Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T17:16:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Aline Almeida Barbaresco D'Alessandro - 2014.pdf: 3202318 bytes, checksum: bef7dce7cab9c3b56900a9c2d14f4a49 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T17:41:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Aline Almeida Barbaresco D'Alessandro - 2014.pdf: 3202318 bytes, checksum: bef7dce7cab9c3b56900a9c2d14f4a49 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-29T17:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Aline Almeida Barbaresco D'Alessandro - 2014.pdf: 3202318 bytes, checksum: bef7dce7cab9c3b56900a9c2d14f4a49 (MD5) Previous issue date: 2014-04-08 / The human papillomavirus (HPV) is a major etiologic factor in the development of cervical cancer, DNA virus primarily infects the epithelium and may induce benign and malignant lesions of the mucous membranes and skin. Carcinogenesis is a multistep process that involves both changes genetic and epigenetic. The two changes epigenetic most studied are DNA methylation and histone acetylation. DNA methylation may be related development to cancer, and their presence or absence can affect the prognosis. The objective of this study was to evaluate the prognosis of patients with cervical cancer in stages I and II through the verification of HPV high and low risk, and the presence and absence of genes methylated and unmethylated RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT. We analyzed 129 records and samples of paraffin embedded biopsies of patients with cervical cancer in stages I and II. Detection of HPV - DNA was performed by PCR for HPV DNA of low and high oncogenic risk and MSP-PCR to detect the genes methylated or not, RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT. The calculation of survival used the Kaplan-Meier method and the log-hank test to compare means of survival between the prognostic factors for cervical cancer. The overall survival at 60 months of patients with the presence of RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT methylated or not were: 100%, 90.0%, 85.7%, 92.5%, respectively, and survival free of disease were 100%, 85.7%, 100%, 100%, respectively. The presence and absence of genes did not affect the overall and disease-free survival. The prevalence of HPV of low risk patients was 45% (58/129) and the high-risk HPV was 76% (98/129). Regarding the analysis to evaluate the existence of statistical relationships between the presence and absence of genes methylated or not, RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT with variables clinical and HPV, it was found that there were no significant differences in the presence and the absence of genes the methylated or not in relation to the distribution of variables. The study demonstrated that the absence and presence of genes methylated or not, RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT, did not influence the prognosis of patients suffering from cervical cancer in stages I and II. / O papilomavírus humano (HPV) é um importante fator etiológico no desenvolvimento do câncer cervical, o DNA viral infecta principalmente o epitélio e pode induzir lesões benignas e malignas das membranas de mucosa e pele. A carcinogênese é um processo de múltiplas etapas que envolvem tanto mudanças genéticas quanto epigenéticas. As duas mudanças epigenéticas mais estudadas são a metilação do DNA e acetilação das histonas. A metilação do DNA pode estar relacionada com o desenvolvimento do câncer, e a sua presença e ausência pode afetar no prognóstico. O objetivo deste estudo foi avaliar o prognóstico das pacientes portadoras de câncer cervical nos estádios I e II por meio da verificação de HPV de baixo e alto risco e da presença e ausência dos genes metilados e não metilados RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT. Foram analisados 129 prontuários e amostras de biópsias parafinizadas das pacientes portadoras de câncer cervical nos estádios I e II. A detecção do DNA – HPV foi realizada por PCR para detectar o DNA do HPV de baixo e alto risco oncogênico e a MSP-PCR para detectar os genes metilados ou não, RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT. O cálculo de sobrevida utilizou-se o método de Kaplan-Meier e o teste de log-hank para comparação das médias de sobrevida entre os fatores prognósticos para câncer cervical. As sobrevidas globais aos 60 meses das pacientes com a presença de RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT metilado ou não foram de: 100%, 90,0%, 85,7%, 92,5%, respectivamente, e as sobrevidas livre de doença foram de 100%, 85,7%, 100%, 100%, respectivamente. A presença e ausência dos genes não interferiram nas sobrevidas global e livre de doença. A prevalência de HPV de baixo risco das pacientes foi de 45 % (58/129) e o HPV de alto risco foi de 76 % (98/129). Em relação as análises para avaliar a existência de relações estatísticas entre a presença e a ausência dos genes metilados ou não, RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT com as variáveis clínicas e do HPV, verificou-se que não houveram diferenças significativas com a presença e a ausência dos genes metilados ou não em relação com as distribuições das variáveis. O estudo demonstrou que a ausência e presença dos genes metilados ou não, RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT, não influenciaram no prognóstico das pacientes portadoras do câncer cervical nos estádios I e II.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-03-16T14:51:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-03-16T14:51:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-16T14:51:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2017-11-25 / Introduction: The colloid goiter (CG) is a heterogeneous disorder and represents the main cause of benign thyroid nodule. Prevalent in geographical areas with iodine deficiency, in most cases carried out expectant conduct or surgically. Classified according to the morphological and functional characteristics, it may present as diffuse or nodular, toxic or nontoxic (with or without functional autonomy). Can reach large volume and compression of neck structures or even turn into malignant disease. Dependent on environmental and genetic factors, with iodine deficiency being the main determinant for the impact on incidence, other environmental and hereditary factors are listed, but little is known about the molecular pathogenesis. Objectives: To map the Epigenetic alterations of the five different surgical parts of CG from patients submitted to total thyroidectomy in Manaus, Amazonas, to analyze, compare and describe the specific pattern for this population. Methods: Five specimens of CG with histopathological confirmation were obtained from the “Normal Thyroid Tissue Bank and with Goiter” from the UFAM. Were used to identify the global methylation patterns of DNA and histone 3 in trimethylated lysine 4, 9 and 27 (H3K4me3, H3K9me3 and H3K27me3). Was used an ELISA type specific immunoassay method, with the results compared between the patients, between the different region of the gland in the same individual and between the individuals. Results: there was no evidence there were significant differences (5%) in the mean global DNA methylation patterns between the patients (p = 0.114) or between the thyroid regions (p = 0.843) considered similar. The mean pan-methylation patterns of histones H3K4me3, H3K9me3 and H3K27me3 are significantly different among patients (p <1%), although there were no significant differences between parts in the same individual (p> 5%). Conclusion: The results of the analyzes of this study revealed that CG parts obeyed a pattern of distribution of significant DNA hypermethylation between patients and parts of CG, differing only among patients the pattern of histone methylation. As these findings are more common in cancer, we may suggest that at the epigenetic level CG may have some common etiologic factor that leads to this tissue response or that responds by phenotypic expressions and malignant transformation. There