouto_D.pdf: 2939657 bytes, checksum: 161ea0e68091cc76485826424b41aab0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os G-quadruplexes são estruturas secundárias de DNA altamente organizadas, constituídas por sequências ricas em guaninas capazes de formar tétrades ligadas por pontes de hidrogênio. Essas sequências são capazes de modular a transcrição gênica e o splicing alternativo de éxons. Além disso, estudos também mostraram que os G-quadruplexes estão presentes na região promotora de oncogenes (como c-MYC) e nas regiões terminais dos telômeros, indicando que o G-quadruplex pode ser um possível alvo terapêutico contra o câncer. A metilação do DNA é uma modificação bioquímica que frequentemente aparece na posição C5 de citosinas da sequência do dinucleotídeo 5'- citosina guanina - 3' (CpG) em células eucarióticas. As alterações no padrão normal de metilação do DNA estão associadas a situações patológicas, como inflamação e câncer. Assim, a metilação anormal de citosinas pode ser responsável pela indução de câncer através de mutações pontuais em genes supressores de tumor presentes em células somáticas e germinativas. Este trabalho propôs estudar a estrutura e estabilidade de Gquadruplexes de DNA e sua influência na metilação do DNA. Neste intuito foram realizadas análises para verificar se a formação de G-quadruplex no DNA dupla fita poderia influenciar no padrão de metilação de citosinas, utilizando oligonucleotídeos (ricos em guaninas e com sítio para metilação) que mimetizam a fita dupla de DNA. Também foi estudado: (1) a estabilidade de G-quadruplexes contendo mais de quatro tríades de G e a possível formação de G-quadruplexes em DNA fita dupla em ensaio "in vitro"; (2) a interação entre extratos de própolis e G-quadruplexes de DNA e (3) o efeito de estabilizadores de G-quadruplex (TMPyP4 e 360A) no padrão de metilação do DNA em cultura de linhagens de células normais e tumorais / Abstract: G-quadruplexes are highly organized secondary structures of DNA, consisting of guanine rich sequences that form tetrads linked by hydrogen bonds. These sequences can modulate gene transcription and the alternative splicing of exons. Studies also showed that G-quadruplexes are present in the promoter of oncogenes (such as c-MYC) and terminal telomere regions, suggesting that the Gquadruplex can be a therapeutic target in cancer. DNA methylation is a frequent biochemical modification that appears in C5 position of cytosine in the dinucleotide sequence 5' - cytosine guanine - 3' (CpG) in eukaryotic cells. Changes in the normal patterns of DNA methylation are frequently associated with patologic situations, such as inflammation and cancer. Abnormal methylated cytosine may be responsible for induction of cancer due to mutations in tumor suppressor genes of somatic and germline cells. The aim of this study was to analyze the structure and stability of Gquadruplexes of DNA and its influence on DNA methylation. It was verified if Gquadruplex formation of double-stranded DNA could influence the pattern of cytosine methylation, using oligonucleotides (sequences with methylation site and rich in guanine) that simulated double-stranded DNA. We also evaluated: (1) the stability of G-quadruplexes containing more than four triads of guanine and the possible formation of G-quadruplexes in double-stranded DNA by "in vitro" test; (2) the interaction between propolis ethanolic extracts and DNA G-quadruplexes and (3) the effect of G-quadruplex ligands (TMPyP4 and 360A) for DNA methylation in normal and tumor cell lines / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutora em Biologia Buco-Dental

A epigenética é uma subárea da Genética, na qual são estudados mecanismos que são essenciais para o adequado desenvolvimento dos mamíferos, sendo que, alterações neste estágio podem levar a vários distúrbios metabólicos, como a obesidade. Atualmente a obesidade é um grave problema de saúde pública mundial, tem origem multifatorial envolvendo tanto fatores ambientais quanto genéticos. Existem alguns genes que estão envolvidos com a obesidade, como por exemplo, o gene da pró-opiomelanocortina (POMC). O objetivo do presente projeto de pesquisa é investigar os padrões de expressão e metilação do gene Pomc na prole de ratas submetidas às dietas deficiente e suplementada com ácido fólico. Os animais utilizados foram ratos Wistar. O estudo envolveu filhotes (n=24) machos e fêmeas que foram desmamados com a mesma dieta de suas respectivas mães, sendo três grupos de tratamento, o grupo controle (2,0 mg de ácido fólico/kg de ração), o grupo deficiente (0,5 mg de ácido fólico/kg de ração) e o grupo suplementado (8 mg de ácido fólico/kg de ração). Foram coletadas amostras do núcleo arqueado do hipotálamo, a partir das quais foram extraídos DNA, RNA e proteínas utilizando kits comerciais seguindo o protocolo do fabricante. Com o DNA foi realizada a análise do padrão de metilação. O mRNA foi utilizado para a análise da expressão gênica, por PCR em tempo real, pelo sistema TaqMan® (Life Technologies(TM)). O estudo de proteômica foi realizado por Western blotting. De modo geral, observou-se que o peso corpóreo dos filhotes machos não apresentou diferença estatística entre os grupos. O consumo de ração do grupo deficiente em ácido fólico foi estatisticamente (p = 0,03) maior do que o grupo