Introdução - A urbanização desencadeia inúmeros transtornos, como a disseminação de artrópodes e, conseqüentemente, de doenças veiculadas pelos mesmos. As formigas são muito adaptáveis e se beneficiam com a convivência humana. Nos hospitais, elas podem ser vetores mecânicos de inúmeras bactérias, e a diversidade de espécies encontradas nestes ambientes, causam preocupação pelo risco potencial à saúde pública. O aumento das infecções hospitalares envolvendo micobactérias ambientais, com surtos no Brasil entre 1998 a 2009 em 23 estados alarmou os órgãos e profissionais de saúde pública. Objetivos - Avaliar o potencial de formigas como vetores de micobactérias em um hospital especializado no atendimento de doentes com tuberculose. Métodos - Foram realizadas seis coletas de formigas em diferentes áreas do hospital no período de 2009 a 2010, que foram semeadas em meios de cultura de Löwenstein-Jensen e de Stonebrink para isolamento de micobactérias. As culturas sugestivas foram submetidas à coloração de Ziehl-Neelsen para bacilos álcool-ácido resistentes e identificação por métodos moleculares (PRA para o gene hsp65 com o par de primers TB11 e TB12 gênero-específico e sequenciamento genético do DNA). Resultados - Do total de 247 amostras de formigas coletadas e semeadas, 70 por cento das formigas pertenciam à espécie Tapinoma melanocephalum, 25 por cento a espécie Dorymyrmex sp., 3 por cento a espécie Camponotus sp. e 2 por cento a espécie Pheidole sp., dados similares foram observados anteriormente em pesquisas realizadas em hospitais. Quinze amostras apresentaram bacilos álcool-ácido resistentes de crescimento rápido. Nos métodos moleculares, doze pertenciam ao Gênero Mycobacterium. No PRA-hsp 65, e no sequenciamento genético do DNA, quatro amostras foram identificadas quanto à espécie (duas Mycobacterium chelonae, uma Mycobacterium parafortuitum e uma Mycobacterium murale), quatro micobactérias com resultados idênticos no PRA e não identificadas no sequenciamento foram sugestivas de uma nova espécie, e duas amostras não foram identificadas. Mycobacterium chelonae isolada nesta pesquisa foi previamente descrita como agente causador de abscessos em humanos. Conclusão - Estes dados confirmam a presença de micobactérias veiculadas por formigas no ambiente hospitalar, representando um potencial vetor mecânico destas para pacientes e profissionais de saúde, principalmente em infecções nosocomiais / Introduction- Urbanization triggers numerous disorders, such as the dissemination of arthropods and, consequently, dissemination of diseases transmitted by them. Some ant species are very adaptable to the human environment. At hospitals, once they are mechanical vectors of bacteria, and the diversity of species found in these environments, they can represent a potential risk to public health. The increase of nosocomial infections involving environmental mycobacteria, with outbreaks in Brazil from 1998 to 2009 in 23 states called the interest of health professionals and health agencies. Purpose - Evaluate the potential of ants as vectors of mycobacteria in a hospital specialized in the care of patients with tuberculosis. Methods Samples of ants were collected from different areas of the hospital from 2009 to 2010, and workers were inoculated in Löwenstein-Jensen and Stonebrink media for mycobacteria isolation. The suggestive cultures were subjected to Ziehl-Neelsen stain for acid-fast bacilli and identification were performed by molecular methods (PRA for the hsp65 gene with the pair of primers TB11 - TB12 and genetic sequencing). Results - The total of 247 samples of ants collected and sown, 70 per cent belonged to species of ants Tapinoma melanochepalum, 25 per cent Dorymyrmex sp.,3 per cent Camponotus sp. and 2 per cent Pheidole sp., data similar with previous studies conducted in hospitals. Fifteen fast-growing mycobacteria were isolated. In molecular methods, twelve belonged to the genus Mycobacterium. In PRA-hsp65, and the genome sequencing of DNA, four samples were identified at species level (two Mycobacterium chelonae, one Mycobacterium parafortuitum and one Mycobacterium murale), four mycobacteria with similar results in the PRA and not identified in the sequencing, suggestive of a new species and two unidentified samples. M. chelonae was previously reported as causative agent of abscess in humans. Conclusions - These results confirm the presence of mycobacteria carried by ants in the hospital, representing a potential mechanical vector for these patients and healthcare professionals, particularly in nosocomial infections

BCG é uma das vacinas mais usadas no mundo. Avanços na manipulação genética têm permitido o seu uso como carreador de antígenos heterólogos, porém o aprimoramento dos sistemas de expressão se faz necessário, sendo o promotor um importante elemento, uma vez que regula o nível de produção do antígeno, induzindo uma resposta imunológica adequada. Avaliamos a atividade de diferentes promotores de micobactérias, como o PAg, PAN, PBlaF*, Phsp60 e um promotor ainda não caracterizado do micobacteriófago L5, usando o gene gfp como repórter da expressão, todos clonados no vetor extracromossomal, pLA71. Foi possível avaliar as cepas de M. smegmatis e BCG fluorescentes para quase todas as construções e alguns plasmídeos pLA71-p mostraram características diferentes dependentes da micobactéria transformada. Numa escala de força de expressão, os diferentes promotores se apresentaram