are now no efficient markers that accurately detect the risk of CG malignancy, much less the possibility of defining its tissue progression, it is very likely that multiple genes will participate in this process. Therefore, the findings found in these patients may make way for the future application of the CG epigenetic study, which may imply the viability of new therapeutic or preventive forms of progression, since the methylation status can be reversed, but other studies in the population are needed to understand better those finding. / Introdução: O bócio coloide (BC) constitui numa desordem heterogênea e representa a principal causa de nódulo benigno da tireoide. Prevalente em áreas geográficas com deficiência de iodo, sendo, na maioria dos casos, conduzido de forma expectante ou cirúrgica. Classificado de acordo com as características morfológicas e funcionais, pode se apresentar difuso ou nodular, tóxico ou atóxico (com ou sem autonomia funcional), podendo alcançar grandes volumes e ocasionar compressão de estruturas do pescoço, ou, não muito raramente, sofrer transformação maligna. Dependente de fatores ambientais e genéticos, com a deficiência de iodo sendo o principal fator determinante para o impacto na incidência, outros fatores ambientais e hereditários são arrolados, porém pouco se conhece da patogênese molecular. Objetivos: mapear as alterações epigenéticas de diferentes regiões de 05 espécies cirúrgicas de BC de pacientes submetidos a tireoidectomia total em Manaus, Amazonas, com o objetivo de analisar, comparar e descrever o padrão específico para esta população. Metodologia: Foram utilizados 05 espécimes de BC com confirmação histopatológica, provenientes do “Banco de Tecidos de Tireoide Normal e com Bócio” da UFAM, e para identificar os padrões de metilação global do DNA e da histona 3 na lisina trimetiladas 4, 9 e 27 (H3K4me3, H3K9me3 e H3K27me3) foram utilizados método de imunoensaio específico do tipo ELISA, com os resultados comparados entre as pacientes, entre as diferentes regiões da glândula num mesmo indivíduo e entre os indivíduos. Resultados: não houveram evidências de que existam diferenças significativas (ao nível de 5%) dos padrões médios de metilação global do DNA entre os pacientes (p = 0,114), ou entre as regiões da tireoide (p = 0,843), sendo, portanto, consideradas similares. Os padrões médios de pan-metilação das histonas H3K4me3, H3K9me3 e H3K27me3 são significativamente diferentes entre os pacientes (p < 1%), apesar de não apresentar diferenças significativas entre as regiões num mesmo indivíduo, (p > 5%). Conclusão: Os resultados das análises deste estudo, revelou que os espécimes de BC obedeceram a um padrão de distribuição de hipermetilação do DNA significativa entre os pacientes e as regiões do BC, diferindo somente entre os pacientes o padrão de metilação das histonas. Como estes achados são mais comuns no câncer, podemos sugerir que em nível epigenético, o BC possa ter algum fator etiológico comum que leve a esta resposta tecidual ou que responda pelas expressões fenotípicas e transformação maligna. Como, até o momento, não existem marcadores eficientes que detecte com precisão a existência de risco de malignização do BC, muito menos a possibilidade de definir sua progressão tecidual, é muito provável que participem múltiplos genes neste processo. Portanto, os achados encontrados nestas pacientes podem abrir caminho na aplicação futura do estudo epigenético do BC, podendo implicar na viabilização de novas formas terapêuticas ou preventivas da progressão, uma vez que, o status de metilação pode ser revertido, porém outros estudos ampliados na população em questão são necessários para entender melhor estes achados.

O estado de metilação é suscetível a mudanças quando os organismos são expostos a agentes ambientais tais como componentes dos alimentos e medicamentos. Uma dieta rica em metionina (Met) poderia modular a concentração de S-adenosilmetionina (SAM) e S-adenosilhomocisteína (SAH) e alterar o estado de metilação da região promotora de genes supressores de tumores. Tanto a hipometilação global quanto a hipermetilação de genes específicos estão envolvidas na instabilidade genômica e poderiam resultar em dano ao DNA. Este estudo avalia se a dieta suplementada com Met associada a doxorrubicina (DXR), um fármaco antitumoral que induz espécies reativas, resulta em alterações no estado de metilação da região promotora do gene TP53, na razão SAM/SAH, na concentração de glutationa (GSH) e em dano ao DNA. Quarenta ratos machos Wistar foram separados em dois grupos: dieta suplementada com Met (ração comercial acrescida de 2% Met) e dieta controle (ração comercial) por seis semanas. Cada grupo foi subdividido em dois subgrupos que receberam DXR (1mg/Kg) ou solução salina intraperitoneal na terceira e sexta semanas de tratamento. Os rins e fígado foram utilizados para isolamento do DNA, determinação da concentração de SAM, SAH e GSH, e análise da instabilidade genômica. Todos os grupos apresentaram o mesmo estado de metilação da região promotora do gene TP53, determinado pelo método de análise de restrição combinada com bissulfito (COBRA). Este fato poderia ser explicado pelo índice de metilação (razão SAM/SAH) que permaneceu inalterado, possivelmente devido a uma adaptação do ciclo da Met que manteve a concentração de SAM. A depleção de GSH não ocorreu quando DXR foi associada a dieta suplementada com Met. Portanto, a suplementação com Met manteve a concentração de GSH em ratos tratados com DXR. A dieta suplementada com Met não induziu instabilidade genômica e não alterou o dano ao DNA induzido pela DXR. Em conclusão, DXR induz depleção de GSH que é inibida pela suplementação com Met. Entretanto, a mesma suplementação não previne a instabilidade genômica induzida pela DXR. A dieta suplementada com Met aumenta a concentração de SAH renal sem alterar a concentração de SAM e GSH. Tanto a dieta suplementada quanto a DXR não induzem hipermetilação na região promotora do gene TP53. / The DNA methylation status is susceptible to changes when organisms are exposed to environmental agents such as food components and drugs. A methionine-rich (Met) diet may modulate S-adenosylmethionine (SAM) and S-adenosylhomocysteine (SAH) concentrations, which could change the DNA methylation status in the promoter region of tumor suppressor genes. Global hipomethylation and gene-specific hipermethylation are involved in genomic instability and it could result in DNA damage. This study intends to evaluate if a Met-rich diet associated with doxorubicin (DXR), an antitumoral drug that induces reactive species, result in changes in the methylation status of the TP53 gene promoter, in the SAM/SAH ratio, in glutathione levels (GSH) and in DNA damage. Forty male Wistar rats were separated into two groups: Met-rich diet (standard chow plus 2% Met), and control diet (standard chow) for six weeks. Each group was subdivided into another two groups that received DXR (1mg/kg) or saline intraperitoneally in the third and sixth weeks of the experiment. The kidneys and the liver were removed for DNA isolation, SAM, SAH and GSH determination, and genomic instability assay. All groups showed the same unmethylated status in the TP53 promoter according to the Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA). This could be explained by the fact that the methylation index (SAM/SAH ratio) remained unchanged, possibly because of an adaptive Met pathway that maintains SAM levels. GSH depletion did not occur when DXR was associated with the Met-rich diet. As a matter of fact, the Met-rich diet improved GSH concentration in DXR-treated rats. Met-rich diet did not induce genomic instability, and it did not alter DNA damage induced by DXR. In conclusion, DXR induces GSH depletion which is inhibited by Met supplementation. However, Met-rich diet may not prevent genomic instability induced by DXR. A Met-rich diet increases SAH levels; however, it does not change GSH and SAM levels. Neither Met supplementation nor DXR induced DNA hypermethylation in the TP53 gene promoter.