controle. Em relação aos filhotes fêmeas observou-se que o peso corpóreo do grupo suplementado foi estatisticamente (p = 0,01) maior do que o grupo controle, e referente ao consumo de ração, não houve diferença estatística significativa entre os grupos de tratamento. As análises de peso cerebral, expressão gênica, metilação e expressão proteica de Pomc não apresentaram diferenças estatísticas significativas entre os grupos de tratamento de ambos os sexos. Conclui-se que a intervenção com dietas com diferentes concentrações de ácido fólico não ocasionou alterações significativas na prole, em relação ao estudo de proteômica e aos padrões de metilação e expressão do gene Pomc. Quanto ao peso corpóreo e consumo de ração dos animais mostrou-se que a suplementação com ácido fólico durante a gestação e no pós desmame foi capaz de alterar estes dois parâmetros, com resposta divergente entre os machos e fêmeas na prole adulta. / Epigenetic mechanisms are essential for proper development in mammals, and that changes at this stage may lead to various metabolic disorders such as obesity. Currently obesity is a serious problem of public health worldwide, has a multifactorial origin involving both environmental and genetic factors. There are some genes that are involved with obesity, such as the proopiomelanocortin gene (POMC). The aim of this research project is to investigate the expression and methylation patterns of the Pomc gene in the offspring of rats subjected to deficient and supplemented diets with folic acid. Animals used were Wistar rats. The study involved males and females pups (n = 24) that were weaned at the same diet their mothers, three treatment groups, control group (2,0 mg/kg of folic acid), deficient group (0,5 mg/kg of folic acid) and the supplemented group (8,0 mg/kg of folic acid). The arcuate nucleus of the hypothalamus tissue were collected, from which was extracted DNA, RNA and proteins using commercially available kits following the manufacturer\'s protocol. The DNA methylation pattern analysis was performed. The mRNA was used for the analysis of gene expression by real time PCR, the TaqMan (Life Technologies (TM)) system. The proteomic study was carried out by Western blotting. In general, we found that the body weight of the male offspring showed no statistical difference between the groups. The feed intake of folic acid deficient group was statistically (p = 0.03) higher than the control group. In relation to female offspring was observed that the body weight of the supplemented group was statistically (p = 0.01) higher than the control group, and related to feed intake, there was no statistically significant difference between the treatment groups. The analysis of brain weight, gene expression, methylation and protein expression of Pomc no significant statistical differences among treatment groups of both sexes. Concluded that the intervention diets with different folic acid concentrations did not cause significant changes in the offspring compared to the study of proteomics and methylation and expression patterns of the Pomc gene. As for the body weight and feed consumption of animals it showed that supplementation with folic acid during pregnancy and post weaning was able to alter these two parameters with differing response between males and females in the adult offspring.

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Resumo: As tecnologias de reprodução assistida ou ARTs (“Assisted Reproductive Technology”) são amplamente utilizadas na reprodução humana e animal. Para estes procedimentos, gametas e embriões são expostos a um ambiente artificial que mimetiza o trato reprodutivo. Um dos fatores mais discrepantes neste contexto é a atmosfera gasosa, visto que in vivo a concentração de O2 encontrada no trato reprodutivo é menor do que a utilizada no ambiente in vitro, sendo comumente utilizada a concentração de 20% de oxigênio neste sistema artificial. Altas concentrações deste gás provocam estresse oxidativo e aumento das concentrações de espécies reativas de oxigênio (EROs) e, consequente maior proporção de células apoptóticas em oócitos e embriões. Entretanto, pouco se sabe sobre as consequências da mudança de atmosfera gasosa durante as fases iniciais da produção in vitro de embriões e as possíveis consequências no remodelamento epigenético. Para validar a hipótese de que diferentes concentrações de oxigênio durante a maturação e a fecundação in vitro modulam a transcrição de genes envolvidos no estresse oxidativo e modeladores epigenéticos em oócitos, células do cumulus e embriões bovinos. Além disso, o estresse oxidativo gerado nos embriões exerce efeito sobre os níveis globais de metilação do DNA e marcas de histonas, cinco experimentos foram realizados com objetivo de investigar o papel da atmosfera gasosa nos passos iniciais da produção in vitro de embriões bovinos. Para diferenciar os efeit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