como fraco (pLA71-PAN-gfp), médio (pLA71-PBlaf*-gfp) e forte (pLA71-Phsp60-gfp). Os rBCG foram usados para infecção de macrófagos e a atividade dos promotores não foi afetada após a internalização. Para ensaio de localização, camundongos foram inoculados com BCG e foi possível confirmar a presença de colônias (recombinantes ou não) nos pulmões após 1 e 3 dias de inoculação, por plaqueamento em meio sólido e por microscopia confocal. / BCG is one of the most widely used vaccines in the world. Advances in genetic manipulation have allowed their use as a carrier for heterologous antigens, however the improvement of systems of expression is necessary, the promoter being an important element, since it regulates the expression level of the antigen, inducing an adequate immune response. We evaluated the activity of different promoters of mycobacteria, such as PAg, PAN, PBlaF* and Phsp60, and the not yet characterized promoter of the micobacteriophage L5, using GFP as a reporter gene expression activity, all cloned in the extrachromosomal vector, pLA71. It was possible to evaluate promoters in the M. smegmatis and BCG strains, fluorescent for almost all constructions and some pLA71-p plasmids showed different characteristics dependent on the transformed mycobacterium. The different promoters showed expression levels as weak (pLA71-PAN-gfp), medium (pLA71-PBlaf*-gfp) and strong (pLA71-Phsp60-gfp). The rBCG were used for infection of macrophages and the activity of the promoters wasnt affected after internalization. For BCG location test, mice were inoculated and it was possible to confirm the presence of colonies (recombinant or not) in the lungs after 1 and 3 days after inoculation by plating on solid medium and by confocal microscopy.

A Tuberculose vem acometendo animais selvagens desde o surgimento das primeiras coleções organizadas. Particularmente, macacos são altamente suscetíveis as micobactérias, gerando grandes perdas econômicas para as instituições, além do risco de transmissão para o homem e animais. As principais micobatérias, que causam a doença em primatas em cativeiro, são o Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium bovis. Acredita-se que primatas do "novo mundo" são menos suscetíveis do que os do "velho mundo", entretanto observa-se que tuberculose tem sido documentada em várias espécies. A principal forma de transmissão é através de aerossóis contendo os bacilos. A doença pode evoluir para a forma ativa ou latente, dependendo do estado imunológico do animal. Os sinais clínicos podem ser insidiosos, com somente uma alteração comportamental, seguido por anorexia e letargia, alterações respiratórias ou simplesmente o animal pode aparecer morto no recinto. O diagnóstico clínico é difícil e problemático, sendo que muitas vezes as lesões consistentes com a doença só são observadas na necropsia. Por isso o uso de outras ferramentas de diagnóstico é importante, como o teste de tuberculinização, cultivo e isolamento bacteriano, que são os mais usados na rotina das instituições, e os exames radiográficos do tórax e abdômen, testes moleculares e sorológicos. Toda instituição que mantém primatas em cativeiro deveriam possuir programas de prevenção para evitar a entrada da micobactéria dentro da coleção, principalmente ao se adquirir novos animais. Por isso, o emprego de medidas de biossegurança é essencial para diminuir o risco de doenças para o homem e para os animais dentro das instituições. Essas medidas consistem na implantação de uma série de procedimentos e normas operacionais rígidas, como programas de quarentena, programas de saúde para os funcionários e formação de equipe capacitada e treinada. / Tuberculosis has been affecting wild animals since the arising of the first organized collections. Specially, monkeys are highly susceptible to mycobacteria, which cause great economic losses in the institutions, beyond the risk of transmission to man and animals. The main species of mycobacteria, that cause disease in nonhuman primates in captivity, are Mycobacerium tuberculosis and Mycobacterium bovis. It is believed that nonhuman primates from the "new world" are less susceptible than the "old world" ones, however it is noted that tuberculosis has been continually documented in several species. Aerosols that contain infectious bacilli are the main transmission mode. The disease can progress to active or latent form, which depends on the animal's immune status. The clinical signs can be insidious, with only a behavior change, followed by anorexia and lethargy, respiratory alteration or the animal can appear dead in the room. The clinical diagnostic is difficult and problematic, and often lesions are only observed at necropsy. Therefore, the use of other diagnostic tools is important, as the tuberculin skin test, bacterial culture and isolation, that are most used during the routine of institutions, and radiography of the chest and abdomen, molecular and serological tests. Every institution that maintains nonhuman primates in captivity should have prevention programs to avoid the entry of mycobacteria inside of collection, mainly when new animals are acquired. Thus, the use of biosecurity measures is essential to reduce the risk of disease in humans and animals within institutions. These measures consist in implanting series of rigid procedures and operational standards, like quarantine programs, health programs for employees and formation of the qualified team.