Recentemente suspeitas de que mecanismos epigenéticos poderiam estar relacionados à fisiopatologia da depressão foram levantadas. Estudos recentes indicam que as alterações na transcrição gênica, induzidas por estresse ou por drogas antidepressivas, parecem envolver mecanismos epigenéticos. Nesse sentido, resultados preliminares de nosso grupo de pesquisa indicaram pioneiramente inibição global da metilação de DNA através da administração sistêmica do agente inibidor da DNA metiltransferase (DNMTs), 5-aza-2-deoxicitidina (5-azaD), induz efeito tipo-antidepressivo, dose-dependente, no modelo animal do nado forçado em ratos(Sales et al., 2011). O córtex pré-frontal medial ventral (CPFMv) é uma estrutura límbica intimamente relacionada com a neurobiologia da depressão. Evidências recentes indicam que o efeito tipo-antidepressivo aparece associado a aumento dos níveis da neurotrofina BDNF (brain derived neurotrophic factor) e de seu receptor TrkB no CPFMv, sendo a sinalização intracelular mediada pela ativação da proteína m-TOR. Contudo, não há evidências de que esses mecanismos moleculares estariam envolvidos nos efeitos induzidos pelos inibidores da metilação do DNA. Sabe-se, no entanto, que tanto o BDNF quanto TrkB têm sua expressão regulada por metilação do DNA. Diante disso, o objetivo presente trabalho será investigar a participação da via BDNF-TrkB-mTOR do CPFMv no efeito antidepressivo induzido por inibidores da metilação de DNA. Para tanto, ratos tratados com inibidores da metilação de DNA (5-azaD ou RG-108), em dois momentos diferentes (imediatamente após o PT e 23horas após o PT) foram submetidos ao teste do nado forçado (FST). Outro grupo de animais recebeu uma injeção intra-CPMv de k252a ou Rapamicina, 40 minutos antes do teste e uma injeção de BDNF intra-CPFMv, 30 minutos antes do teste. Em outro experimento, grupos independentes de animais submetidos ao nado forçado foram tratados sistemicamente com RG-108 e receberam injeção intra-CPFMv de K252a (antagonista de Trk) ou de rapamicina (inibidor da m-Tor), a fim de investigar se o efeito dessas drogas depende da via BDNF-TrkB-mTOR no CPFMv. Um grupo independente foi tratado com RG108 e CPFM desses animais foi dissecado para posterior análise da expressão de BDNF, TrkB e m-TOR, bem como da metilação de DNA. O tratamento com RG108 e 5azaD sistêmico reduziu o tempo de imobilidade dos animais submetidos ao nado forçado nos dois tempo de administração. A administração intra-CPFMv de BDNF promoveu efeito antidepressivo no FST, e esse efeito foi bloqueado pela administração de k252a ou Rapamicina no CPFMv. No mesmo sentido, o efeito antidepressivo do RG108 sistêmico foi bloqueado pela administração intra-CPFMv de k252a ou Rapamicina. Entretanto, a medida dos níveis de metilação global no CPFMv não apresentou alteração como tratamento com RG108, e também não mostrou alteração nos níveis de BDNF presente no CPF. O tratamento com RG108 não alterou a expressão, bem como a ativação de TRkB e mTOR. Concluímos que os inibidores da metilação do DNA apresentam agudamente efeito tipo antidepressivo rápido, que necessita da funcionalidade integral da via BDNF-TRkB-mTOR. Entretanto, esse efeito parece não alterar a síntese e expressão das proteínas envolvidas nessa via no que diz respeito ao CPFmv. / Recent studies indicate that changes in gene transcription induced by stress or antidepressant drugs appear to involve epigenetic mechanisms. Accordingly, results of our research group pioneered indicated global inhibition of DNA methylation through systemic administration of an inhibitor of DNA methyltransferase (DNMTs), 5-aza-2-deoxycytidine (5-AzaD), induces antidepressant-like effect dose-dependent in the animal model of forced swimming in rats (Sales et al., 2011). The ventral medial prefrontal (vmPFC) cortex is a limbic structure closely related to the neurobiology of depression. Recent evidence indicates that the antidepressant-like effect appears associated with increased levels BDNF (Brain derived neurotrophic factor) and its receptor TrkB in vmPFC, and intracellular signaling mediated by activation of protein mTOR. However, there is no evidence that these molecular mechanisms are involved in the effects induced by inhibitors of DNA methylation. It is known, however, both as BDNF and TrkB expression is regulated by DNA methylation. Thus, the goal of this work is to investigate the role of BDNF-TRkB pathway mTOR-vmPFC in the antidepressant effect induced by inhibitors of DNA methylation. To this end, rats treated with inhibitors of DNA methylation (5-Azad or RG-108), at two different times (immediately after 23hours after the PT and PT) were subjected to the forced swim test (FST). Another group received an intra-vmPFC injection of K252a or Rapamycin 40 minutes before the test, and an injection intra-vmPFC of BDNF 30 minutes before the test. In another experiment, separate groups undergoing the forced swim were treated systemically with RG-108 and received intra-vmPFC of K252a (Trk antagonist) or injection of rapamycin (m-Tor inhibitors) in order to investigate the effect these drugs depends on BDNF-TrkB-mTOR pathway in vmPFC. A separate group was treated with RG108 and mPFC these animals were dissected for analysis of the expression of BDNF and TrkB m-TOR, as well as DNA methylation. The systemic treatment whit 5azaD and RG108 reduced the immobility time of rats subjected to FST administration in both time. The intra-vmPFC BDNF administration promoted antidepressant effect in the FST, and this effect was blocked by the administration of K252a or Rapamycin in vmPFC. Similarly, the antidepressant effect of systemic RG108 was blocked by intra-vmPFC of K252a or Rapamycin administration. However, the measurement of the levels of global methylation in CPFMv did not change as treatment with RG108, and also showed no change in the levels of BDNF present in the CPF. Treatment with RG108 did not alter the expression and activation of TrkB and mTOR. We conclude that inhibitors of DNA methylation present acutely antidepressant-like effect, it needs the full functionality of the BDNF-TrkB-mTOR pathway. However, this effect seems not to alter the synthesis and expression of proteins involved in this pathway at vmPFC.

