Made available in DSpace on 2015-03-16T14:27:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 58.pdf: 1712271 bytes, checksum: 93bf6c39ef1a376063b88159e3f5cb2b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Relatos científicos descrevendo o surgimento de infecções por micobactérias de crescimento rápido (MCR) em vários países e a notificação nos últimos cinco anos em vários estados no Brasil de infecções hospitalares por MCRs levaram à publicação pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) da Resolução n° 51, de 21 de outubro de 2009, na qual é exigida dos fabricantes a comprovação da eficácia de desinfetantes hospitalares para artigos semicríticos contra, não somente a cepa de Mycobacterium bovis BCG Moreau, como também para Mycobacterium massiliense INCQS nº 00594. Isso agravou o problema já existente no Setor de Saneantes do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz da aquisição do enriquecimento Middlebrook ADC Enrichment, utilizado em grande volume na confecção de dois dos três meios de cultura, meio de Kirchners (K) e meio Middlebrook 7H9 (7H9), utilizados no Método Confirmatório para Avaliação da Atividade Micobactericida de Desinfetantes preconizado pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC), já que esse produto, além de muito caro, é fabricado somente pela Difco/BD/BBL e possui a validade de apenas oito meses a partir da data de fabricação, o que implica em um prazo curto para o seu emprego após cumprir todo o trâmite de importação. Esses fatores contribuíram para que este estudo fosse desenvolvido utilizando-se tanto o enriquecimento comercial ADC, quanto outro enriquecimento de valor mais acessível preparada em laboratório conforme Fonseca, Silva e Gontijo Filho (1985), constituído de soro fetal bovino e glicose (SFBG), a fim de dar subsídios para o desenvolvimento tecnológico de métodos na área de desinfetantes micobactericidas, de forma a não depender só do produto fabricado pela Difco/BD/BBL. Assim, o objetivo principal deste estudo foi comparar as diferentes curvas de crescimento de algumas micobactérias, M. bovis BCG Moreau INCQS nº 00062, M. massiliense INCQS nº 00594,... / Relatos científicos descrevendo o surgimento de infecções por micobactérias de crescimento rápido (MCR) em vários países e a notificação nos últimos cinco anos em vários estados no Brasil de infecções hospitalares por MCRs levaram à publicação pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) da Resolução n° 51, de 21 de outubro de 2009, na qual é exigida dos fabricantes a comprovação da eficácia de desinfetantes hospitalares para artigos semicríticos contra, não somente a cepa de Mycobacterium bovis BCG Moreau, como também para Mycobacterium massiliense INCQS nº 00594. Isso agravou o problema já existente no Setor de Saneantes do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz da aquisição do enriquecimento Middlebrook ADC Enrichment, utilizado em grande volume na confecção de dois dos três meios de cultura, meio de Kirchners (K) e meio Middlebrook 7H9 (7H9), utilizados no Método Confirmatório para Avaliação da Atividade Micobactericida de Desinfetantes preconizado pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC), já que esse produto, além de muito caro, é fabricado somente pela Difco/BD/BBL e possui a validade de apenas oito meses a partir da data de fabricação, o que implica em um prazo curto para o seu emprego após cumprir todo o trâmite de importação. Esses fatores contribuíram para que este estudo fosse desenvolvido utilizando-se tanto o enriquecimento comercial ADC, quanto outro enriquecimento de valor mais acessível preparada em laboratório conforme Fonseca, Silva e Gontijo Filho (1985), constituído de soro fetal bovino e glicose (SFBG), a fim de dar subsídios para o desenvolvimento tecnológico de métodos na área de desinfetantes micobactericidas, de forma a não depender só do produto fabricado pela Difco/BD/BBL. Assim, o objetivo principal deste estudo foi comparar as diferentes curvas de crescimento de algumas micobactérias, M. bovis BCG Moreau INCQS nº 00062, M. massiliense INCQS nº 00594, M. chelonae ATCC 35752, M. fortuitum ATCC 6841 e M. abscessus ATCC 19977, utilizando o enriquecimento ADC e o SFBG nos meios de cultura K e 7H9, e avaliar a qualidade de dois desinfetantes à base de glutaraldeído (A e B) e a suscetibilidade das MCR de referência frente a esses desinfetantes, aplicando os dois enriquecimentos. Através da análise estatística realizada com o teste de Kruskal-Wallis na avaliação da taxa de crescimento dos microrganismos, verificou-se que não houve diferença significativa na utilização dos dois enriquecimentos. No ensaio para avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes, os dois produtos foram ineficazes para M. bovis, M. massiliense, M. abscessus e M. fortuitum. Já M. chelonae foi eliminado somente pelo desinfetante B. Porém, estudos complementares são necessários para a finalização dos ensaios com a cepa de M. bovis BGC Moreau, e a realização de estudos de validação intra-laboratorial e inter-laboratorial relacionados à possível substituição do enriquecimento ADC pelo SFBG nos ensaios para avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes.