Introdução: A revisão da literatura disponível no PubMed evidencia que há relatos de surtos de infecções por micobactérias de crescimento rápido ocorridos no Brasil, mas não há dados nacionais que permitam orientar o tratamento empírico até que o perfil de sensibilidade e a identificação da espécie estejam disponíveis. Não há estudo nacional com amostragem significativa de M. fortuitum nem tampouco análise da relação clonal entre isolados de vários pontos do território nacional. Este trabalho pretende trazer contribuições quanto ao entendimento da disseminação de clones de M. fortuitum no Brasil, assim como o perfil de sensibilidade dessa espécie no Brasil. Material e métodos: Foram utilizadas no estudo 121 isolados pertencentes ao banco de micobactérias do Fleury Medicina e Saúde, referentes ao período de janeiro de 2001 a dezembro de 2010. A identificação da espécie for determinada por sequenciamento parcial do gene rpoB, a clonalidade foi avaliada por eletroforese em campos alternados e a susceptibilidade antimicrobiana foi avaliada utilizando-se placas de microdiluição RAPMYCOI. Resultados e conclusões: Foram detectados três grupos clonais, sendo dois presentes na cidade de Campinas e o terceiro na cidade de Florianópolis. Foi observada a persistência do grupo clonal MFBRA2 na cidade de Campinas por seis anos. A maioria dos casos isolados em diferentes estados brasileiros pertence a grupos clonais distintos. O índice de similaridade de Dice mínimo para a identificação de um grupo clonal de M. fortuitum ao analisar fragmentos de restrição gerados por XbaI deve ser de 98%. Todos os isolados testados foram sensíveis à amicacina, tigeciclina, imipenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, sulfametoxazol-trimetoprim e linezolida, o que permite seu uso no tratamento empírico das infecções por M. fortuitum. Houve uma baixa taxa de sensibilidade à doxiciclina o que não subsidia seu uso em tratamento empírico. A taxa de sensibilidade de 89% para claritromicina não permite seu uso empírico no tratamento das infecções por M. fortuitum. / Introduction: The literature available on PubMed shows that there are reports of outbreaks of infections caused by rapidly growing mycobacteria occurred in Brazil, but there is no national data to guide empiric treatment until the susceptibility profile and identification of the species are available. No national study of significant sample of M. fortuitum nor analysis of the clonal relationship between isolates from various parts of the country. This work aims to bring contributions to the understanding of the spread of clones of M. fortuitum in Brazil, as well as the susceptibility pattern of this species in Brazil. Material and methods: We studied 121 isolates belonging to the mycobacteria collection from Fleury Medicina e Saúde, collected during the period from January 2001 to December 2010. Species identification was determined by partial sequencing of the rpoB gene, clonality was assessed by pulsed field gel electrophoresis and antimicrobial susceptibility was assessed using microdilution plates RAPMYCOI. Results and conclusions: There were three clonal groups, with two present in the city of Campinas and the third in Florianopolis. We observed the persistence of the clonal group MFBRA2 in Campinas for six years. Most cases isolated in different Brazilian states belong to different clonal groups. Our data indicate that Dice\'s similarity index for identification of a M. fortuitum clonal group should be at least 98% when analyzing restriction fragments generated by XbaI. All isolates tested were susceptible to amikacin, tigecycline, imipenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid, and trimethoprim-sulfamethoxazole, which allows its use in the empirical treatment of infections caused by M. fortuitum. There was a low sensitivity to doxicycline which does not subsidize its use in empiric treatment. The rate of 89% sensitivity does not allow the empirical use of clarithromycin in the treatment of infections caused by M. fortuitum.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-01-26T14:04:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PapelColesterolBiossintese.pdf: 1985927 bytes, checksum: 27ddccf1dcf41767a3241f1f42d6e49e (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-01-27T13:36:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PapelColesterolBiossintese.pdf: 1985927 bytes, checksum: 27ddccf1dcf41767a3241f1f42d6e49e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T13:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PapelColesterolBiossintese.pdf: 1985927 bytes, checksum: 27ddccf1dcf41767a3241f1f42d6e49e (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diferentes espécies de micobactérias são agentes causadores de significativas doenças em seres humanos como, por exemplo, a tuberculose. Todas as micobactérias possuem uma complexa e