Orientador: Fabíola Traina / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T22:39:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scopim-Ribeiro_Renata_M.pdf: 3643524 bytes, checksum: fec865c6ccea452efda050e40c6f1aa1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As neoplasias mieloides compreendem um grupo heterogêneo de doenças hematológicas que se originam de um precursor mieloide comum, em diferentes fases de diferenciação. As alterações celulares que levam ao desenvolvimento de neoplasias podem ocorrer através de mecanismos epigenéticos ou de alterações genéticas. DNMT3A codifica metiltransferases que adicionam grupamentos metil a resíduos de citosina do DNA e TET2 promove a hidroxilação da citosina metilada, o que os caracteriza como elementos importantes no controle epigenético. DNMT3A e TET2 encontram-se frequentemente mutados em neoplasias mieloides, mas o impacto prognóstico destas mutações ainda é controverso. A consequência funcional da mutação de DNMT3A em neoplasias mieloides ainda não foi definida, mas o silenciamento da proteína em células progenitoras murinas favorece a autorrenovação e compromete a diferenciação celular. A mutação de TET2 tem como consequência a perda de função do gene e participa da transformação neoplásica das células mieloides, favorecendo a proliferação da série mielomonocítica. Entretanto, a expressão de TET2 e DNMT3A nestas doenças ainda é pouco elucidada. Assim, os objetivos deste estudo foram (1) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A em células hematopoéticas de indivíduos normais e pacientes com síndrome mielodisplásica (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA), (2) correlacionar a expressão de TET2 e DNMT3A com o fenótipo clínico e sobrevida de pacientes com SMD; (3) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A durante a diferenciação celular hematopoética e (4) avaliar o efeito do silenciamento de DNMT3A no fenótipo de linhagens celulares leucêmicas. No presente estudo, verificamos redução na expressão de TET2 em células provenientes de pacientes com SMD e LMA quando comparada à expressão em controles normais (p<.001), e redução em SMD alto risco quando comparada à SMD baixo risco (p=.02). Os resultados em amostras sequenciais de cinco pacientes com SMD indicaram redução da expressão de TET2 no momento da progressão da doença. A análise univariada evidenciou que fatores clínicos tiveram impacto tanto na sobrevida livre de evento como sobrevida global, incluindo a classificação de risco pela OMS 2008 (alto vs. baixo, p<.0001), IPSS (int-2/alto vs. baixo/int-1, p<.0001), hemoglobina (<10 vs. ? 10, p<.05), contagem de leucócitos (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), contagem absoluta de neutrófilos (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) e porcentagem de blastos na medula óssea (? 5 vs. <5 ou ? 10 vs. <10, p<.0004). Além disso, a baixa expressão de TET2 teve impacto negativo na sobrevida livre de evento (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) e na sobrevida global (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). A análise multivariada indicou que a baixa expressão de TET2 (p <.0001), IPSS alto/intermediate-2 (p <.0001), e hemoglobina <10 g/dL (P<.03) são fatores prognósticos para menor sobrevida livre de evento e sobrevida global. Durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD, observamos um aumento significativo da expressão de TET2 (p=. 03). Na avaliação da diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo na expressão de TET2 durante as diferenciações granulocítica (p=.04) e megacariocítica (p=.03); e um aumento não significativo durante a diferenciação eritrocítica. A expressão de DNMT3A foi semelhante entre pacientes com LMA, SMD e controles normais, e não teve impacto significativo na sobrevida dos pacientes com SMD. A expressão de DNMT3A não foi modulada durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD. Nos modelos de diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo da expressão de DNMT3A durante a diferenciação granulocítica, mas não durante a diferenciação eritrocítica e megacariocítica. A redução na expressão de DNMT3A não resultou em alteração significativa na apoptose, na proliferação e no ciclo celular em linhagens leucêmicas HL60 e U937. A expressão gênica e proteica de PTEN não foi modulada em células leucêmicas submetidas à inibição de DNMT3A. Os achados aqui descritos sugerem que, similarmente à presença de mutação no TET2, a baixa expressão de TET2 pode participar do processo de transformação celular em SMD de alto risco e LMA; estudos clínicos deveriam considerar a investigação da expressão gênica de TET2 em conjunto com a pesquisa de mutação TET2 na definição de prognóstico. Os resultados de expressão e função de DNMT3A sugerem que a mutação, e não a expressão, deva ser o principal mecanismo pelo qual o DNMT3A participa da transformação neoplásica e que a função de DNMT3A pode depender da linhagem celular estudada / Abstract: Myeloid neoplasms comprise a heterogeneous group of hematologic malignancies that originate from a common myeloid precursor at different stages of differentiation. Cellular changes that lead to development of malignancies may occur through epigenetic mechanisms or genetic alterations. DNMT3A encodes methyltransferases that add methyl groups to cytosine residues in DNA, TET2 promotes hydroxylation of methylated cytosine, and both proteins are important elements in epigenetic control. TET2 and DNMT3A are recurrently mutated in myeloid malignancies, but the prognostic consequence of TET2 and DNMT3A mutation is still controversial. The functional consequences of DNMT3A mutation has not been defined, but the protein silencing in murine progenitor cells promotes self-renewal and reduces cell differentiation. TET2 mutation results in loss of function and participates in the neoplastic transformation of myeloid cells, favoring the proliferation of granulomonocytic cells. However, the expression of TET2 and DNMT3A in these diseases has been rarely addressed. Then, the aims of this study were (1) to evaluate TET2 and DNMT3A gene expression in hematopoietic cells from healthy individuals and from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and acute myeloid leukemia (AML); (2) to correlate TET2 and DNMT3A expression with clinical phenotype and outcomes of MDS patients; (3) to investigate TET2 and DNMT3A expression during hematopoietic cell differentiation; and (4) to evaluate the effect of DNMT3A silencing in the phenotype of leukemia cell lines. In this study, the expression of TET2 was decreased in cells from patients with MDS and AML compared to healthy donors (p<.001) and reduced high-risk MDS compared to low risk MDS (p=.02). The results in sequential samples from five patients with MDS indicate reduced expression of TET2 at the time of disease progression. By univariate analysis, clinical factors that significantly affected both event free survival (EFS) and overall survival (OS) included risk stratification by WHO 2008 (high vs. low, p<.0001), IPSS (int-2/high vs. low/int-1, p <.0001), hemoglobin (<10 vs. ? 