INTRODUÇÃO: A expansão e disseminação do consumo de crack e cocaína no Brasil vem se tornando um grave problema de saúde pública nos últimos vinte anos. Diferentes abordagens biológicas têm sido investigadas utilizando o fenótipo de abuso/dependência de crack/cocaína, cujos resultados têm demonstrado a participação importante do substrato genético, assim como a sua interação com os fatores ambientais no desenvolvimento desse transtorno. OBJETIVOS: Investigar o padrão de metilação do DNA do genoma de indivíduos que apresentam abuso/dependência de cocaína e de crack, comparando ao padrão de metilação de indivíduos controles. MÉTODOS: Foram selecionados 24 dependentes de cocaína e crack e 24 controles saudáveis, pareados por sexo e idade. Utilizando amostras de DNA extraídas de sangue periférico de cada um dos participantes, foi realizada a técnica de metilação global com o ensaio Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) BeadChip. Os resultados iniciais foram normalizados considerando a heterogeneidade celular e analisados utilizando o pacote ChAMP (Chip Analysis Methylation Pipeline) para identificar genes e/ou regiões gênicas diferencialmente metiladas que possam representar fatores de vulnerabilidade para o comportamento de abuso/dependência do crack e da cocaína. Os processos biológicos e vias celulares com os quais os sítios diferencialmente metilados estão envolvidos foram explorados usando as ferramentas disponibilizadas pelo \"WebGestalt\" e pelo \"UCSC Genome Browser\". RESULTADOS: Foram observados 250 sítios diferencialmente metilados, associados a 246 genes na comparação dos perfis de metilação entre os casos e controles, sendo que 49% destes estavam localizados nas regiões promotoras dos genes, sugerindo que esses sítios podem estar relacionados com a expressão gênica. Alterações estatisticamente significantes no padrão de metilação entre casos x controles foram observadas em 23 sítios CpG (p-valor ajustado < 10-5 e |?beta| = 0,1). Observou-se também que três regiões diferencialmente metiladas foram associadas a genes hipometilados (BMP8A, GPR88 e RNF166) (p-valor ajustado < 0.05), cada uma com pelo menos três sítios. Alterações estatisticamente significantes também foram observadas em seis genes hiper-representados: CALCA, NCOA2, DRD2, EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, envolvidos em processos biológicos e moleculares. CONCLUSÕES: Observou-se diferenças estatisticamente significativas no padrão de metilação genômico de usuários/dependentes de crack e cocaína quando comparados aos controles saudáveis em amostra de DNA extraídas de sangue periférico. Comparação de estudos de expressão em tecido cerebral correlacionaram-se parcialmente com os achados apresentados. Outros estudos utilizando amostras independentes são necessários para confirmar esses achados. A confirmação desses resultados poderá contribuir na identificação e compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos na dependência do crack/cocaína / BACKGROUND: The expansion and dissemination of crack and cocaine in Brazil has become a progressive and serious public health problem during the last twenty years. Different biological approaches have been investigated using the crack/cocaine abuser/dependent phenotype, with results confirming the important role of the genetic component, as well as its interaction with environmental factors. OBJECTIVES: To investigate the DNA methylation pattern levels in the genome of individuals with crack and cocaine abuse/dependence and comparing it with the DNA methylation pattern of the genome of control subjects. METHODS: 24 crack and cocaine abusers/dependents and 24 healthy controls were selected and matched by sex and age. Using DNA samples from peripheral blood of each participant, a global methylation technique was performed using the Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) Bead Chip assay. The initial results were normalized for cellular heterogeneity and re-analyzed using ChAMP package (Chip Methylation Analysis Pipeline) to identify differentially methylated genes or/and DNA regions that may represent biological/genetic risk factors for crack and cocaine abuse/dependence behavior. The biological processes and cellular pathways were explored using tools provided by \"WebGestalt\" and \"UCSC Genome Browser\". RESULTS: 250 differentially methylated sites associated with 246 genes in methylation comparison profiles between cases and controls were identified, of which almost half were located in the promoter regions of genes (49%), suggesting that these sites may be related to gene expression. Statistically significant changes in the methylation patterns between cases and controls were observed in 23 CpG sites (adjust p-value < 10-5 and |deltabeta| = 0.1). In addition, three differentially methylated regions were associated with hipomethylated genes (BMP8A, GPR88 e RNF166) (adjust p-value < 0.05), each one with at least three sites. Statistically significant changes were also observe with six hiper-represented genes: CALCA, NCOA2, DRD2, EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, which are involved in biological and molecular processes. CONCLUSIONS: Crack and cocaine users/dependents presented significant statistical differences in the methylation pattern when compared to healthy controls in DNA samples extracted from peripheral blood. Results from gene expression studies using brain tissue can be correlated with our results. In order to confirm the present findings, future studies should be replicated using independent samples. The confirmation of these results will contribute to the understanding of the biological mechanisms involved in crack/cocaine dependence