distinta parede celular, conferindo características físico-químicas exclusivas ao gênero Mycobacterium, protegendo-o contra o sistema imune e entrada de muitos antibióticos. Durante a infecção, o bacilo é capaz de se adaptar ao ambiente inóspito, nutrindo-se de fontes lipídicas alternativas, principalmente o colesterol, da própria célula hospedeira (macrófagos). Este perfil nutricional tem sido considerado essencial para a divisão bacilar e consecutivamente progressão da doença. Diante disso, o presente trabalho tem por objetivo avaliar em Mycobacterium smegmatis (espécie saprofítica) a modulação in vitro da biossíntese de constituintes bioativos da parede celular após o consumo de colesterol. Como resultado, verificamos por Cromatografia de Camada Delgada (CCD) que a adaptação do bacilo ao microambiente de escassez nutricional (cultivo em Meio Mínimo – MM) conseguiu manter a biossíntese e o acúmulo dos principais constituintes da parede celular, quando o cultivo ocorre na presença de alguma fonte definida de carbono e energia (glicerol e/ou colesterol). Dentre estes constituintes essenciais sem alterações, verificamos o Trealose de dimicolato (TDM) e os fosfolipídios Fosfatidilinositol (PI), Fosfatidilinositol manosídeos (PIMs), Cardiolipina (CL) e Fosfatidiletanolamina (PE). Diferentemente a esse resultado, o ácido micólico apresentou acúmulo representativo ao cultivo em meio 7H9 somente quando o MM estava igualmente suplementado com glicerol. Este resultado foi confirmado pela marcação álcool-ácido resistente com o marcador fluorescente auroamina, sugerindo alterações nas propriedades físico-químicas da parede celular. Por outro lado, o cultivo em MM favoreceu o acúmulo de Glicopeptídeolipídios (GPLs), independente da suplementação por glicerol e/ou colesterol. Esta perturbação na biossíntese da parede celular alterou o perfil hidrofóbico do bacilo, independentemente da fonte de carbono e energia, porém não alterou a resistência ou sensibilidade a antibióticos. Estes resultados mostram claramente que a biossíntese da parede celular pode sofre modulações em condições de escassez nutricional, e que a presença ou ausência de colesterol, como ocorrido durante a infecção, não altera significativamente a fisiologia do bacilo a ponto de torna-lo mais vulnerável a ação de antibióticos, sugerindo que tais modificações possam também ocorrer durante a infecção, mantendo o bacilo viável, até o desenvolvimento da doença propriamente dita. / Different Mycobacterium species are causative agents of disease in humans, for example, the tuberculosis. All mycobacteria have a complex cell wall, distinct of others bacteria, conferring specific physic-chemical characteristic to Mycobacterium genus, due to protect against immune system and waterproofing against the intake of much antibiotics. During infection, the bacillus is able to adapter to harsh environment, due to consumption of cholesterol from itself host cell (macrophages) as alternative carbon and energy source. That nutritional aspect has been considered as essential for division of bacilli and consecutive progress of tuberculosis disease. The present study has as objective to evaluate in vitro the modulation of saprophytic Mycobacterium smegmatis cell wall biosynthesis after cholesterol consumption as primordial energy and carbon source. As results, we are found by Thin Layer Chromatography (TLC) that bacillary adaptation to microenvironment with poor nutrient (minimal media – MM) maintained the biosynthesis and accumulation of essential cell wall components, when the growth occurs in presence of someone defined carbon and energy source (glycerol and/or cholesterol). Among them without changes, we analyzed Trehalose Dimicolate (TDM) and the phospholipids (phosphatidylinositol (PI), phosphatidylinositol manosides (PIMs), Cardiolipin (CL) and phosphatidylethanolamine (PE)). Differently of these results, the micolic acid showed representative accumulation, comparing with 7H9 culture, only when the MM was supplemented with glycerol. This result was confirmed by alcohol-acid staining using fluorescent auroamine dye, suggesting some changes in physic-chemistry cell wall properties. On the other hands, the MM culture induced the accumulation of glycopeptidolipids (GPLs), independently of glycerol/cholesterol supplementation. Such disturbance in cell wall biosynthesis also changed the bacillary hydrophobicity in all MM groups, but does not change the resistance and sensibility to antibiotics. Those results clearly show that cell wall biosynthesis might be modulate during nutritional shortage, and such presence or absence of cholesterol, as occurs during infection, does not significantly change the bacillary physiology to become vulnerable for antibiotics. It suggests that such modulations might also occur during infection, maintaining the bacilli available to develop the tuberculosis diseases.