10, p<.05), white blood cell counts (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), absolute neutrophil counts (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) and bone marrow blast percentage (? 5 vs. <5 or ? 10 vs. <10, p<.0004). Furthermore, low TET2 expression negatively impacted both EFS (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) and OS (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). Multivariate analyses indicated that low TET2 expression (p <.0001), along with IPSS high/intermediate-2 risk group (p <.0001), and hemoglobin <10 g/dL (p<.03) were independently prognostic for worse EFS and OS. During erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with low-risk MDS, we observed an increased expression of TET2 (p=.03). During cell differentiation of leukemic cell lines, we observed a significantly increase in the expression of TET2 during granulocytic and megakaryocytic differentiation (p=.04 and p=.03, respectively); there was also an increased expression during erythrocytic differentiation, but this was not statistically significant. The expression of DNMT3A was similar between patients with AML, MDS and healthy donors, and it did not impact survival outcomes in MDS patients. DNMT3A expression was not modulated during erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with MDS. In leukemic cell lines models of differentiation, we observed a significantly increase in the DNMT3A expression during granulocytic differentiation, but not in erythrocytic and megakaryocytic differentiation. The DNMT3A silencing did not result in significant changes in apoptosis, proliferation and cell cycle in leukemic cell lines HL60 and U937. PTEN gene and protein expression was not modulated in leukemic cell lines submitted to inhibition of DNMT3A. The findings reported here suggest that, similarly to the presence of TET2 mutations, the low expression of TET2 can participate in the process of cell transformation in high risk MDS and AML. Clinical studies should consider the investigation of TET2 expression together with the studies of TET2 mutation to defining prognosis. Our results of expression and function suggest that DNMT3A mutation, instead of the expression, should be the main mechanism by which DNMT3A participates in neoplastic transformation and that DNMT3A function may vary according to the cell line studied / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T03:47:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_AmandaBortolini_D.pdf: 6025388 bytes, checksum: 97930bc131f2a0eac6926dae1eeb9319 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Modificações epigenéticas do DNA ou da cromatina atuam principalmente no controle da atividade de elementos de transposição, podendo também silenciar genes, geralmente quando estes estão associados a elementos de transposição ou sequências repetidas. Em plantas, alguns alelos epigenéticos afetando caracteres como morfologia floral, florescimento, estatura ou amadurecimento do fruto foram descritos, revelando o potencial deste tipo de regulação para gerar variabilidade fenotípica herdável não necessariamente vinculada a alterações da sequência de DNA. No entanto, o impacto de mecanismos epigenéticos em processos de evolução adaptativa é ainda bastante desconhecido, em parte, pela falta de informação sobre variação epigenética em populações naturais. Identificamos Qua-Quine Starch (QQS) de Arabidopsis thaliana como um gene sob um controle epigenético flexível e, portanto, particularmente propenso a variações epialélicas frequentes na natureza. QQS é um gene recente, que provavelmente originou-se de novo em Arabidopsis thaliana em uma região rica em elementos de transposição. Mostramos que QQS apresenta-se diferencialmente expresso entre acessos naturais assim como entre indivíduos diretamente coletados na natureza e que estas diferenças de expressão estão negativamente correlacionadas com o nível de metilação de sequências repetidas localizadas em sua região promotora e 5' UTR, não estando relacionadas a variação genética em cis ou trans. Mostramos ainda que variação epialélica em QQS é independente do nível de metilação de transposons vizinhos e que pode ser estavelmente herdada entre gerações. Considerando o impacto potencial de padrões de expressão contrastantes de QQS no metabolismo de amido, um importante componente para produção de biomassa e crescimento, sugerimos que variação epialélica em QQS possa ter implicações adaptativas. Nossos dados também apontam pela primeira vez uma ligação potencial entre mecanismos epigenéticos e o processo de evolução de genes novos. Propomos que genes novos, especialmente os de origem de novo, poderiam ser mais propensos a variar epigeneticamente, o que permite um ajuste fino de seu padrão de expressão até que o estado mais vantajoso seja fixado geneticamente / Abstract: Epigenetic modifications of DNA or chromatin control of the activity of transposable elements and can also silence genes which are associated to transposons or repetitive sequences. In plants, epigenetic alleles affecting characters such as floral morphology, flowering, stature or fruit ripening have been described, highlighting the potential of this type of regulation in generating heritable phenotypic diversity, not necessarily linked to DNA sequence alterations. However, the impact of epigenetic mechanisms in adaptative evolution is still largely unknown, in part, due to the lack of information about epiallelic variation in natural populations. We have identified Qua-Quine Starch (QQS) of Arabidopsis thaliana as a gene under flexible epigenetic control and thus particularly prone to epiallelic variation in nature. QQS is a recent gene that likely originated de novo in Arabidopsis thaliana in a transposon-rich region. We show that QQS is differentially expressed among natural accessions as well as among individuals directly sampled from the wild and that these expression differences are negatively correlated with the DNA methylation level of repeat sequences located on QQS promoter and 5'UTR region and are not correlated with cis or trans genetic variation. We also show that epiallelic variation at QQS is independent of the methylation status of nearby transposable elements and can be stably inherited across generations. Considering the potential impact of contrasting QQS expression patterns on starch accumulation, an important component of biomass production and growth, we suggest that epiallelic variation at QQS may have adaptative implications. Our data also points for the first time to a potential link between epigenetic mechanisms and the evolution of novel genes. We suggest that novel genes, more specifically those created de novo, could be endowed with an increased potential for epigenetic variation and thus for adjusting their expression pattern until the most adaptive state becomes genetically fixed / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O aborto espontâneo recorrente (AER) caracteriza-se pela ocorrência de três ou mais abortos consecutivos espontâneos até a 20ª semana de gestação. É uma condição patológica multifatorial, em que alterações morfológicas uterinas, distúrbios endócrinos, alterações no cariótipo, polimorfismos genéticos relacionados aos genes envolvidos no metabolismo da