O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental (paterna ou materna), está envolvido no desenvolvimento placentário. Na região cromossômica 11p15.5 encontram-se vários genes importantes para o desenvolvimento fetal e da placenta, os quais são regulados por duas principais regiões controladoras de imprinting (ICR1 e 2) onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1, respectivamente. O imprinting genômico e a inativação aleatória do cromossomo X são processos epigenéticos presentes em mamíferos placentários. O presente trabalho teve como objetivo principal verificar a presença de mosaicismo do perfil epigenético entre tecidos extraembrionários de estágios precoces da gravidez (primeiro trimestre), e em vilosidade coriônica de placentas a termo (terceiro trimestre). Foram coletadas amostras de 10 gestações de primeiro trimestre (vilosidade coriônica, âmion, membrana de cordão umbilical e tecido embrionário) e 14 de terceiro trimestre (vilosidade coriônica), das quais 10 foram consideradas como controles e quatro utilizadas para estudo de mosaicismo restrito à vilosidade coriônica (coleta de amostras de todos os cotilédones). Após extração do DNA, foi utilizado o Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real para o estudo do padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em diferentes tecidos do primeiro trimestre gestacional e em tecido placentário do terceiro trimestre. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado em todos os cotilédones de duas placentas a termo, de fetos do sexo feminino, por meio do ensaio do receptor de andrógeno humano (HUMARA assay), utilizando eletroforese capilar, e com acréscimo de um novo marcador de inativação do cromossomo X (ICX1). Na análise estatística foram utilizados o teste t não pareado, teste de Turkey e teste t pareado. A média de metilação da KvDMR1 das amostras de vilosidade coriônica do primeiro trimestre gestacional foi estatisticamente diferente da média de metilação do terceiro trimestre. Enquanto que a metilação da H19DMR não apresentou diferença estatística entre amostras de vilosidade coriônica do primeiro e do terceiro trimestre gestacionais. Com relação ao mosaicismo, a KvDMR1 não apresentou variação com relação ao tamanho ou a posição dos cotilédones, enquanto que a H19DMR apresentou diferença estatisticamente significativa na média de metilação com relação ao tamanho dos cotilédones e ao posicionamento nos quadrantes; em consequência da hipometilação em cotilédones pertencentes a uma das placentas estudadas. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na média de metilação da KvDMR1 e da H19DMR entre diferentes tecidos das amostras do primeiro trimestre gestacional. No entanto, a comparação entre tecidos pareados de um mesmo indivíduo mostrou que a metilação não é correspondente entre os tecidos. Os dados obtidos mostram que o imprinting genômico provavelmente é um processo dinâmico, que evolui ao longo da gestação, estando relacionado a formação e ao amadurecimento da placenta. No presente estudo foi possível verificar que cotilédones de uma mesma placenta apresentam diferentes padrões de inativação do cromossomo X. Diferenças que podem ser explicadas pela expansão clonal das células trofoblásticas progenitoras com o cromossomo X paterno ou o cromossomo X materno inativo. Devido à variabilidade epigenética, exames em tecidos placentários devem considerar as diferenças intra-placentárias e as diferenças entre tecidos embrionários e extraembrionários. / Genomic imprinting, a mechanism of allele-specific expression depending on parental origin, is an epigenetic process that regulates the expression of many genes involved in placental development. Several important genes for fetal and placental growth are located on the human chromosome region 11p15.5, which are regulated by two imprinting control regions (ICR1 e 2), which have the differentially methylated regions H19DMR and KvDMR1, respectively. Genomic imprinting and random inactivation of X chromosome are two epigenetic processes present in placental mammals. The present study aimed to verify the presence of epigenetic mosaicism between extra-embryonic and embryonic tissues from early stages of pregnancy (first trimester), and in chorionic villi of term placentas (third trimester). Samples were collected from 10 pregnancies in the first trimester (chorionic villous, amnion, umbilical cord membrane, and embryonic tissue) and 14 from third trimester (chorionic villus sampling), of which 10 were considered as controls and four used to study mosaicism restricted to chorionic villi (sampling of all cotyledons). After DNA extraction, we used real time PCR associated to enzymatic restriction with a methylation sensitive enzyme to study the methylation pattern of KvDMR1 and H19DMR in different tissues from first trimester and placental third trimester tissue. The pattern of X chromosome inactivation was evaluated in all cotyledons from two term placentas of female fetuses, using the human androgen receptor (HUMARA) assay, capillary electrophoresis, and adding a new X chromosome inactivation (ICX1) marker. Unpaired and paired t and Turkey tests were used in statistical analysis. The average methylation of KvDMR1 of chorionic villi samples in first trimester was statistically different from average methylation of the third trimester. While the methylation of H19DMR showed no statistically significant difference between chorionic villi samples in the first and third trimester of pregnancy. In relation to the mosaicism, the KvDMR1 methylation did not vary in respect to the size or position of the cotyledons, while H19DMR showed statistically significant difference in average methylation relative to the size of the cotyledons, to the position in quadrants, due to the hypomethylation in cotyledons from one studied placenta. There were no statistically significant differences in the mean methylation KvDMR1 and H19DMR among different tissues from the first trimester of pregnancy, however, the comparison between paired tissues from the same individual showed that the methylation is different between tissues. The data from this study showed that genomic imprinting is probably a dynamic process and evolved across human pregnancy. This process is probable connected to placenta formation and maturation. We observed different patterns of X chromosome inactivation in cotyledons from the same placenta. This difference could be explained by clonal expansion of a limited number of trophoblastic progenitor cells with either an inactive maternal or paternal X chromosome. Due to the epigenetic variability, placental tissue examinations must consider the differences intra-placental and differences between embryonic and extra-embryonic tissues.