Submitted by Ana Paula Macedo (ensino@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:24:46Z No. of bitstreams: 1 André Alves Dias.pdf: 1077781 bytes, checksum: cd03feff417d4066f650aed71ed822f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 André Alves Dias.pdf: 1077781 bytes, checksum: cd03feff417d4066f650aed71ed822f6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A resposta imune inata local ativada pelo patógeno, através do seu reconhecimento por receptores como os toll-like (TLR), é determinante na natureza da resposta imune adquirida gerada após a infecção. Neste contexto, tem sido demonstrado que o reconhecimento do DNA micobacteriano rico em motivos CpG não metilados pelo receptor TLR-9 representa uma via importante na ativação da produção de IL-12 por celulas dendriticas favorecendo a subseqüente geração de resposta imune Th1. As micobacterias expressam em abundância uma proteína catiônica semelhante às histonas de outras bactérias, denominada Hlp, presente tanto no envelope como no nucleóide bacteriano. A Hlp localizada no envoltório micobacteriano tem sido implicada no processo de adesão das micobacterias ao epitélio respiratório visto que interage com proteoglicanas da superfície destas células. Por outro lado, foi mostrado que o complexo Hlp-CpG ativa a sinalização celular via TLR-9, induzindo a produção de mediadores inflamatórios em macrófagos in vitro e um aumento na resistência à infecção por Mycobacterium tuberculosis in vivo. As micobacterias penetram no hospedeiro através das vias aéreas superiores, e as células epiteliais expressam receptores da imunidade inata, contribuindo para a resposta imune inata local. Este trabalho teve como objetivo investigar a capacidade da proteína Hlp de ativar, quando combinada ou não ao oligonucleotideo sintético CpG, a resposta imune inata de células epiteliais alveolares. Para atingir este objetivo, utilizamos a proteína Hlp recombinante (rHlp) de M. bovis BCG. O complexo rHlp-oligonucleotideo CpG induziu uma produção aproximadamente 2 vezes maior de interleucina 8 (IL-8) em relação às células só estimuladas com CpG e de quase quatro vezes em relação aos níveis observados com a célula só estimulada com rHlp, indicando um sinergismo entre estes dois estímulos. Este mesmo efeito da Hlp sobre a CpG foi observada em macrófagos, quando a produção do fator de necrose tumoral alfa (TNFsintéticos derivados da sequencia da Hlp compreendendo os sítios de ligação a DNA e proteoglicanas, respectivamente, quanto à capacidade de mimetizar o efeito imunoestimulador da proteína inteira. Estes ensaios confirmaram que a presença de um sitio de ligação a DNA na molécula é essencial para sua atividade imunoestimuladora sobre o CpG. Finalmente, quando passamos a utilizar a micobacteria interia em vez da rHlp como estímulo, a adição de CpG ao M. smegmatis selvagem, mas não mutante para o gene hlp, aumentou a produção de IL-8 e RANTES pelas células epiteliais Os resultados descritos acima indicam que as células epiteliais respiratórias podem reconhecer micobacterias via TLR-9 e, assim, participar da resposta imune inata no sitio da infecção. Dentro deste contexto, aliado ao fato de tratar-se de uma proteína muito conservada encontrada em todas as micobactérias, a Hlp tem potencial de, quando combinada a DNA, ser empregada tanto como um bom imunógeno, assim como adjuvante em intervenções imunes contra as micobacterioses tais como a vacinação intranasal. / The local innate immune response induced by a pathogen at the site of infection, through its recognition by Toll-like receptors (TLRs), plays an important role in modeling the subsequent acquired immune response. In this context, it has been shown that recognition of mycobacterial DNA through its unmethylated CpG motifs by TLR-9 represents an important pathway for the production of IL-12 by dendritic cells favoring the subsequent generation of Th1 immune response. Mycobacteria express a major cationic histone-like protein (Hlp), which is present in the cell envelope and in the bacterial nucleoid. The bacterial surface-exposed Hlp has been implicated in mycobacterium adhesion on respiratory epithelium due to the capacity of Hlp to interact with cell surface proteoglycans. On the other hand, it has been shown that complexes of Hlp– CpG oligonucleotide activate cell signaling through TLR-9, inducing the production of inflammatory mediators in macrophages in vitro, and increasing resistance to Mycobacterium tuberculosis infection in vivo. The major port of entry of Mycobacteria in the host is the air way tract, and epithelial cells are known to express receptors of innate immunity and participate of local innate immune response. The objective of the present study was to investigate the capacity of Hlp to activate an