Orientador: Helio Langoni / Resumo: EBERHARDT, B.G. Avaliação de micro-organismos zoonóticos em filés de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Botucatu, 2018. 71p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO Cinquenta filés de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) obtidos em mercado de peixes no município de Ourinhos, Estado de São Paulo, foram analisados quanto à prevalência para Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Mycobacterium spp. e Cianobactérias. Amostras de músculo foram avaliadas por PCR para Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda e Mycobacterium spp., enquanto que as amostras para cianobactérias foram analisadas por PCR em Tempo Real (qPCR). Os resultados obtidos demonstraram ausência de Aeromonas hydrophila e Edwardsiella tarda nas amostras de filés. A prevalência para Mycobacterium spp. foi de 100% (50/50). Realização posterior de sequenciamento revelou Mycobacterium gordonae. Esta bactéria é considerada um colonizador comum, normalmente não patogênico, porém, há relatos de literatura que demonstram risco de infecção em indivíduos imunossuprimidos e até mesmo imunocompetentes. A taxa de prevalência para cianobactérias foi de 48% (24/50). As cianobactérias (algas azuis) produzem grande quantidade de metabólitos bioativos ou mesmo tóxicos, incluindo toxinas associadas a problemas ambientais e de saúde pública. Considerando a natureza e o papel das cianobactérias como patógenos emergentes, a elevada prevalência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Resumo: Foram investigadas, neste estudo, proteínas associadas à virulência (genes vapA, vapB e vapN) das espécies de Rhodococcus equi e Micobactérias isoladas de 330 linfonodos de catetos (Tayassu tajacu) e queixadas (Tayassu pecari) destinados ao consumo humano. Trinta e seis (10,9%) linhagens de R. equi foram isoladas, 3,3% (11/330) dos linfonodos de queixadas e 7,6% (25/330) dos catetos. Entre os 11 isolados de R. equi das queixadas, 90,9% (n=10/11) foram obtidos de linfonodos mesentéricos e apenas 9,1% (n=1/10) de linfonodo mediastínico. Nos 25 isolados de R. equi dos catetos, 40,0% (10/25) foram obtidos de linfonodos mesentéricos, 36,0% (9/25) de submandibulares e 24,0% (6/25) de mediastínicos. Não foram identificados genes vapA, vapB e vapN entre os isolados de R. equi. Foi isolado Mycobacterium sp. de 3,03% (10/330) do total de linfonodos. Entre os 10 isolados de micobactérias, 60% (n=6/10) dos linfonodos eram de queixadas e 40% (4/10) de catetos. Dez espécies de Mycobacterium foram detectadas por PCR-PRA, com predominância de M. avium tipo 1. O sequenciamento dos genes hsp65 e rpob revelaram micobactérias saprófitas (M. sinense, M. kumamotonense) e potencialmente patogênicas (M. colombiense, M. intracellulare) para humanos e animais. Esta é a primeira descrição de R. equi e / ou espécies de micobactérias identificadas nos linfonodos de espécimes de Tayassuideos. Apesar da ausência de genes Vap, a identificação de R. equi, bem como de micobactérias não tuberculosas e saprófit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Virulence-associated proteins (vapA, vapB and vapN genes) of Rhodococcus equi and Mycobacterium species isolated from 330 lymph nodes of collared peccaries (Tayassu tajacu) and white-lipped peccaries (Tayassu pecari) intended for human consumption were investigated. Thirty-six (10.9%) R. equi strains were isolated, 3.3% (11/330) from white-lipped peccary and 7.6% (25/330) of collared peccary lymph nodes. Among the 11 isolates of R. equi of the white-lipped peccaries, 90.9% (n = 10/11) were obtained from mesenteric lymph nodes and only 9.1% (n = 1/10) of the mediastinal lymph node. In the 25 isolates of R. equi obtained from collared peccaries, 40.0% (10/25) were recovered from mesenteric lymph nodes, 36% (9/25) from submandibular, and 24.0% (6/25) from mediastinal ones. No vapA, vapB, and vapN genes (plasmidless type) were identified among R. equi isolates. Mycobacterium sp. was isolated in 3.03% (10/330) of all lymph nodes analyzed. Among the 10 mycobacterial isolates, 60% (n = 6/10) were from white-lipped peccary, and 40% (4/10) from collared peccary lymph nodes. Ten Mycobacterium species were detected by PCR-PRA, with predominance of M. avium type 1. Sequencing of hsp65 and rpob genes revealed mycobacteria that were saprophytic (M. sinense, M. kumamotonense) and potentially pathogenic (M. colombiense, M. intracellulare) to humans and animals. To our knowledge, this is the first description of R. equi and/or mycobacteria species identified in the lymph nodes of Tayassuid sp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As