homocisteína, hemostasia, infecções, autoanticorpos e o processo inflamatório podem contribuir para a ocorrência de AER. O estado fisiológico do endométrio é essencial para a implantação do embrião no útero durante a gestação. Na interface materno-fetal, há uma modulação de citocinas, necessária para o estabelecimento da angiogênese e desenvolvimento da placenta. Um desequilíbrio entre as citocinas pode diminuir a tolerância ao feto e ocasionar rejeição fetal. A concentração de citocinas pode ser modificada por conta de uma diminuição na expressão de alguns genes, e esta pode ser regulada pelo seu estado de metilação sítio-específica. A metilação do DNA é um mecanismo epigenético de regulação gênica, e que corresponde à incorporação de grupos metila em ilhas CpG localizadas próximas às regiões promotoras de genes humanos, e isso pode ser importante na avaliação do risco de complicações gestacionais. Além disso, o estado nutricional de vitaminas foi relacionado a alterações no padrão de metilação de alguns genes. Os objetivos deste trabalho foram avaliar as concentrações dos mediadores inflamatórios em mulheres com aborto e em grupo controle, verificar correlações entre as concentrações de vitaminas, homocisteína total e taxa de metilação do DNA, verificar correlações entre concentração de citocinas e taxa de metilação do DNA e determinar odds ratio (IC 95%) de ter aborto em modelos multivariados. Foram incluídas 253 mulheres com história de aborto recorrente e 264 mulheres saudáveis (controle). O DNA foi extraído de leucócitos de sangue periférico para o estudo de metilação. Foram separadas alíquotas de soro e plasma para dosagem de vitaminas, metabólitos e citocinas. Não foram encontradas diferenças nas taxas de metilação do DNA entre os grupos aborto e controle. A citocina TNF&#945; está aumentada nos grupos de aborto em comparação ao controle. A taxa de metilação do DNA no gene IFNG foi correlacionada inversamente às concentrações de folato sérico e citocina IFN&#947; no grupo controle. E as concentrações de IL10 foram inversamente correlacionadas à taxa de metilação do DNA nos grupos de aborto secundário e controle. Neste trabalho, verificou-se que as vitaminas e as citocinas influenciam na taxa de metilação do DNA do gene IFNG e a citocina pró-inflamatória TNF&#945; apresenta-se aumentada em mulheres com história de aborto. / Recurrent spontaneous abortion (RSA) is characterized by the occurrence of three or more consecutive spontaneous abortions until the 20th week of gestation. It is a multifactorial pathological condition in which morphological uterine, endocrine disorders, changes in the karyotype genetic polymorphisms related to genes involved in homocysteine metabolism, infection, autoimmunity and inflammatory processes may contribute to the occurrence of RSA. The physiological state of the endometrium is essential for embryo implantation in the uterus during pregnancy. In maternal-fetal interface, there is a modulation of cytokines necessary for the establishment and development of placental angiogenesis. An imbalance between cytokines can decrease tolerance to fetus and cause fetal rejection. Concentration of cytokines may be modified due to a decrease in the expression of genes related to some of these cytokines that can be regulated by DNA methylation, which is an epigenetic mechanism of gene regulation and which corresponds to the incorporation of groups Methyl CpG islands located near the promoter regions of human genes, and this may be important in assessing the risk of pregnancy complications. In addition, the nutritional status of vitamins was associated with changes in the methylation pattern of certain genes. The aims of this study were to determine the concentrations of inflammatory mediators in women with abortion and the control group, examine correlations between concentrations of vitamins, total homocysteine and DNA methylation rate, examine correlations between cytokine concentration and DNA methylation and determine odds ratio (95% CI) of having abortion in multivariate models. We included 253 women with a history of recurrent miscarriage and 264 healthy women (control). DNA was extracted from peripheral blood leukocytes for the study of methylation. Serum and plasma aliquots were used for determination of vitamins, metabolites and cytokines. There were no differences in rates of DNA methylation between control and abortion groups. The cytokine TNF&#945; is increased in abortion groups compared to the control. DNA methylation rate in gene IFNG was inversely correlated with serum folate and serum cytokine IFN&#947; in the control group. Also IL10 concentrations were inversely correlated to DNA methylation rate in groups of miscarriage and secondary control. In this work, it was found that vitamins and cytokines influence DNA methylation rate in the promoter region and are different in the study and control groups.

Orientador: José Fernando Garcia / Banca: Marcos Vinicius Gualberto Barbosa da Silva / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Guilherme de Paula Nogueira / Banca: Fabiano Antonio Cadioli / Resumo: RESUMO - Uma das questões mais interessantes que poderiam ser elucidadas empregando a análise de metilação em todo o genoma é como ela afeta a regulação da temperatura corporal em animais domésticos. A resposta a esta questão torna-se imperativa, particularmente no caso de bovinos de leite e corte, uma vez que as raças modernas mais populares descendem de ancestral comum, que derivou em duas subespécies (Bos taurus e Bos indicus) as quais respondem aos estímulos ambientais de formas opostas (raças de zonas temperadas ou adaptadas a regiões tropicais, respectivamente). Mapas de metilação do DNA genômico foram originados usando a técnica de RRBS à partir de células nucleadas do sangue de um grupo de bovinos Angus e Nelore puros, expostos ao estresse ambiental condicionado pelo calor. Os dados de metilação distribuídos ao longo dos cromossomos bovinos puderam ser representados graficamente, enfatizando padrão altamente homogêneo entre as amostras analisadas e a robustez do método. A cobertura de sequenciamento empregada foi suficientemente profunda (em todos os casos superior a 20 vezes o tamanho do genoma), permitindo concluir sobre a ocorrência de eventos de metilação do DNA possivelmente associados a alterações fisiológicas causadas pelo estresse térmico. A análise da metilação do DNA revelou 4.662 janelas metiladas diferencialmente (cada uma com 1.000 pares de bases), sendo a maioria (2.695) relacionada a diferenças entre as raças e não diretamente à resposta ao estresse tér... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: ABSTRACT - One of the most interesting questions that could be solved using genome-wide methylation analysis is how it affects the regulation of body temperature in domestic animals. The answer to this question becomes imperative, particularly in the case of dairy and beef cattle, since modern breeds more frequently descended from a common ancestor, derived in two subspecies (Bos taurus and Bos indicus), which respond to environmental stimuli of different forms (breeds of temperate zones and adapted to tropical regions, respectively). Genomic maps were originated using RRBS DNA methylation data from nucleated blood cells of a group of pure Angus and Nelore cattle exposed to environmental heat strees. Methylation data distributed along the bovine chromosomes could be represented graphically, emphasizing a highly homogeneous pattern between the analyzed samples and the robustness of the method. The sequencing coverage used was sufficiently deep (in all cases higher than 20 times the genome size) leading to the identification of DNA methylation events possibly associated with physiological changes caused by heat stress. The DNA methylation analysis showed a total of 4,662 differentially methylated windows (each with 1,000 base pairs), most of them (2,695) related to differences between breeds and not to the response to heat stress. Analysis of the 214 common windows (comprising 103 genes) revealed epigenetic signals related to the heat stress response and recovery, which were ma... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Recentemente suspeitas de que mecanismos epigenéticos poderiam estar relacionados à fisiopatologia da depressão foram levantadas. Estudos recentes indicam que as alterações na transcrição gênica, induzidas por estresse ou por drogas antidepressivas, parecem envolver mecanismos epigenéticos. Nesse sentido, resultados preliminares de nosso grupo de pesquisa indicaram pioneiramente inibição global da metilação de DNA através da administração sistêmica do agente inibidor da DNA metiltransferase (DNMTs), 5-aza-2-deoxicitidina (5-azaD), induz efeito tipo-antidepressivo, dose-dependente, no modelo animal do nado forçado em ratos(Sales et al., 2011). O córtex pré-frontal medial ventral (CPFMv) é uma estrutura límbica intimamente relacionada com a neurobiologia da depressão. Evidências recentes indicam que o efeito tipo-antidepressivo aparece associado a aumento dos níveis da neurotrofina BDNF (brain derived neurotrophic factor) e de seu receptor TrkB no CPFMv, sendo a sinalização intracelular mediada pela ativação da proteína m-TOR. Contudo, não há evidências de que esses mecanismos moleculares estariam envolvidos nos efeitos induzidos pelos inibidores da metilação do DNA. Sabe-se, no entanto, que tanto o BDNF quanto TrkB têm sua expressão regulada por metilação do DNA. Diante disso, o objetivo presente trabalho será investigar a participação da via BDNF-TrkB-mTOR do CPFMv no efeito antidepressivo induzido por inibidores da metilação de DNA. Para tanto, ratos tratados com inibidores da metilação de DNA (5-azaD ou RG-108), em dois momentos diferentes (imediatamente após o PT e 23horas após o PT) foram submetidos ao teste do nado forçado (FST). Outro grupo de animais recebeu uma injeção intra-CPMv de k252a ou Rapamicina, 40 minutos antes do teste e uma injeção de BDNF intra-CPFMv, 30 minutos antes do teste. Em outro experimento, grupos independentes de animais submetidos ao nado forçado foram tratados sistemicamente com RG-108 e receberam injeção intra-CPFMv de K252a (antagonista de Trk) ou de rapamicina (inibidor da m-Tor), a fim de investigar se o efeito dessas drogas depende da via BDNF-TrkB-mTOR no CPFMv. Um grupo independente foi tratado com RG108 e CPFM desses animais foi dissecado para posterior análise da expressão de BDNF, TrkB e m-TOR, bem como da metilação de DNA. O tratamento com RG108 e 5azaD sistêmico reduziu o tempo de imobilidade dos animais submetidos ao nado forçado nos dois tempo de administração. A administração intra-CPFMv de BDNF promoveu efeito antidepressivo no FST, e esse efeito foi bloqueado pela administração de k252a ou Rapamicina no CPFMv. No mesmo sentido, o efeito antidepressivo do RG108 sistêmico foi bloqueado pela administração intra-CPFMv de k252a ou Rapamicina. Entretanto, a medida dos níveis de metilação global no CPFMv não apresentou alteração como tratamento com RG108, e também não mostrou alteração nos níveis de BDNF presente no CPF. O tratamento com RG108 não alterou a expressão, bem como a ativação de TRkB e mTOR. Concluímos que os inibidores da metilação do DNA apresentam agudamente efeito tipo antidepressivo rápido, que necessita da funcionalidade integral da via BDNF-TRkB-mTOR. Entretanto, esse efeito parece não alterar a síntese e expressão das proteínas envolvidas nessa via no que diz respeito ao CPFmv. / Recent studies indicate that changes in gene transcription induced by stress or antidepressant drugs appear to involve epigenetic mechanisms. Accordingly, results of our research group pioneered indicated global inhibition of DNA methylation through systemic administration of an inhibitor of DNA methyltransferase (DNMTs), 5-aza-2-deoxycytidine (5-AzaD), induces antidepressant-like effect dose-dependent in the animal model of forced swimming in rats (Sales et al., 2011). The ventral medial prefrontal (vmPFC) cortex is a limbic structure closely related to the neurobiology of depression. Recent evidence indicates that the antidepressant-like effect appears associated with increased levels BDNF (Brain derived neurotrophic factor) and its receptor TrkB in vmPFC, and intracellular signaling mediated by activation of protein mTOR. However, there is no evidence that these molecular mechanisms are involved in the effects induced by inhibitors of DNA methylation. It is known, however, both as BDNF and TrkB expression is regulated by DNA methylation. Thus, the goal of this work is to investigate the role of BDNF-TRkB pathway mTOR-vmPFC in the antidepressant effect induced by inhibitors of DNA methylation. To this end, rats treated with inhibitors of DNA methylation (5-Azad or RG-108), at two different times (immediately after 23hours after the PT and PT) were subjected to the forced swim test (FST). Another group received an intra-vmPFC injection of K252a or Rapamycin 40 minutes before the test, and an injection intra-vmPFC of BDNF 30 minutes before the test. In another experiment, separate groups undergoing the forced swim were treated systemically with RG-108 and received intra-vmPFC of K252a (Trk antagonist) or injection of rapamycin (m-Tor inhibitors) in order to investigate the effect these drugs depends on BDNF-TrkB-mTOR pathway in vmPFC. A separate group was treated with RG108 and mPFC these animals were dissected for analysis of the expression of BDNF and TrkB m-TOR, as well as DNA methylation. The systemic treatment whit 5azaD and RG108 reduced the immobility time of rats subjected to FST administration in both time. The intra-vmPFC BDNF administration promoted antidepressant effect in the FST, and this effect was blocked by the administration of K252a or Rapamycin in vmPFC. Similarly, the antidepressant effect of systemic RG108 was blocked by intra-vmPFC of K252a or Rapamycin administration. However, the measurement of the levels of global methylation in CPFMv did not change as treatment with RG108, and also showed no change in the levels of BDNF present in the CPF. Treatment with RG108 did not alter the expression and activation of TrkB and mTOR. We conclude that inhibitors of DNA methylation present acutely antidepressant-like effect, it needs the full functionality of the BDNF-TrkB-mTOR pathway. However, this effect seems not to alter the synthesis and expression of proteins involved in this pathway at vmPFC.