innate immune response in alveolar epithelial cells. Cells were stimulated with M. bovis BCG recombinant Hlp (rHlp), combined or not with CpG oligonucleotide. The Hlp-CpG complex induced interleukin 8 (IL-8) production twice higher than the cell stimulated only with CpG, and 4 times higher than the cell treated only with Hlp, indicating a synergism between these two stimuli. The same effect was also observed in macrophages when the production of tumor necrosis factor- (TNF- ) was measured. We also tested the capacity of synthetic peptides displaying amino acid sequences identical to the Hlp DNA and proteoglycan binding sites for their ability to mimic the immune stimulatory effect of the whole protein. These assays confirmed that the presence of a DNA-binding site in the molecule is essential of its immune stimulating activity over CpG. Finally, the addition of CpG to wild type M. smegmatis, but not to the mutant strain for the gene hlp, increased the production of IL-8 and RANTES by epithelial cells. The results described above indicate that respiratory epithelial cells can recognize mycobacteria via TLR-9 and thus participate of the innate immune response at the site of infection. These observations, in addition to the fact that Hlp is a very conserved protein found in all mycobacteria, suggest that when combined with DNA Hlp can be potentially used both as a good immunogen, as well as an adjuvant, in immune interventions against mycobacteria such as intranasal vaccination.

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:18:46Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69441.pdf: 2989051 bytes, checksum: 8e1f78fb34fb10ed6a62ddab3e860e85 (MD5) 69441.pdf.txt: 252167 bytes, checksum: fa3f048c557c5ecc17e4f0b7176dacb5 (MD5) 69441.pdf.jpg: 1240 bytes, checksum: f1b121f954ab809e4e361e03e07c42ac (MD5) Previous issue date: 2014-05-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / O gênero Mycobacterium possui mais de 160 espécies, dentre elas importantes patógenos como M. leprae, M. tuberculosis e M. bovis. Embora muito se conheça sobre estes patógenos, poucos estudos se concentraram na caracterização detalhada de micobactérias não-tuberculosas (MNT), que apresentam distribuição ambiental variada e são oligotróficas. Embora muitas sejam consideradas saprófitas, acredita-se que a infecção sub-clínica de animais e humanos esteja subestimada. A infecção por MNT ambientais é considerada como um dos fatores que modulam a resposta protetora conferida pela vacina BCG. Neste contexto, o presente estudo tem como foco a caracterização das MNT de crescimento rápido provenientes da Coleção de Bactérias da Mata Atlântica (CBMA) do IOC/FIOCRUZ, com dois objetivos principais: (1) caracterizar espécies que possam ser utilizadas no desenvolvimento de um novo sistema de expressão de proteínas heterólogas e (2) identificar antígenos e vias metabólicas compartilhadas entre espécies patogênicas e saprófitas. Os isolados obtidos da CBMA/IOC foram cultivados em meios LB contendo Tween 80, sob agitação a 25 °C. Foram geradas curvas de crescimento a partir da leitura da DO a 600 nm de triplicatas biológicas, e determinadas características morfológicas. Diversos testes bioquímicos foram realizados para uma melhor caracterização desses isolados O perfil de secreção de proteínas ao longo do crescimento foi verificado por SDS-PAGE, a presença de proteases secretadas avaliada por zimografia e a presença e atividade de celulases foi verificada através de western blot, zimografia e ensaio enzimático. A capacidade de transformação por DNA plasmidial foi avaliada por eletroporação. Também foram propostos agrupamentos filogenéticos com base na análise de sequências de regiões dos genes 16S rRNA (rrs) e hsp65. Em paralelo, foi verificada por western blot a presença de antígenos micobacterianos comuns, já descritos como tendo papel importante na geração de resposta imune (Mpt64, Mpt70, Mpt83 e antígenos do complexo 85) ou no metabolismo e sobrevivência do M. tuberculosis (GlnA1 e HspX). O perfil de crescimento e as características morfológicas e bioquímicas dos isolados parecem confirmar o agrupamento filogenético proposto. Atividade celulásica foi observada em apenas dois isolados, apesar de todos expressarem esta proteína, e não foi encontrada atividade proteásica no filtrado de cultura nas condições testadas Todos os isolados são transformáveis, mas apresentam diferenças quanto à eficiência e integridade do vetor. As análises por western blot revelaram a presença de proteínas do complexo 85, Mpt70 e GlnA1 e ausência de reatividade para os antígenos Mpt64, Mpt83 e HspX. Desse modo, três isolados foram selecionados para prosseguir com o desenvolvimento do novo sistema de expressão de proteínas heterólogas secretadas. A presença de alguns