micobactérias compreendem um grupo de organismos que são heterogêneos em termos de metabolismo, crescimento, nicho ambiental, epidemiologia, patogenicidade, distribuição geográfica e associação com doenças. O diagnóstico micobacteriológico é atualmente um desafio aos laboratórios. Com a descrição de novas espécies de micobactérias nos últimos anos, tem sido cada vez mais difícil identificar com precisão estas espécies. Uma questão básica na identificação em micobactérias é a diferenciação entre o Complexo Mycobacterium tuberculosis e as Micobactérias Não Causadoras de Tuberculose (MNT); no entanto tem sido cada vez mais importante a diferenciação das MNT. Em virtude das semelhanças fenotípicas e genotípicas, é necessário a aplicação e desenvolvimento de metodologias que melhor caracterizem as MNT para que seja possível determinar de forma mais precisa a prevalência das diferentes espécies. Além disso, diferentes espécies de MNT podem apresentar diferenças no perfil de sensibilidade às drogas terapêuticas, sendo que a identificação precisa é crucial para a adoção de terapia medicamentosa adequada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os isolados de MNT através da comparação entre duas técnicas moleculares, a técnica de PRA-hsp65 e um kit comercial GenoType® Mycobacterium CM, usando o método de sequenciamento do gene hsp65 como padrãoouro. Foram analisadas 96 isolados e a concordância entre os resultados do PRA-hsp65 e do GenoType® Mycobacterium CM foi de 92%. O método molecular PRA-hsp65 mostrou-se eficaz na identificação das espécies em 91% das amostras e o GenoType® Mycobacterium CM em 92%. Em relação aos custos referentes aos dois métodos, foi possível estabelecer que o PRA-hsp65 apresentou um valor final consideravelmente inferior ao do GenoType® Mycobacterium CM. No entanto, a técnica comercial necessita um prazo mais curto (2 dias) para ser realizada em comparação com a técnica PRA-hsp65 (requer 5 dias). Na nossa avaliação, a aplicabilidade do PRA-hsp65 aumenta a qualidade e rapidez do resultado final, já que se mostrou discriminatório, de baixo custo e relativamente de fácil execução na identificação de micobactérias. É possível concluir que ambas as técnicas moleculares avaliadas neste estudo apresentaram uma ótima capacidade de identificação de MNT, sendo que a implementação destas técnicas dependerá das características dos diferentes laboratórios bem como as necessidades clínicas das diferentes instituições. / Mycobacteria comprise a group of organisms that are heterogeneous in terms of metabolism, growth, environmental niche, epidemiology, pathogenicity, geographic distribution and disease association. The laboratory diagnosis of mycobacteria is currently a challenge to laboratories. Due to the increased description of new species of mycobacteria in recent years it is becoming difficult to accurately identify these species. A basic question in the identification of mycobacteria is the differentiation between Mycobacterium tuberculosis and the Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM); however it has been increasingly important to differentiate the NTM species. Due to the fact that there are phenotypic and genotypic similarities, it is necessary to apply and develop methodologies to better characterize the NTM to be able to determine more accurately the prevalence of different species. Furthermore, different NTM species may differ in the profile of sensitivity to therapeutic drugs, and accurate identification is crucial for the adoption of appropriate drug therapy. The objective of this study was to characterize NTM isolates by comparing two molecular techniques, the technique of PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis) and a commercial kit GenoType® Mycobacterium CM, using the sequencing the hsp65 gene as gold standard. We analyzed 96 samples and the concordance between the results of the PRA-hsp65 and the GenoType® Mycobacterium CM was 92%. The PRA-hsp65 molecular method proved to be effective in 91% of species identification and the GenoType® Mycobacterium CM in 92%. Regarding costs for the two methods, we could establish that the PRA-hsp65 had a final value considerably lower than the GenoType® Mycobacterium CM. However, the commercial technique requires a shorter period (2 days) to be performed in comparison with the technique PRA-hsp65 (requires five days). In our evaluation, the applicability of the PRA-hsp65 increases the quality and speed of the final result (in relation to traditional phenotypic identification or outsourcing in referral centers), and proved to be discriminatory, inexpensive and relatively easy to perform the identification of mycobacteria. Finally, we conclude that both molecular techniques evaluated in this study showed a great capacity for identification of NTM and that the implementation of these techniques. However, depend on the characteristics of different laboratories as well as the clinical needs of different institutions.