O nucléolo é uma organela subnuclear formada pela atividade transcricional dos genes ribossomais 18S-5.8S-26S (rDNA 45S) e consequente biogênese dos ribossomos. A atividade destes genes resulta na região organizadora do nucléolo (NOR), na forma de uma constrição secundária em cromossomos metafásicos. As constrições secundárias se condensam progressivamente durante a mitose e se descondensam ao final da telófase quando a reestruturação do nucléolo se inicia. Genomas que apresentam mais de um locus de rDNA 45S deve apresentar, obrigatoriamente, pelo menos um par de NORs, enquanto os demais loci poderão ou não serem expressos. O controle da expressão dos genes ribossomais e a formação da cromatina nucleolar são modulados por eventos epigenéticos. Embora alguns pontos sobre o funcionamento dos genes ribossomais e a formação do nucléolo estejam bem estabelecidos, questões como o padrão de condensação da cromatina nucleolar durante a mitose, o padrão de funcionamento de sítios adicionais de genes ribossomais, o papel das modificações epigenéticas na dinâmica da cromatina nucleolar e na expressão do rDNA 45S e o mecanismo de herança dos genes ativos, permanecem abertas. A espécie Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae), com 2n=2x=16 cromossomos, que possui um locus de rDNA 45S no braço curto do cromossomo 1, que sempre forma constrição secundária, e um sítio adicional com atividade facultativa no braço curto do cromossomo 4, é um excelente modelo para o estudo destas questões. No contexto apresentado, foram estudadas a dinâmica de condensação das NORs durante o ciclo celular e sua correlação com a atividade dos genes ribossomais, incluindo o locus adicional, e ainda o papel da metilação da citosina do DNA durante estes processos. Os resultados demonstram que a cromatina da região organizadora do nucléolo segrega em um estado descondensado durante a mitose, na forma de constrição secundária, ou seja, tal estrutura não se condensa durante a metáfase e não volta a se distender no início da telófase. Aparentemente, o que causa correlações equivocadas entre a atividade nucleolar e a observação morfológica da constrição secundária na metáfase é a contração forçada da cromatina da NOR causada por agentes antimitogênicos. Este modelo de segregação em um estado aberto pode ser explicado pela descrição de diversas proteínas que permanecem diretamente ligadas ou indiretamente associadas à região da NOR durante a mitose, funcionando como uma barreira física para a compactação. Ambos os sítios, principais e adicionais, do rDNA 45S presentes em Crotalaria juncea apresentam atividade transcricional, embora o locus do cromossomo 4 mostre atividade facultativa. Ao contrário do que foi anteriormente proposto, uma vez ativo, o locus adicional permanece descondensado durante todo o ciclo mitótico, seguindo o mesmo comportamento dos sítios principais. As constrições secundárias e a cromatina nucleolar são hipermetiladas em nível citológico, independentemente de sua atividade. A aparente hipometilação observada no rDNA 45S em cromossomos mitóticos e núcleos interfásicos se deve ao menor grau de compactação da região organizadora do nucléolo e, consequentemente, à baixa densidade de cromatina. / The nucleolus is a subnuclear organelle formed as a result of transcriptional activity of ribosomal RNA genes 18S-5.8S-26S (45S rDNA) and subsequent ribosome biogenesis. This activity forms the nucleolar organizing region (NOR) as a secondary constriction in metaphase chromosomes. The secondary constrictions progressively condense during mitosis and decondense at the end of telophase, when nucleoli start to reassemble. Genomes presenting more than one 45S rDNA locus must have at least one pair of NOR bearing chromosomes, while other loci may be expressed or not. Ribosomal gene expression and nucleolar chromatin assembly are modulated by specific epigenetic events. Although some topics related to rDNA gene activity and nucleolus formation are well understood, questions such as the behavior of nucleolar chromatin condensation during mitosis, standard functions associated with rDNA additional sites, role of epigenetic modifications in nucleolar chromatin and 45S rDNA expression processes, and inheritance mechanism of active genes, remain to be solved. Crotalaria juncea (Leguminosae - Papilionoideae) has 2n=2x=16 chromosomes and carries a 45S rDNA locus at the short arm of chromosome 1, always presenting a secondary constriction, and an additional site with facultative activity at the short arm of chromosome 4, being an excellent model to resolve these questions. Thus, this study aimed to study NOR condensation dynamics during the cell cycle and its correlation with ribosomal gene activity, including the additional locus, while analyzing the role of rDNA cytosine methylation during this process. The results show that NOR chromatin segregate in a decondensed way throughout mitosis, as a secondary constriction. In other words, this structure does not condense during metaphase and the NOR is not reassembled at the beginning of telophase. Misinterpretations relating nucleolar activity with morphological observations of secondary constrictions, appear to be induced by the artificial contraction of NOR chromatin caused by antimitotic drugs. This segregation model in an open state may be supported by strong diversity of proteins that are maintained attached to NORs during mitosis, serving as a physic barrier for condensation. Both principal and additional 45S rDNA sites of C. juncea are transcriptionally active, although the additional locus in chromosome 4 presented facultative activity depending upon ribosomal request. Unlike what was previously proposed, once the additional site is activated, it remains in an open configuration throughout the cell cycle, similarly to principal site behavior. Secondary constrictions and nucleolar chromatin are hypermethylated at cytological level, regardless of their activity. The seeming hipomethylated state of 45S rDNA in interphase nucleus and mitotic chromosomes is due to a lower compaction level of nucleolar organizing regions and subsequent low chromatin density.