antígenos compartilhados fornecem novos subsídios para elucidar a relação entre MNT e vacina BCG / The genus Mycobacterium has more than 160 species, among them important pathogens such as M. leprae, M. tuberculosis and M. bovis. Although much is known about these pathogens, few studies have focused on the detailed characterization of non-tuberculous mycobacteria (NTM), which present wide environmental distribution and are oligotrophic. While many are considered saprophytes, it is believed that the subclinical infection of humans and animals is underestimated. The environmental NTM infection is considered as one of the factors that modulate the protective response provided by BCG vaccine. In this context, the present study focuses on the characterization of rapidly growing MNT from the Atlantic Forest Bacterial Collection (CBMA - Coleção de Bactérias da Mata Atlântica, IOC / FIOCRUZ), with two main objectives: (1) characterize species which may be used to develop a new system for heterologous protein expression and (2) to identify antigens and metabolic pathways shared between pathogenic species and saprophytes. The isolates obtained from CBMA/IOC were grown in LB media containing Tween 80, under agitation, at 25 °C. Growth curves were generated from the reading of the OD at 600 nm of biological triplicates, and certain morphological characteristics were determined. Several biochemical tests were performed to better characterize these isolates. The profile of secreted proteins was verified by SDS-PAGE along the growth curves, the presence of secreted proteases evaluated by zymography and the presence and activity of cellulases was verified by western blot, enzymatic assay and zymography. The transformation capacity of the individual isolates was evaluated by electroporation of plasmid DNA. Phylogenetic groupings were also proposed based on sequencing of regions from the 16S rRNA (rrs) and hsp65 genes. In parallel, the presence of shared mycobacterial antigens described as playing important roles in generating immune responses (Mpt64, Mpt70, Mpt83 and antigen 85 complex) or in metabolism and survival of M. tuberculosis, was verified by western blot. The growth profile and the morphological and biochemical characteristics of the isolates appear to confirm the phylogenetic grouping proposed. Cellulase activity was observed in only two strains, although all express this protein; protease activity was not found in the culture filtrate under the conditions tested. All isolates are transformable, but differ as to the efficiency and integrity of the vector. Western blot analysis revealed the presence of Ag85 complex, Mpt70 and GlnA1 and absence of reactivity for the Mpt64 and Mpt83 antigens as well as HspX. Thus, three isolates were selected to proceed with the development of a new heterologous protein expression system. The presence of some shared antigens provide new information to elucidate the relationship between NTM and BCG vaccine.

We aimed to characterize well-know PIDs, novel genetic defects and immunopathological mechanisms in Brazilian patients with susceptibility to mycobacterial diseases. The patients developed different mycobacterial diseases and M. tuberculosis was the most frequent species. Molecular and genetic analysis revealed mutations in different genes: RAG1 (P1), CD40LG (P2, P3, P4), NEMO (P5), NCF1 (P6), TLR2 (P7) IL-12Rb2 (P8), IL-12Rb1 (P9), TLR10 (P10), DKC1(P11), SOCS-1(P12) and IRAK2 (P13). Finally, MDMs from patients phagocytose normally but were unable to appropriately control intracellular M. tuberculosis growth in comparison to MDMs from healthy subjects. We concluded that the Brazilian patients have heterogeneous mutations previously associated with susceptibility to mycobacterial diseases and novel genetic variations were identified suggesting novel PIDs. In addition, the inability of MDMs to control the intracellular growth of M. tuberculosis indicates this contributes to patients´ susceptibility to mycobacterial infections. / Objetivamos identificar novos defeitos genéticos e mecanismos imunopatológicos em pacientes brasileiros com suscetibilidade a infecções por micobactérias. Os pacientes foram investigados se portadores de imunodeficiencias previamente caracterizadas tais como SCID, deficiência de CD40L, MSMD, defeitos na sinalização via TLRs e CGD. A análise genética foi realizada por sequenciamento Sanger e \'\'whole exome sequencing\'\' para identificar possíveis novas imunodeficiências primárias. Além disso a função dos macrófagos dos pacientes foi avaliada. Infecções por diferentes espécies de micobactérias foram apresentadas pelos pacientes, sendo M. tuberculosis a espécie mais frequentemente identificada. Mutações em diferentes genes foram encontradas: RAG1 (P1), CD40LG (P2, P3, P4), NEMO (P5), NCF1 (P6), TLR2 (P7), IL-12Rb2 (P8), IL-12Rb1 (P9), IRAK2 (P10), SOCS-1 (P11) e TLR10 (P12). MDMs dos pacientes fagocitaram normalmente M. tuberculosis, porém reduzida capacidade em inibir o crescimento da M. tuberculosis foi observada. Concluímos que os pacientes estudados possuem defeitos moleculares heterogêneos e que os MDMs desses indivíduos apresentam falhas no controle do crescimento da M. tuberculosis. Nossos dados sugerem que esses são fatores subjacentes à susceptibilidade a infecções por micobactérias nesses indivíduos.