O estado de metilação é suscetível a mudanças quando os organismos são expostos a agentes ambientais tais como componentes dos alimentos e medicamentos. Uma dieta rica em metionina (Met) poderia modular a concentração de S-adenosilmetionina (SAM) e S-adenosilhomocisteína (SAH) e alterar o estado de metilação da região promotora de genes supressores de tumores. Tanto a hipometilação global quanto a hipermetilação de genes específicos estão envolvidas na instabilidade genômica e poderiam resultar em dano ao DNA. Este estudo avalia se a dieta suplementada com Met associada a doxorrubicina (DXR), um fármaco antitumoral que induz espécies reativas, resulta em alterações no estado de metilação da região promotora do gene TP53, na razão SAM/SAH, na concentração de glutationa (GSH) e em dano ao DNA. Quarenta ratos machos Wistar foram separados em dois grupos: dieta suplementada com Met (ração comercial acrescida de 2% Met) e dieta controle (ração comercial) por seis semanas. Cada grupo foi subdividido em dois subgrupos que receberam DXR (1mg/Kg) ou solução salina intraperitoneal na terceira e sexta semanas de tratamento. Os rins e fígado foram utilizados para isolamento do DNA, determinação da concentração de SAM, SAH e GSH, e análise da instabilidade genômica. Todos os grupos apresentaram o mesmo estado de metilação da região promotora do gene TP53, determinado pelo método de análise de restrição combinada com bissulfito (COBRA). Este fato poderia ser explicado pelo índice de metilação (razão SAM/SAH) que permaneceu inalterado, possivelmente devido a uma adaptação do ciclo da Met que manteve a concentração de SAM. A depleção de GSH não ocorreu quando DXR foi associada a dieta suplementada com Met. Portanto, a suplementação com Met manteve a concentração de GSH em ratos tratados com DXR. A dieta suplementada com Met não induziu instabilidade genômica e não alterou o dano ao DNA induzido pela DXR. Em conclusão, DXR induz depleção de GSH que é inibida pela suplementação com Met. Entretanto, a mesma suplementação não previne a instabilidade genômica induzida pela DXR. A dieta suplementada com Met aumenta a concentração de SAH renal sem alterar a concentração de SAM e GSH. Tanto a dieta suplementada quanto a DXR não induzem hipermetilação na região promotora do gene TP53. / The DNA methylation status is susceptible to changes when organisms are exposed to environmental agents such as food components and drugs. A methionine-rich (Met) diet may modulate S-adenosylmethionine (SAM) and S-adenosylhomocysteine (SAH) concentrations, which could change the DNA methylation status in the promoter region of tumor suppressor genes. Global hipomethylation and gene-specific hipermethylation are involved in genomic instability and it could result in DNA damage. This study intends to evaluate if a Met-rich diet associated with doxorubicin (DXR), an antitumoral drug that induces reactive species, result in changes in the methylation status of the TP53 gene promoter, in the SAM/SAH ratio, in glutathione levels (GSH) and in DNA damage. Forty male Wistar rats were separated into two groups: Met-rich diet (standard chow plus 2% Met), and control diet (standard chow) for six weeks. Each group was subdivided into another two groups that received DXR (1mg/kg) or saline intraperitoneally in the third and sixth weeks of the experiment. The kidneys and the liver were removed for DNA isolation, SAM, SAH and GSH determination, and genomic instability assay. All groups showed the same unmethylated status in the TP53 promoter according to the Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA). This could be explained by the fact that the methylation index (SAM/SAH ratio) remained unchanged, possibly because of an adaptive Met pathway that maintains SAM levels. GSH depletion did not occur when DXR was associated with the Met-rich diet. As a matter of fact, the Met-rich diet improved GSH concentration in DXR-treated rats. Met-rich diet did not induce genomic instability, and it did not alter DNA damage induced by DXR. In conclusion, DXR induces GSH depletion which is inhibited by Met supplementation. However, Met-rich diet may not prevent genomic instability induced by DXR. A Met-rich diet increases SAH levels; however, it does not change GSH and SAM levels. Neither Met supplementation nor DXR induced DNA hypermethylation in the TP53 gene promoter.

INTRODUÇÃO: A expansão e disseminação do consumo de crack e cocaína no Brasil vem se tornando um grave problema de saúde pública nos últimos vinte anos. Diferentes abordagens biológicas têm sido investigadas utilizando o fenótipo de abuso/dependência de crack/cocaína, cujos resultados têm demonstrado a participação importante do substrato genético, assim como a sua interação com os fatores ambientais no desenvolvimento desse transtorno. OBJETIVOS: Investigar o padrão de metilação do DNA do genoma de indivíduos que apresentam abuso/dependência de cocaína e de crack, comparando ao padrão de metilação de indivíduos controles. MÉTODOS: Foram selecionados 24 dependentes de cocaína e crack e 24 controles saudáveis, pareados por sexo e idade. Utilizando amostras de DNA extraídas de sangue periférico de cada um dos participantes, foi realizada a técnica de metilação global com o ensaio Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) BeadChip. Os resultados iniciais foram normalizados considerando a heterogeneidade celular e analisados utilizando o pacote ChAMP (Chip Analysis Methylation Pipeline) para identificar genes e/ou regiões gênicas diferencialmente metiladas que possam representar fatores de vulnerabilidade para o comportamento de abuso/dependência do crack e da cocaína. Os processos biológicos e vias celulares com os quais os sítios diferencialmente metilados estão envolvidos foram explorados usando as ferramentas disponibilizadas pelo \"WebGestalt\" e pelo \"UCSC Genome Browser\". RESULTADOS: Foram observados 250 sítios diferencialmente metilados, associados a 246 genes na comparação dos perfis de metilação entre os casos e controles, sendo que 49% destes estavam localizados nas regiões promotoras dos genes, sugerindo que esses sítios podem estar relacionados com a expressão gênica. Alterações estatisticamente significantes no padrão de metilação entre casos x controles foram observadas em 23 sítios CpG (p-valor ajustado < 10-5 e |?beta| = 0,1). Observou-se também que três regiões diferencialmente metiladas foram associadas a genes hipometilados (BMP8A, GPR88 e RNF166) (p-valor ajustado < 0.05), cada uma com pelo menos três sítios. Alterações estatisticamente significantes também foram observadas em seis genes hiper-representados: CALCA, NCOA2, DRD2, EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, envolvidos em processos biológicos e moleculares. CONCLUSÕES: Observou-se diferenças estatisticamente significativas no padrão de metilação genômico de usuários/dependentes de crack e cocaína quando comparados aos controles saudáveis em amostra de DNA extraídas de sangue periférico. Comparação de estudos de expressão em tecido cerebral correlacionaram-se parcialmente