O sucesso da gestação, e nascimento da prole saudável, depende da adequada formação, desenvolvimento e funcionamento da placenta. Entretanto, são observadas altas perdas durante o primeiro terço da gestação de embriões bovinos produzidos por transferência de núcleo de célula somática (TNCS), principalmente causadas por alterações placentárias, decorrentes da incompleta reprogramação epigenética no desenvolvimento embrionário. Normalmente, após a fecundação, o DNA paterno é desmetilado durante as primeiras horas do desenvolvimento, enquanto o DNA materno é desmetilado de forma passiva. Entretanto nos embriões TNCS a desmetilação do DNA é tardia e incompleta, resultando numa alteração do padrão epigenético, principalmente nos níveis de metilação (5mC) e hidroximetilação (5hmC) do DNA e nas histonas. Além disso, na gestação TNCS há expressão precoce das moléculas do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC-I), associada ao aumento de infiltrados inflamatórios na placenta e à rejeição imunológica ao feto. O objetivo desse trabalho foi de verificar, na placenta bovina TNCS e controle, os níveis globais de 5mC e 5hmC, e de algumas modificações de histonas importantes na formação do trofectoderma ou por serem modificações clássicas, além de imunolocalizar moléculas de MHC-I. Para tanto foram utilizadas amostras de placentônio TNCS no primeiro (n = 5) e terceiro (n = 6) terço gestacional; e como controle, placentônios com controle no primeiro (n = 6) e terceiro (n = 6). Foram realizadas reações de imunohistoquímica para modificações no DNA (5mC, 5hmC) e nas histonas (H3K4me3, H3K27me3, H3K9ac, H3K9me2/3) e para MHC-I (Qa-2 e IL-A88); além de reações de PCR quantitativo para enzimas responsáveis pelas modificações no DNA (DNMT1, TET1, TET3), para alguns genes relacionados com o desenvolvimento da placenta (PAG9, PHDLA2, SNRPN e TSSC4) e para isoformas de MHC-I (NC1-4 e JSP-1). Houve aumento dos níveis globais de metilação, e diminuição de hidroximetilação, na placenta TNCS durante o primeiro trimestre gestacional. Os níveis de H3K4me3 foram estáveis na placenta controle e crescentes na placenta TNCS, enquanto que a H3K27me3 decresceu na placenta controle e foi estável na placenta TNCS. Na placenta TNCS, aos 60 dias, foram observados os menores níveis globais H3K9ac, porém H3K9me2/3 não diferiram entre as idades e tipos gestacionais estudados. Foi identificado MHC-I no trofoblasto do placentônio bovino nas idades analisadas, com variações de intensidade dependendo da isoforma detectada, além de que a placenta controle e a TNCS apresentam padrões diferentes na expressão de MHC-I. De modo geral, o menores níveis de metilação do DNA encontrados na placenta TNCS aos 60 dias de gestação, indica ser um mecanismo compensatório para ativar a expressão gênica. Visto que a as modificações de histona levam a um estado repressivo da expressão gênica, já que a bivalência entre H3K4me3 e H3K27me3 e os níveis de H3K9ac estão diminuídos. Ainda na placenta TNCS aos 60 dias, há uma alta expressão de MHC-I, levando a resposta imune do sistema materno contra os tecidos fetais. Portanto vários eventos são presentes e parecem contribuir para instabilidade da gestação inicial em clones, coincidindo com a alta taxa de perdas gestacionais nessa fase / Pregnancy success depends of adequate placental formation, development and function. Therefore, the highest loses rates are found during first trimester pregnancies of bovine embryos produced by somatic cell nuclear transfer (NT), majorly by placental alterations, due to incomplete epigenetic reprogramming during embrionary development. Normally, after fecundation, paternal DNA is actively demethylated at first hours of development; where as maternal DNA is passively demethylated. However in NT embryos the DNA demethylation is late and incomplete, resulting in changes of epigenetic patterns, majorly in methylation (5mC), hydroxymethylation (5hmC) and histone levels. Furthermore, in NT pregnancy there is premature expression of class I major histocompatibility complex (MHC-I), associated with inflammatory infiltrates increases and immunological rejection against fetus. The aim of this work was to evaluate global levels of 5mC, 5hmC and some posttranslational histone modifications and MHC-I molecules expression of bovine placenta in NT and control models. For this, NT and control bovine placentome were collected at first (n = 6) and third (n = 6) trimester of pregnancy. Immunohistochemistry reactions were performed to assay DNA methylation (5mC) and (5hmC) and posttranslational histone modifications (H3K4me3, H3K27me3, H3K9ac, H3K9me2/3) and MHC-I molecules (Qa-2 e IL-A88). Quantitative PCR reactions were performed to evaluate the expression of DNA modifications related enzymes (DNMT1, TET1 and TET2), MHC-I classical (JSP-1) and non-classical (NC1-4) isoforms, and imprinted genes expression (SNRPN, TSSC4 and PHDLA2). In the NT placenta there was an increase in the global methylation and decreased hydromethylation level at first trimester. Levels of H3K4me3 were constant at control placenta while increased in NT placenta. For H3K27me3, the levels decreased in control placenta and were stable at NT counterparts. At 60 days of pregnancy in NT placenta, were observed low levels of global H3K9ac, but no differences of H3K9me2/3 levels were found between pregnancy ages or type. We identified MHC-I at bovine placentomal trophoblast in all ages analyzed, with intensity variation of different isoforms. In general, low levels of DNA methylation at day 60 of pregnancy of TNCS placenta, indicates a compensatory mechanism to active genic expression. Since histone modifications, in this period, leads to repressive status, because bivalence of H3K4me3 and H3K27me3 and levels of H3K9ac were diminished. Also at day 60 of pregnancy of TNCS placenta, MHC-I is highly expressed and leads to maternal immune response against fetus tissue. In conclusion, several events are present and apparently contribute to early clone pregnancy instability, coinciding with high pregnancy losses in that phase

Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T20:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mampumbu_AndreRoberto_D.pdf: 659647 bytes, checksum: 40d0a48fa1d02750dffb30ae80b25445 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O gênero Melipona (abelhas sem ferrão) tem sido dividido em dois grupos, com base no seu conteúdo em heterocromatina revelada com a técnica de banda-C em cromossomos mitóticos. Melipona quadrifasciata e Melipona rufiventris apresentam, respectivamente, níveis baixos e altos de heterocromatina. Na suposição de que cromatina condensada possa ser rica em seqüências de DNA metiladas, M. quadrifasciata e M. rufiventris poderiam então apresentar diferenças em conteúdo de seqüências CpG metiladas. Se isso acontecesse, as diferenças poderiam ser reveladas pela comparação de valores Feulgen-DNA obtidos por análise de imagem de células tratadas com as enzimas de restrição Msp I e Hpa II, que distinguem entre seqüências metiladas e não metiladas. Msp I e Hpa II clivam as seqüências ¿CCGG-, porém não há clivagem pela Hpa II se a citosina do dinucleotídeo central CG for metilada. Neste trabalho, túbulos de Malpighi de larva de último estádio de M. quadrifasciata e M. rufiventris submetidos à reação de Feulgen precedida pelo tratamento com Msp I e Hpa II tiveram suas células analisadas por microespectrofotometria de varredura automática. Para esse material houve necessidade do desenvolvimento prévio de um ajuste metodológico que tornasse a reação de Feulgen reveladora apenas de DNA, visto que ocorria reação plasmal; isto foi conseguido com um tratamento por boridreto de sódio a 5% e acetona/clorofórmio (1:1, v/v) antecedendo a reação de Feulgen. Também, embora a definição de altos e baixos conteúdos de heterocromatina em Melipona pela técnica de banda-C não fosse extensível à cromatina de núcleos interfásicos dos túbulos de Malpighi dessas abelhas, demonstrou-se que a depurinação do DNA em M. quadrifasciata era mais rápida do que a de M. rufiventris, confirmando, maiores teores de cromatina condensada em M. rufiventris. Os valores Feulgen-DNA para a heterocromatina de Melipona rufiventris e para a pouca heterocromatina somada a alguns domínios de eucromatina de Melipona quadrifasciata diminuíram após tratamento com Msp I, porém ficaram inalterados após tratamento com Hpa II. Conclui-se que seqüências CpG metiladas podem estar contidas em diferentes compartimentos cromatínicos, conforme a espécie do gênero Melipona considerada, e que os seus efeitos silenciadores possam atuar induzindo uma mesma fisiologia celular / Abstract: The genus Mellipona has been divided into two groups based on its heterochromatin content revealed by C-banding pattern in mitotic chromosomes. Melipona quadrifasciata and Melipona rufiventris show low and high heterochromatin content, respectively. Supposing that condensed chromatin may be rich in DNA methylated sequences, M quadrifasciata and M. rufiventris could, thus, show differences regarding their content of CpG methylated sequences. In this situation, such differences could be revealed by comparing the Feulgen-DNA values acquired after image analysis of cells treated with restriction enzymes Msp I and Hpa II, which distinguish between methylated and nonmethylated sequences. Msp I and Hpa II break the CCGG sequences. Nevertheless, Hpa II is ubable to break the DNA strand if the cytosine from the central nucleotide pair CG is methylated. In this work, Malpighian tubules from larvae from the last stage of M. quadrifasciata and M. rufiventris, subjected to the Feulgen reaction after by treatment with Msp I and Hpa II, were analysed in automatic scanning microspectrophotometry. Since a plasmal reaction was observed in this material, it was previously necessary the development of a methodological adjustement to make the Feulgen reaction specific to DNA. This was achieved by treatment of material with 5% sodium borohydrade followed by acetone-chloroform (1:1, v/v) before the Feulgen reaction. Also, although the definition of high and low heterochromatin content in Melipona after C-banding technique is not applicable to the chromatin of interphasic nuclei in Malpighian tubules of bees, it was demonstrated that DNA depurination in M. quadrifasciata was faster than that of M. rufiventris, thus confirming that this species has a higher condensed chromatin content. The Feulgen-DNA values for the heterochromatin of Melipona rufiventris, and for the heterochromatin besides some euchromatic domains of Melipona quadrifasciata, decreased after treatment with Msp I, remaining, however, unaltered after treatment with Hpa II. In conclusion, methylated CpG sequences may be part of different chromatin compartments, according to the considered species of the genus Melipona, and that their silencing effects may act by inducing the same cell physiology / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

O principal objetivo deste trabalho é o de estabelecer uma estratégia confiável relacionada a genotoxicidade, proteção genômica e recombinação mitótica em Aspergillus nidulans. A genotoxicidade foi induzida por vapor de benzeno e, para testar a proteção genômica, a soja foi usada devido às suas propriedades anticarcinogênicas muito conhecidas. O principal resultado obtido foi que a soja transgênica mostrou maiores propriedades antigenotóxicas do que a soja tradicional. Isto foi duplamente confirmado, tanto através de estratégias de genética clássica, como molecular. Além disso, cada experimento foi repetido três vezes. Principais conclusões foram as seguintes: a) estabelecimento de um protocolo adequado para atender às complexidades dos eventos epigenéticos e, b) a aplicação desse tal protocolo e experimentos afins para testar outros agentes ambientais suspeitos de apresentarem propriedades antigenotóxicas, ou que precisem de sua identificação como tal. Evidentemente, levando-se em conta a grande preocupação relacionada aos alimentos transgênicos e aos muitos produtos de biotecnologia, que entram no mercado, o elenco de prováveis candidatos aos tipos de testes apresentados, será muito grande. Como os resultados obtidos sugerem íntima relação entre metilação de DNA eucariótico, a recombinação mitótica e outros eventos danosos às células, os eventos envolvidos serão epigeneticamente discutidos. / Main aim is to provide a reliable approach to deal with the aspects related to induced genotoxicity, genomic protection and eukaryotic mitotic recombination in Aspergillus nidulans. Genotoxicity was benzene fumes induced, and to test genomic protection soybean has been used on account of its putative anticarcinogenic properties. Main outcome is that transgenic soybean bears higher antigenotoxic properties than traditional soybean. This has been twofold confirmed through basic genetic approaches and molecular approaches, as well. In addition, each experimental approach has been three times repeated. Additional important outcomes are: a- establishment of a reliable protocol to deal with the complexities of the epigenetic events, and b- likely use of present protocol and experimental set-up to test other environmental agents of which antigenotoxic properties are either suspected, or need precise identification. Evidently, on account of present wide concern the transgenic foodstuffs, and many other biotechnological products, as well, are obvious candidates for similar approaches. Obtained results suggest close relationships among eukaryotic DNA methylation, mitotic recombination, and other cells damaging events reputedly leading to carcinogenesis.