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-27 / Micobactérias não tuberculosas (MNT) são bactérias ubiquitárias e equipadas para suportar diferentes temperaturas e falta de nutrientes. Elas também possuem resistência a muitos desinfetantes e antimicrobianos. Várias espécies do gênero Mycobacterium já foram associadas a biofilmes em instrumentais cirúrgicos e sistemas de água em ambientes hospitalares e isso tem importantes implicações em epidemiologia, sobrevida no meio ambiente e resistência a biocidas e antimicrobianos. Micobactérias de crescimento rápido (MCR) têm causado surtos de infecções em procedimentos invasivos, como cirurgias plásticas e oftalmológicas, cirurgias por via laparoscópica e procedimentos de estética. Este estudo teve como objetivo investigar a capacidade de cepas de MCR com fenótipos diferentes (liso e rugoso), especialmente da espécie Mycobacterium massiliense, de formar biofilmes, comparando cepas relacionadas a surtos e cepas não relacionadas a qualquer surto. Vinte e sete isolados foram analisados quanto à adesão das bactérias a diferentes suportes abióticos na presença de diferentes soluções. Foram obtidas curvas de crescimento das bactérias aderidas a placas de poliestireno usando resazurina como indicador. Foram também analisadas a produção de glicopeptideolipídeo e polissacarídeos na parede bacteriana e a capacidade de deslizamento das bactérias em meio semissólido. As bactérias aderidas foram visualizadas em microscópio óptico e por microscopia eletrônica. Os resultados obtidos com micobactérias relacionadas ou não a surtos foram similares. A presença de glutaraldeído 2% inibiu a aderência ao plástico de cepas com fenótipo rugoso. Com esses resultados, concluímos que a formação de biofilmes não diferencia, isoladamente, cepas de surto de cepas não relacionadas a surtos, sejam elas de fenótipo liso ou rugoso. É mais provável que um conjunto de fatores possa facilitar a seleção de determinadas cepas mais adaptadas para causar infecções e com potencial para gerar surtos. A identificação e a caracterização destes fatores poderão contribuir para o controle de novos surtos e a vigilância epidemiológica de infecções causadas por estes patógenos oportunistas. / Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM) are ubiquitously distributed bacteria equipped to support different temperatures and lack of nutrients. They also show resistance to diverse disinfectants and antimicrobials. Several Mycobacterium species have been associated to biofilms in surgical equipment and water systems in hospital environment and this has important implications in epidemiology, survival in the environment and resistance to biocides and antimicrobials. Rapidly-Growing Mycobacteria (RGM) have been associated to outbreaks of infections in invasive procedures, as plastic and ophthalmological surgeries, laparoscopic surgeries and cosmetic procedures. The objective of this study was to investigate the capacity of RGM with different phenotypes (smooth and rough), especially Mycobacterium massiliense, of forming biofilms, by comparison of isolates related to outbreaks with isolates not related to outbreaks. Twenty-seven isolates were analyzed with respect to adhesion to different abiotic supports in the presence of different solutions. Growth curves were obtained using resazurin as indicator. The production of glycopeptidolipids and polysaccharides in the cell wall and the sliding motility in semisolid medium were also analyzed. Bacteria adhered to solid supports were visualized through optical and electronic microscopes. Results obtained with outbreak-related isolates and isolates not related to outbreaks were similar. The presence of 2% glutaraldehyde inhibited the adhesion of rough colony phenotype bacteria to plastic. With these results we concluded that biofilm formation capacity cannot differentiate outbreak-related isolates from isolates not related to outbreaks, or rough from smooth phenotype bacteria. It is possible that a collection of factors may facilitate the selection of particular strains more adapted to cause infections and with potential to originate outbreaks. The identification and characterization of these factors could contribute to the control of new outbreaks and to the epidemiological surveillance of infections by these opportunistic pathogens. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-06-08T13:58:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 36.pdf: 6773155 bytes, checksum: bd69a99ee0ef41b4ee959038b0d58be7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Esta Tese aborda as infecções pulmonares e extrapulmonares, os fatores associados para o adoecimento por micobactérias não tuberculosas (MNT), a diversidade e a frequência das espécies de MNT, além do diagnóstico das micobacterioses no estado de Pernambuco, região nordeste brasileira. Os resultados são apresentados em três artigos científicos que respondem a seus objetivos. O primeiro artigo destaca as lacunas no diagnóstico convencional das micobacterioses e avalia uma PCR Multiplex na diferenciação de espécies de MNT como método auxiliar no diagnóstico diferencial entre as micobacterioses e a tuberculose. O segundo trás o primeiro relato no Brasil de infecção extrapulmonar por Mycobacterium wolinskyi diagnosticada após procedimento cirúrgico invasivo em serviço privado do estado. O terceiro artigo descreve o perfil clínico, epidemiológico, laboratorial e fatores associados aos casos de micobacterioses pulmonar por MNT, como também a frequência, diversidade e perfil de resistência aos antimicrobianos das espécies de MNT no estado de Pernambuco que é sabidamente uma região endêmica para tuberculose. Conclui-se que as técnicas de biologia molecular (PCR multiplex, PRA-hsp65 e sequenciamento de genes específicos) podem ser ferramentas valiosas para identificação das espécies de micobactérias reduzindo o tempo necessário para diagnóstico correto e início do tratamento adequado. Os casos de micobacteriose extrapulmonar, no estado de Pernambuco, foram identificados em mulheres submetidas a procedimentos cirúrgicos invasivos (mamoplastia e abdominoplastia) e as espécies associadas a estes casos foram as micobactérias de crescimento rápido (MCR). Os casos de infecção pulmonar foram a maioria (84 por cento) entre as infecções por MNT no estado de Pernambuco. As principais características encontradas nestes casos foram: Sexo masculino, idade superior a 50 anos e estória de infecção prévia por tuberculose. Neste contexto, faz-se necessário o diagnóstico diferencial entre tuberculose e doença pulmonar por MNT, sobretudo em indivíduos com relato de tuberculose anterior ou que falharam o tratamento para TB

Made available in DSpace on 2016-07-01T12:30:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf: 2485159 bytes, checksum: 4635cdb126d5d6a4d6de189df627fe73 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:43Z (GMT). No. of bitstreams: 3 mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf.txt: 155225 bytes, checksum: a4a9286f9502f99361f8f66b55758259 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf: 2485159 bytes, checksum: 4635cdb126d5d6a4d6de189df627fe73 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Teresina, PI, Brasil / Nas infecções causadas pelo gênero Mycobacterium identificar a espécie é importante para distinguir entre as cepas e agrupá-las por critérios de interesse para microbiologistas e clínicos, influenciando inclusive no esquema de tratamento a ser aplicado. Segundo a World Health Organization, em 2014 a tuberculose atingiu o mesmo patamar que a infecção por HIV (Human Immunodeficiency Virus) em relação à mortalidade. Por outro lado, as micobacterioses por micobactérias não tuberculosas (MNT) vêm aumentando, mas como não é de notificação compulsória, pouco se sabe da diversidade de espécies que acometem os pacientes no estado do Piauí. Assim, o presente estudo teve como objetivo, estimar a frequência de infecção por Complexo Mycobacterium tuberculosis e MNT, correlacionar os métodos microbiológios e moleculares utilizados na sua identificação e descrever o perfil de sensibilidade a tuberculostáticos nas amostras de M. tuberculosis, isoladas de pacientes referenciados ao Laboratório Central de Saúde Pública do Piauí (LACEN-PI) no período de janeiro 2014 a março de 2015. Para tal, foi realizado estudo descritivo transversal em 142 espécimes clínicos de pacientes, correspondendo a 20,1% dos casos suspeitos enviados ao LACEN-PI. Na maioria dos casos a espécie M. tuberculosis foi identificada (69,7%; 99/142) e em 9,9% (14/142) foram isoladas MNT. O restante dos casos (20,4%; 29/142) não foi possível fazer o diagnóstico definitivo. As espécies de micobactérias não tuberculosas identificadas foram M. abscessus (3,5%); M. avium (1,4%), M. intracelullare (1,4%), M. asiaticum (0,7%), M.szulgai (0,7%) e M. kansasii (0,7%), e maioria dos casos era do sexo masculino (63,4%; 9/14) e apenas 1/64 (1,6%) era HIV positivo Comparando os métodos laboratoriais