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-30T21:17:29Z No. of bitstreams: 1 Juliana Perrone Bezerra De Menezes Avaliacao do papel... - 2005.pdf: 32348298 bytes, checksum: 109d71b2fb835421caaa135becd309de (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-30T21:17:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana Perrone Bezerra De Menezes Avaliacao do papel... - 2005.pdf: 32348298 bytes, checksum: 109d71b2fb835421caaa135becd309de (MD5) Previous issue date: 2005 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Micobactérias ambientais podem ser encontradas em água, solo, poeira, alimentos e animais. A importância do estudo dessas micobactérias tem aumentado nos últimos anos, principalmente, devido a predisposição de pacientes com imunodeficiência à infecção por essas espécies de micobactéria. Além disso, a exposição a micobactérias ambientais pode constituir um dos fatores associados à baixa eficácia da imunização com a vacina BCG. As manifestações da doença, assim como a manutenção da infecção micobateriana, dependem da interação entre a micobactéria e o sistema imune do hospedeiro. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a resposta de macrófagos peritoneais de camundongos susceptíveis BALB/c infectados com M intracellulare ou M fortuitum. Macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c foram infectados por M intracellulare ou M fortuitum e as diferenças entre essas duas espécies quanto à capacidade de infectar e sobreviver no interior de macrófagos primários, tratados ou não com IFN-y, e produzir óxido nítrico foram avaliadas. Foi observado que os macrófagos infectados com M fortuitum apresentam um maior percentual de células infectadas que aqueles infectados com M. intracellulare, após 4, 24 e 48 horas de infecção. Entretanto, tanto M. fortuitum quanto M intracellulare são capazes de sobreviver no interior de macrófagos peritoneais, pois não há alteração da carga bacilar dessa duas espécies de micobactéria ao longo da infecção. Observamos ainda que M. intracellulare induziu uma maior produção de óxido nítrico por macrófagos primários infectados e tratados por IFN-y que M fortuitum. No entanto, o pré-tratamento com IFN-y não alterou o percentual de células infectadas nem a viabilidade de M intracellulare ou M. fortuitum. Os dados obtidos neste trabalho mostram que, in vitro, M. fortuitum e M. intracellulare interagem de formas distintas, levando á diferentes respostas do macrófago e a destinos intracelulares distintos. Além disso, mostramos que M intracellulare e M. fortuitum são resistentes ao óxido nítrico produzido por macrófagos após ativação por IFN-y. / Environmental mycobacteria are found in water, soil, dust, food and animals. Environmental Mycobacterium importance has increased in the last few years, mostly because of immunodeficient patient predisposition to infection. Moreover, exposure to environmental mycobacteria could be associated to low levels of protection induced by immunization with BCG. Disease manifestations as well as infection outcome depend on interaction between mycobacteria and host immune system. The goal of this work was to evaluate peritoneal macrophage response, from the susceptible BALB/c mice, to M. intracellulare or M. fortuitum infection. Peritoneal inflammatory macrophages, pre-activated or not with IFN-y, were infected by M. intracellulare or M fortuitum and diferences between these two species related to the capacity to infect macrophages, to survive intracellularly and to induce NO production were evaluated. It was observed that the percentage of M. fortuitum-xnÍQoXQá cells was higher related to M. intracellulare-míecieá ones, after 4, 24 and 48 hours of infection. In addition, both M. fortuitum and M. intracellulare presented the ability to survive in peritoneal macrophages. It was also observed that in response to IFN-y activation, M. intracellulare induced higher NO production thanM fortuitum. However, pre-activation with IFN-y did not modify, neither the percentage of M. intracellulare and M. fortuitum infected cells, nor intracellular bacillum survival. These data demonstrate that, in vitro., M. fortuitum and M. intracellulare differently interact with macrophages, inducing diferent macrophage reponses and that both M. intracellulare and M fortuitum are resistant to NO production upon IFN-y activation.