A periodontite está relacionada à genética do hospedeiro, constituição do biofilme dental e fatores ambientais como o hábito de fumar. A metilação do DNA é um mecanismo de expressão genética que pode inibir ou silenciar a expressão do gene. Desta forma, vários pesquisadores têm se dedicado a estudar a influência genética sobre a suscetibilidade e/ou risco aumentado à doença periodontal. Estudos têm relatado associação entre vários biomarcadores epigenéticos com a inflamação periodontal. Considerando a hipótese de que existe associação do tabagismo com a metilação em genes relacionados à doença periodontal, o objetivo deste estudo foi verificar o padrão de metilação do DNA em células do epitélio oral de pacientes com periodontite crônica (CP) no promotor de um gene específico envolvido no controle da inflamação, como supressor da sinalização de citocinas (SOCS-1) em pacientes fumantes e não fumantes. O gene SOCS-1 é localizado no cromossomo 16p13.3, compostos por uma região amino-terminal, um domínio SH2 central e uma caixa SOCS. É um regulador negativo da via JAK / STAT. Inibe os efeitos biológicos de várias citocinas, incluindo IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, interferão (INF) - &gamma; e INF- &alpha; / &beta;. Este foi um estudo caso-controle, comparando dois grupos, um grupo (teste) com consumo de 10 cigarros mínimos por dia, com diagnóstico de periodontite crônica e outro grupo controle que foram pacientes não fumantes com periodontite crônica. Para tal, DNA genômico foi purificado de células epiteliais bucais obtidas por meio de enxágue com sacarose 3%, por tempo único de coleta. O DNA foi modificado pelo bissulfito de Sódio e os padrões de metilação do DNA foram analisados com a técnica MS-PCR (Polymerase chain reaction). A análise estatística foi realizada pela plataforma estatística R version 3.3.2 Core Team (2016). Foi realizado Teste t de Student para amostras independentes e teste não paramétrico de Wilcoxon & Mann-Whitney para variáveis qualitativas; teste qui-quadrado e para a variável metilação, foi feito um teste exato de Fisher para testar a associação entre os grupos e a metilação. Os resultados indicaram que, para células epiteliais da mucosa bucal, a frequência de desmetilação no gene SOCS-1 é maior no grupo sem o hábito do fumo, em comparação ao grupo fumante. Foram detectadas diferenças no padrão de metilação entre os dois grupos. Ao estabelecer uma estimativa de risco relativo entre os grupos e a variável metilação, foi observado que pacientes fumantes têm 7,08 vezes (risco relativo) com um intervalo (1,95-51.46) de apresentar doença periodontal crônica, com um padrão de metilação no gene SOCS-1 / Periodontitis is related to host genetics, constitution of the dental biofilm and environmental factors such as smoking. DNA methylation is a mechanism of genetic expression that can inhibit or silence gene expression. In this way several researchers have been dedicated to study the genetic influence on the susceptibility and / or increased risk to periodontal disease. Studies have reported association between several epigenetic biomarkers with periodontal inflammation. Considering the hypothesis that there is an association between smoking and methylation in genes related to periodontal disease, the objective of this study was to verify the DNA methylation pattern in oral epithelial cells of patients with chronic periodontitis (ChP) in the promoter of a specific gene involved in the control of inflammation, as suppressor of cytokine signaling (SOCS-1) in smokers and nonsmokers patients. The SOCS-1 gene is located on chromosome 16p13.3 composed of an amino-terminal region, a central SH2 domain and a SOCS box. It is a negative regulator of the JAK / STAT path. It inhibits the biological effects of various cytokines, including IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, interferon (INF) -&gamma; and INF-&alpha; / &beta; . This was an case-control type study, comparing two groups, a group with consumption of 10 minimum cigarettes per day, with a diagnosis of chronic periodontitis and another control group were non-smokers with chronic periodontitis. For this, genomic DNA was purified from oral epithelial cells obtained by rinsing with 3% sucrose, for a single time of collection. The DNA was modified by Sodium bisulfite and the methylation patterns of the DNA were analyzed with the MS-PCR technique (Polymerase chain reaction). Statistical analysis was performed by the statistical platform R version 3.3.2 Core Team (2016), Student\'s t-test was performed for independent samples and Wilcoxon\'s & Mann-Whitney non-parametric test for qualitative variables; chi-square test. For the methylation variable, an exact Fisher\'s test was performed to test the association between the groups and the methylation. The results indicated that, for oral mucosal epithelial cells, the frequency of demethylation in the SOCS-1 gene is higher in the non-smoking group as compared to the smoker group. statistically significant differences were detected in the methylation pattern between the two groups. When establishing an relative risk between the groups and the methylation variable, it was observed that smokers are 7.08 times (relative risk) of having chronic periodontal disease with a methylation pattern in the SOCS-1 gene