com os achados apresentados. Outros estudos utilizando amostras independentes são necessários para confirmar esses achados. A confirmação desses resultados poderá contribuir na identificação e compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos na dependência do crack/cocaína / BACKGROUND: The expansion and dissemination of crack and cocaine in Brazil has become a progressive and serious public health problem during the last twenty years. Different biological approaches have been investigated using the crack/cocaine abuser/dependent phenotype, with results confirming the important role of the genetic component, as well as its interaction with environmental factors. OBJECTIVES: To investigate the DNA methylation pattern levels in the genome of individuals with crack and cocaine abuse/dependence and comparing it with the DNA methylation pattern of the genome of control subjects. METHODS: 24 crack and cocaine abusers/dependents and 24 healthy controls were selected and matched by sex and age. Using DNA samples from peripheral blood of each participant, a global methylation technique was performed using the Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) Bead Chip assay. The initial results were normalized for cellular heterogeneity and re-analyzed using ChAMP package (Chip Methylation Analysis Pipeline) to identify differentially methylated genes or/and DNA regions that may represent biological/genetic risk factors for crack and cocaine abuse/dependence behavior. The biological processes and cellular pathways were explored using tools provided by \"WebGestalt\" and \"UCSC Genome Browser\". RESULTS: 250 differentially methylated sites associated with 246 genes in methylation comparison profiles between cases and controls were identified, of which almost half were located in the promoter regions of genes (49%), suggesting that these sites may be related to gene expression. Statistically significant changes in the methylation patterns between cases and controls were observed in 23 CpG sites (adjust p-value < 10-5 and |deltabeta| = 0.1). In addition, three differentially methylated regions were associated with hipomethylated genes (BMP8A, GPR88 e RNF166) (adjust p-value < 0.05), each one with at least three sites. Statistically significant changes were also observe with six hiper-represented genes: CALCA, NCOA2, DRD2, EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, which are involved in biological and molecular processes. CONCLUSIONS: Crack and cocaine users/dependents presented significant statistical differences in the methylation pattern when compared to healthy controls in DNA samples extracted from peripheral blood. Results from gene expression studies using brain tissue can be correlated with our results. In order to confirm the present findings, future studies should be replicated using independent samples. The confirmation of these results will contribute to the understanding of the biological mechanisms involved in crack/cocaine dependence

O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental (paterna ou materna), está envolvido no desenvolvimento placentário. Na região cromossômica 11p15.5 encontram-se vários genes importantes para o desenvolvimento fetal e da placenta, os quais são regulados por duas principais regiões controladoras de imprinting (ICR1 e 2) onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1, respectivamente. O imprinting genômico e a inativação aleatória do cromossomo X são processos epigenéticos presentes em mamíferos placentários. O presente trabalho teve como objetivo principal verificar a presença de mosaicismo do perfil epigenético entre tecidos extraembrionários de estágios precoces da gravidez (primeiro trimestre), e em vilosidade coriônica de placentas a termo (terceiro trimestre). Foram coletadas amostras de 10 gestações de primeiro trimestre (vilosidade coriônica, âmion, membrana de cordão umbilical e tecido embrionário) e 14 de terceiro trimestre (vilosidade coriônica), das quais 10 foram consideradas como controles e quatro utilizadas para estudo de mosaicismo restrito à vilosidade coriônica (coleta de amostras de todos os cotilédones). Após extração do DNA, foi utilizado o Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real para o estudo do padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em diferentes tecidos do primeiro trimestre gestacional e em tecido placentário do terceiro trimestre. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado em todos os cotilédones de duas placentas a termo, de fetos do sexo feminino, por meio do ensaio do receptor de andrógeno humano (HUMARA assay), utilizando eletroforese capilar, e com acréscimo de um novo marcador de inativação do cromossomo X (ICX1). Na análise estatística foram utilizados o teste t não pareado, teste de Turkey e teste t pareado. A média de metilação da KvDMR1 das amostras de vilosidade coriônica do primeiro trimestre gestacional foi estatisticamente diferente da média de metilação do terceiro trimestre. Enquanto que a metilação da H19DMR não apresentou diferença estatística entre amostras de vilosidade coriônica do primeiro e do terceiro trimestre gestacionais. Com relação ao mosaicismo, a KvDMR1 não apresentou variação com relação ao tamanho ou a posição dos cotilédones, enquanto que a H19DMR apresentou diferença estatisticamente significativa na média de metilação com relação ao tamanho dos cotilédones e ao posicionamento nos quadrantes; em consequência da hipometilação em cotilédones pertencentes a uma das placentas estudadas. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na média de metilação da KvDMR1 e da H19DMR entre diferentes tecidos das amostras do primeiro trimestre gestacional. No entanto, a comparação entre tecidos pareados de um mesmo indivíduo mostrou que a metilação não é correspondente entre os tecidos. Os dados obtidos mostram que o imprinting genômico provavelmente é um processo dinâmico, que evolui ao longo da gestação, estando relacionado a formação e ao amadurecimento da placenta. No presente estudo foi possível verificar que cotilédones de uma mesma placenta apresentam diferentes padrões de inativação do cromossomo X. Diferenças que podem ser explicadas pela expansão clonal das células trofoblásticas progenitoras com o cromossomo X paterno ou o cromossomo X materno inativo. Devido à variabilidade epigenética, exames em tecidos placentários devem considerar as diferenças intra-placentárias e as diferenças entre tecidos embrionários e extraembrionários. / Genomic imprinting, a mechanism of allele-specific expression depending on parental origin, is an epigenetic process that regulates the expression of many genes involved in placental development. Several important genes for fetal and placental growth are located on the human chromosome region 11p15.5, which are regulated by two imprinting control regions (ICR1 e 2), which have the differentially methylated regions H19DMR and KvDMR1, respectively. Genomic imprinting and random inactivation of X chromosome are two epigenetic processes present in placental