Submitted by Regina Adriana de Oliveira Calsolari null (reginaocalsolari@hotmail.com) on 2016-03-29T12:32:41Z No. of bitstreams: 1 tesefinal290320162.pdf: 1741802 bytes, checksum: 7ee9a12184c5ee4dff772984cbbe4e58 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-29T20:34:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 calsolari_rao_dr_bot.pdf: 1741802 bytes, checksum: 7ee9a12184c5ee4dff772984cbbe4e58 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T20:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 calsolari_rao_dr_bot.pdf: 1741802 bytes, checksum: 7ee9a12184c5ee4dff772984cbbe4e58 (MD5) Previous issue date: 2016-03-01 / Estima-se que um em cada quatro brasileiros esteja infectado pelo bacilo de Koch, e apenas em 2013, 80 mil casos de tuberculose foram notificados ao Ministério da Saúde, dos quais 6,5 mil foram a óbito. O exame laboratorial para o diagnóstico da tuberculose é feito pelos seguintes métodos tradicionais: Baciloscopia (BAAR) e Cultura, considerada o padrão ouro, porém com um tempo de realização demorado (em torno de oito semanas). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método de amplificação de DNA que pode ser útil no diagnóstico diferencial da tuberculose com outras infecções pulmonares. Além disso, a PCR pode confirmar a identificação da micobactéria em materiais clínicos que apresentem uma difícil positividade. Objetivos – Avaliar a positividade de Mycobacterium spp. em diferentes materiais biológicos utilizando a técnica de PCR para os alvos Internal Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S rDNA e gene hsp 65. Material e métodos – Cento e trinta materiais biológicos de pacientes com suspeita de tuberculose pulmonar ou extrapulmonar foram investigados para pesquisa de Mycobacterium spp. por ITS-PCR e pesquisa de fragmento do gene hsp65, no período de março de 2012 a abril de 2013. Para identificação das espécies de micobactérias foi utilizada a pesquisa do gene IS6110, e técnica Restriction Enzyme Pattern Analysis (PCR-PRA). Para algumas amostras positivas pela PCR foi realizado o sequenciamento para identificação da espécie. Foram avaliados dados demográficos e condições associadas. A comparação entre as técnicas foi verificada pelo teste χ2. Das amostras pesquisadas no escarro foram calculadas a sensibilidade e especificidade da PCR e da baciloscopia em relação à cultura. Foi considerado estatisticamente significante quando o valor do p foi < 0,05. Resultados - A positividade da técnica de PCR (31,6%) foi maior quando comparada ao BAAR (23,4%) e cultura (22,4%), (p=0,00). A sensibilidade e especificidade da baciloscopia em relação à cultura foram de 100% e 54%, respectivamente. Na comparação do PCR para as amostras de escarro a sensibilidade foi de 100% e especificidade de 81%. Ao avaliarmos os fatores de risco observamos uma associação positiva entre BAAR positivo, PCR positivo e cultura positiva com consumo de álcool e entre PCR positivo e tabagismo. Conclusão- O estudo demonstrou que a pesquisa de Mycobacterium spp. diretamente de materiais biológicos pela técnica de PCR pode ser uma perspectiva viável para diagnóstico, principalmente quando realizada em amostras extrapulmonares. / It is estimated that one in every four Brazilians is infected with Koch's bacillus, and just in 2013, eighty thousand cases of tuberculosis were reported to the Department of Health, of which 6.5 million died. The laboratory test for the diagnosis of tuberculosis is made by the following traditional methods: baciloscopy and culture, considered the gold standard, but with a long holding time (around 8 weeks). Polymerase chain reaction (PCR) is a DNA amplification method that can be useful in the differential diagnosis of pulmonary tuberculosis with other infections. In addition, PCR can confirm the identification of mycobacteria in clinical materials that exhibit a difficult positivity. Objectives - To evaluate the positivity of Mycobacterium spp. in different biological materials using the PCR technique for the Internal Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S rDNA gene and hsp 65 targets. Materials and Methods - One hundred and thirty biological materials of patients with suspected pulmonary or extrapulmonary tuberculosis were investigated for Mycobacterium tuberculosis spp. by ITS-PCR research and gene fragment hsp65 research, from March 2012 to April 2013. To identify the species of mycobacteria was used the IS6110 gene research and PCR-PRA technique). For some positive samples was performed by PCR sequencing to species identification. They evaluated demographics and associated conditions. The comparison between the techniques was checked by χ² test. The samples surveyed in sputum were calculated sensitivity and specificity of PCR and baciloscopy in relation to culture. It was considered statistically significant when the p value was <0.05. Results - The PCR positivity (31.6%) was greater when compared to baciloscopy (23.4%) and culture (22.4%) (p = 0.00). The sensitivity and specificity of baciloscopy in relation to culture for sputum samples was 100% and 54%, respectively. When comparing the PCR for sputum samples, sensitivity was 100% and specificity of 81%. To evaluate the risk factors it was observed a positive association between baciloscopy positive, and culture positive with alcohol consumption and between PCR positive and smoking. Conclusion - The study demonstrated that the research for Mycobacterium spp. PCR directly from the biological material can be a viable approach to diagnosis, especially when performed in extrapulmonary samples.