utilizados na identificação de M. tuberculosis foi evidenciado 100% de concordância entre a plataforma automatizada geneXpert (Xpert MTB/ RIF) e o cultivo microbiológico in vitro, em 56 espécimes de pacientes com pneumopatia pulmonar. A frequência de amostras resistentes às drogas testadas foi de 7,8% (5/64), das quais, três eram multidroga resistente e uma extensivamente resistente. Conclui-se que, as infecções por M. tuberculosis foram mais frequentes que as causadas por micobactérias não tuberculosas e a resistência às drogas apresentou-se mais elevada que a taxa mundial (3,3%). As espécies MNT identificadas são potencialmente patogênicas e é importante notar que por questões metodológicas não foi possível confirmar os 20,4% dos suspeitos, portanto, maior atenção deve ser dada na correta coleta dos espécimes clínicos. A utilização da metodologia Xpert na rotina laboratorial, comparada a metodologias microbiológicas, demonstrou alta sensiblidade e especificidade na detecção de resistência à rifampicina e rapidez na produção do resultado / Abstract: In infections caused by Mycobacterium genus identify the species is important to distinguish between strains and group them by criteria of interest to microbiologists and clinicians, including influencing the treatment regimen to be applied. According to the World Health Organization, in 2014 TB reaches an equal footing that of the HIV (Human Immunodeficiency Virus) infection on mortality. On the other hand, mycobacteriosis by nontuberculous mycobacteria (NTM) has increased, however as it is not of mandatory notification and little is known about the diversity of species that affect patients in the state of Piaui. The present study aimed to estimate the frequency of Mycobacterium tuberculosis and NTM infections, correlate the microbiological and molecular methods used to identify them and describe the sensibility profile of the TB drugs in M. tuberculosis samples isolated from patients referred to t the Piaui State Public Health Central Laboratory (LACEN-PI), from January 2014 to March 2015. To this end, a cross-sectional descriptive study was performed on 142 clinical specimens of patients, corresponding to 20.1% of suspected cases submitted to LACEN-PI. In most cases the species M. tuberculosis was identified (69.7%, 99/142) and 9.9% (14/142) were isolated NTM. In the remaining cases (20.4%; 29/142) it was not possible to make a conclusive diagnosis. The nontuberculous mycobacteria species identified were M. abscessus (3.5%); M. avium (1.4%), M. intracelullare (1.4%), M. asiaticum (0.7%), M. szulgai (0.7%) and M. kansasii (0.7%) in most of the cases the subjects were male (63.4%; 9/14) and only 1/64 (1.6%) were HIV positive. Comparing the laboratory methods used in the identification of M. tuberculosis 100% agreement was evidenced between the automated platform GeneXpert (Xpert MTB/RIF) and the microbiological culture in vitro, in 56 specimens of patients with pulmonary pneumonitis The frequency of strains resistant to the tested drugs was 7.8% (5/64), of which three were multidrug-resistant and one was extensively drug-resistant. In conclusion, the M. tuberculosis infections were more frequent than those caused by nontuberculous mycobacteria and drug resistance was found to be higher than the global rate (3.3%). The identified NTM species are potentially pathogenic and it is important to note that for methodological issues 20.4% of the suspects could not be confirmed, therefore, greater attention should be paid to the correct collection of clinical specimens. The use of the Xpert method in laboratory routine compared to microbiological methods showed high sensibility and specificity to the detection of rifampicin resistance and speed in the result production

Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Banca: Lucilaine Ferrazoli / Banca: Carmo Elias Andrade Melles / Banca: Wagner Vilegas / Banca: Antonio Carlos Massabini / Resumo: O aumento de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes às drogas utilizadas no esquema de tratamento convencional, principalmente por falha terapêutica, têm levado os pesquisadores à busca de novas drogas. Entretanto, faz-se necessário desenvolver novas metodologias para a determinação da atividade bactericida destes compostos. Este estudo descreve a padronização de uma metodologia rápida para triagem de atividade intra e extracelular de novos compostos, empregando Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294 e Mycobacterium tuberculosis Erdman ATCC 35801, ambas contendo o plasmídio pSMT1 com o gene luxA e luxB proveniente do Vibrio harveyi. A rifampicina e a isoniazida foram empregadas como droga de referência na padronização da técnica da luciferase extracelular, obtendo-se resultados de Concentração Inibitória Mínima de 0,03 μg/mL, para ambas as drogas, valores estes compatíveis com os da técnica de Alamar Blue. Para a padronização da técnica da luciferase intracelular foi utilizado o M. tuberculosis Erdman ATCC 35801 contendo o plasmídio pSMT internalizado em células de macrófagos J774. A droga de referência empregada foi a rifampicina obtendo-se um...