mammals. The present study aimed to verify the presence of epigenetic mosaicism between extra-embryonic and embryonic tissues from early stages of pregnancy (first trimester), and in chorionic villi of term placentas (third trimester). Samples were collected from 10 pregnancies in the first trimester (chorionic villous, amnion, umbilical cord membrane, and embryonic tissue) and 14 from third trimester (chorionic villus sampling), of which 10 were considered as controls and four used to study mosaicism restricted to chorionic villi (sampling of all cotyledons). After DNA extraction, we used real time PCR associated to enzymatic restriction with a methylation sensitive enzyme to study the methylation pattern of KvDMR1 and H19DMR in different tissues from first trimester and placental third trimester tissue. The pattern of X chromosome inactivation was evaluated in all cotyledons from two term placentas of female fetuses, using the human androgen receptor (HUMARA) assay, capillary electrophoresis, and adding a new X chromosome inactivation (ICX1) marker. Unpaired and paired t and Turkey tests were used in statistical analysis. The average methylation of KvDMR1 of chorionic villi samples in first trimester was statistically different from average methylation of the third trimester. While the methylation of H19DMR showed no statistically significant difference between chorionic villi samples in the first and third trimester of pregnancy. In relation to the mosaicism, the KvDMR1 methylation did not vary in respect to the size or position of the cotyledons, while H19DMR showed statistically significant difference in average methylation relative to the size of the cotyledons, to the position in quadrants, due to the hypomethylation in cotyledons from one studied placenta. There were no statistically significant differences in the mean methylation KvDMR1 and H19DMR among different tissues from the first trimester of pregnancy, however, the comparison between paired tissues from the same individual showed that the methylation is different between tissues. The data from this study showed that genomic imprinting is probably a dynamic process and evolved across human pregnancy. This process is probable connected to placenta formation and maturation. We observed different patterns of X chromosome inactivation in cotyledons from the same placenta. This difference could be explained by clonal expansion of a limited number of trophoblastic progenitor cells with either an inactive maternal or paternal X chromosome. Due to the epigenetic variability, placental tissue examinations must consider the differences intra-placental and differences between embryonic and extra-embryonic tissues.

Estudos recentes têm revelado que uma fração significativa do transcriptoma de eucariotos é composta por RNAs não codificadores longos (lncRNAs). Este trabalho investigou o padrão de expressão de um conjunto de lncRNAs originados a partir de regiões intrônicas de genes codificadores de proteínas em três linhagens celulares tumorais humanas utilizando microarranjos de DNA customizados. Realizamos uma série de análises in silico com a perspectiva de identificar propriedades globais desses transcritos, tais como a abundância relativa em diferentes tecidos, características evolutivas, estruturais e regulatórias, além de possíveis funções celulares. Avaliamos também a contribuição da metilação do DNA, um mecanismo de silenciamento epigenético da expressão de genes codificadores de proteínas, na regulação da expressão de lncRNAs intrônicos. Observamos que uma fração dos lncRNAs intrônicos detectados nas linhagens estudadas são conservados evolutivamente, tem padrão de expressão tecido específico, e está enriquecida em elementos regulatórios na sua extremidade 5\'. Foram identificados subconjuntos de lncRNAs intrônicos possivelmente atuando sobre genes associados a vias regulatórias importantes para o controle do desenvolvimento de organismos e ciclo celular. Comparativamente a mRNAs, uma menor proporção de lncRNAs intrônicos possui ilhas CpGs (CGIs) na vizinhança de seu início de transcrição. Apesar disso, observamos que um subconjunto desses transcritos teve sua expressão sensível ao tratamento com o agente desmetilante de DNA 5-AZA, demonstrando que lncRNAs intrônicos transcritos podem estar sujeitos a regulação transcricional mediada por metilação do DNA. Dentre os lncRNAs intrônicos regulados por metilação do DNA, destaca-se o lncRNA AS-APP, cuja expressão aumentou em 25 a 80 vezes nas linhagens celulares DU-145 e HEK293, respectivamente, após tratamento com 5-AZA. Este lncRNA possui uma CGI metilada e um promotor ativo a cerca de 4 kb de distância do seu início de transcrição conhecido. O aumento da transcrição do lncRNA AS-APP após desmetilação do DNA correlacionou-se a uma diminuição significativa dos níveis de expressão do mRNA do gene APP. Este resultado sugere uma possível ação regulatória em cis do lncRNA AS-APP no locus APP, um importante gene envolvido na doença de Alzheimer e com expressão associada ao prognóstico de alguns tipos de câncer. Os resultados obtidos neste trabalho reforçam a ideia de que lncRNAs intrônicos constituem unidades transcricionais independentes que se encontram sobre controle regulatório nos diferentes tipos celulares. Foi gerado também um catálogo de lncRNAs intrônicos regulados por metilação que permitirá a seleção de candidatos com maior potencial de relevância funcional para caracterização detalhada. / Recent studies have revealed that a significant fraction of the eukaryotic transcriptome is composed of long noncoding RNAs (lncRNAs). This work investigated the expression pattern in three human tumor cell lines of a set of lncRNAs originated from intronic regions of protein coding RNAs, using custom DNA oligoarrays. In silico analyses were performed to identify global properties of these transcripts such as relative abundance in different human tissues, regulatory, evolutionary and structural aspects, as well as their possible cellular functions. In addition, we evaluated the contribution of DNA methylation, an important epigenetic mechanism that control the expression of protein coding genes, in the regulation of intronic lncRNAs expression. We found that a fraction of the intronic lncRNAs detected in the cell lines are evolutionarily conserved, show a tissue specific expression pattern, and is enriched in regulatory elements at their 5\' end region. Subsets of intronic lncRNAs possibly acting on genes associated to important regulatory pathways controlling organism development and cell cycle were identified. A smaller proportion of intronic lncRNAs relative to mRNAs displayed CpG islands (CGI) in the vicinity of the transcription start site. Notwithstanding, we observed that a subset of these transcripts responded to treatment with the DNA demethylation agent 5-AZA, demonstrating that intronic lncRNAs may be under transcriptional regulation mediated by DNA methylation. Among intronic lncRNAs regulated by DNA demethylation, stands out AS-APP lncRNA, which was up regulated 25 to 80 times in DU-145 and HEK293 cell lines following 5-AZA treatment, respectively,. This lncRNAs has a methylated CGI and an active promoter at 4-kb upstream from its known transcription start site. Increased AS-APP lncRNA transcription following DNA demethylation correlated with a significant decrease of APP gene messenger RNA levels. This finding suggests a possible cis-regulatory action of the lncRNA AS-APP in the APP locus, an important gene involved in Alzheimer disease and whose expression is associated with prognosis of different cancer types. The results obtained in this study reinforce the idea that intronic lncRNAs constitute independent transcriptional units under regulatory control in the different cell types. It was generated a catalog of intronic lncRNAs regulated by DNA methylation that will allow the selection of candidates with higher potential of functional relevance for detailed characterization

O nucléolo é uma organela subnuclear formada pela atividade transcricional dos genes ribossomais 18S-5.8S-26S (rDNA 45S) e consequente biogênese dos ribossomos. A atividade destes genes resulta na região organizadora do nucléolo (NOR), na forma de uma constrição secundária em cromossomos metafásicos. As constrições secundárias se condensam progressivamente durante a mitose e se descondensam ao final da telófase quando a reestruturação do nucléolo se inicia. Genomas que apresentam mais de um locus de rDNA 45S deve apresentar, obrigatoriamente, pelo menos um par de NORs, enquanto os demais loci poderão ou não serem expressos. O controle da expressão dos genes ribossomais e a formação da cromatina nucleolar são modulados por eventos epigenéticos. Embora alguns pontos sobre o funcionamento dos genes ribossomais e a formação do nucléolo estejam bem estabelecidos, questões como o padrão de condensação da cromatina nucleolar durante a mitose, o padrão de funcionamento de sítios adicionais de genes ribossomais, o papel das modificações epigenéticas na dinâmica da cromatina nucleolar e na expressão do rDNA 45S e o mecanismo de herança dos genes ativos, permanecem abertas. A espécie Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae), com 2n=2x=16 cromossomos, que possui um locus de rDNA 45S no braço curto do cromossomo 1, que sempre forma constrição secundária, e um sítio adicional com atividade facultativa no braço curto do cromossomo 4, é um excelente modelo para o estudo destas questões. No contexto apresentado, foram estudadas a dinâmica de condensação das NORs durante o ciclo celular e sua correlação com a atividade dos genes ribossomais, incluindo o locus adicional, e ainda o papel da metilação da citosina do DNA durante estes processos. Os resultados demonstram que a cromatina da região organizadora do nucléolo segrega em um estado descondensado durante a mitose, na forma de constrição secundária, ou seja, tal estrutura não se condensa durante a metáfase e não volta a se distender no início da telófase. Aparentemente, o que causa correlações equivocadas entre a atividade nucleolar e a observação morfológica da constrição secundária na metáfase é a contração forçada da cromatina da NOR causada por agentes antimitogênicos. Este modelo de segregação em um estado aberto pode ser explicado pela descrição de diversas proteínas que permanecem diretamente ligadas ou indiretamente associadas à região da NOR durante a mitose, funcionando como uma barreira física para a compactação. Ambos os sítios, principais e adicionais, do rDNA 45S presentes em Crotalaria juncea apresentam atividade transcricional, embora o locus do cromossomo 4 mostre atividade facultativa. Ao contrário do que foi anteriormente proposto, uma vez ativo, o locus adicional permanece descondensado durante todo o ciclo mitótico, seguindo o mesmo comportamento dos sítios principais. As constrições secundárias e a cromatina nucleolar são hipermetiladas em nível citológico, independentemente de sua atividade. A aparente hipometilação observada no rDNA 45S em cromossomos mitóticos e núcleos interfásicos se deve ao menor grau de compactação da região organizadora do nucléolo e, consequentemente, à baixa densidade de cromatina. / The nucleolus is a subnuclear organelle formed as a result of transcriptional activity of ribosomal RNA genes 18S-5.8S-26S (45S rDNA) and subsequent ribosome biogenesis. This activity forms the nucleolar organizing region (NOR) as a secondary constriction in metaphase chromosomes. The secondary constrictions progressively condense during mitosis and decondense at the end of telophase, when nucleoli start to reassemble. Genomes presenting more than one 45S rDNA locus must have at least one pair of NOR bearing chromosomes, while other loci may be expressed or not. Ribosomal gene expression and nucleolar chromatin assembly are modulated by specific epigenetic events. Although some topics related to rDNA gene activity and nucleolus formation are well understood, questions such as the behavior of nucleolar chromatin condensation during mitosis, standard functions associated with rDNA additional sites, role of epigenetic modifications in nucleolar chromatin and 45S rDNA expression processes, and inheritance mechanism of active genes, remain to be solved. Crotalaria juncea (Leguminosae - Papilionoideae) has 2n=2x=16 chromosomes and carries a 45S rDNA locus at the short arm of chromosome 1, always presenting a secondary constriction, and an additional site with facultative activity at the short arm of chromosome 4, being an excellent model to resolve these questions. Thus, this study aimed to study NOR condensation dynamics during the cell cycle and its correlation with ribosomal gene activity, including the additional locus, while analyzing the role of rDNA cytosine methylation during this process. The results show that NOR chromatin segregate in a decondensed way throughout mitosis, as a secondary constriction. In other words, this structure does not condense during metaphase and the NOR is not reassembled at the beginning of telophase. Misinterpretations relating nucleolar activity with morphological observations of secondary constrictions, appear to be induced by the artificial contraction of NOR chromatin caused by antimitotic drugs. This segregation model in an open state may be supported by strong diversity of proteins that are maintained attached to NORs during mitosis, serving as a physic barrier for condensation. Both principal and additional 45S rDNA sites of C. juncea are transcriptionally active, although the additional locus in chromosome 4 presented facultative activity depending upon ribosomal request. Unlike what was previously proposed, once the additional site is activated, it remains in an open configuration throughout the cell cycle, similarly to principal site behavior. Secondary constrictions and nucleolar chromatin are hypermethylated at cytological level, regardless of their activity. The seeming hipomethylated state of 45S rDNA in interphase nucleus and mitotic chromosomes is due to a lower compaction level of nucleolar organizing regions and subsequent low chromatin density.