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There has been an increase of Mycobacterium tuberculosis strains that are resistant to the current anti-TB agents, mainly through acquired resistance by therapeutic failure. This fact has underscored the need of a quick development of antimycobacterial drugs that are more effective than those currently in use. Moreover, new methodologies to determine the bactericidal activity of these compounds have been proposed. This study describes the use of bioluminescent strains of Mycobacterium tuberculosis H37Rv - ATCC 27974 and Mycobacterium tuberculosis Erdman ATCC 35801 both containing the plasmid pSMT1 constructed with luxA and luxB genes from Vibrio harveyi in a screening to evaluate the antimycobacterial activities of anti-TB agents. Standardization of the technique was performed using isoniazid and rifampicin, as drugs standard. The results of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) were 0.03 μg/mL and 0.03 μg/mL, respectively. These values were totally compatible with those obtained by Microplate Alamar Blue Assay (MABA). Standardization of bioluminescence measurements of intracellular antimycobacterial activity was performed using the J774 murine...(Complete abstract, click electronic access below) / Doutor

We aimed to characterize well-know PIDs, novel genetic defects and immunopathological mechanisms in Brazilian patients with susceptibility to mycobacterial diseases. The patients developed different mycobacterial diseases and M. tuberculosis was the most frequent species. Molecular and genetic analysis revealed mutations in different genes: RAG1 (P1), CD40LG (P2, P3, P4), NEMO (P5), NCF1 (P6), TLR2 (P7) IL-12Rb2 (P8), IL-12Rb1 (P9), TLR10 (P10), DKC1(P11), SOCS-1(P12) and IRAK2 (P13). Finally, MDMs from patients phagocytose normally but were unable to appropriately control intracellular M. tuberculosis growth in comparison to MDMs from healthy subjects. We concluded that the Brazilian patients have heterogeneous mutations previously associated with susceptibility to mycobacterial diseases and novel genetic variations were identified suggesting novel PIDs. In addition, the inability of MDMs to control the intracellular growth of M. tuberculosis indicates this contributes to patients´ susceptibility to mycobacterial infections. / Objetivamos identificar novos defeitos genéticos e mecanismos imunopatológicos em pacientes brasileiros com suscetibilidade a infecções por micobactérias. Os pacientes foram investigados se portadores de imunodeficiencias previamente caracterizadas tais como SCID, deficiência de CD40L, MSMD, defeitos na sinalização via TLRs e CGD. A análise genética foi realizada por sequenciamento Sanger e \'\'whole exome sequencing\'\' para identificar possíveis novas imunodeficiências primárias. Além disso a função dos macrófagos dos pacientes foi avaliada. Infecções por diferentes espécies de micobactérias foram apresentadas pelos pacientes, sendo M. tuberculosis a espécie mais frequentemente identificada. Mutações em diferentes genes foram encontradas: RAG1 (P1), CD40LG (P2, P3, P4), NEMO (P5), NCF1 (P6), TLR2 (P7), IL-12Rb2 (P8), IL-12Rb1 (P9), IRAK2 (P10), SOCS-1 (P11) e TLR10 (P12). MDMs dos pacientes fagocitaram normalmente M. tuberculosis, porém reduzida capacidade em inibir o crescimento da M. tuberculosis foi observada. Concluímos que os pacientes estudados possuem defeitos moleculares heterogêneos e que os MDMs desses indivíduos apresentam falhas no controle do crescimento da M. tuberculosis. Nossos dados sugerem que esses são fatores subjacentes à susceptibilidade a infecções por micobactérias nesses indivíduos.

Introdução - A urbanização desencadeia inúmeros transtornos, como a disseminação de artrópodes e, conseqüentemente, de doenças veiculadas pelos mesmos. As formigas são muito adaptáveis e se beneficiam com a convivência humana. Nos hospitais, elas podem ser vetores mecânicos de inúmeras bactérias, e a diversidade de espécies encontradas nestes ambientes, causam preocupação pelo risco potencial à saúde pública. O aumento das infecções hospitalares envolvendo micobactérias ambientais, com surtos no Brasil entre 1998 a 2009 em 23 estados alarmou os órgãos e profissionais de saúde pública. Objetivos - Avaliar o potencial de formigas como vetores de micobactérias em um hospital especializado no atendimento de doentes com tuberculose. Métodos - Foram realizadas seis coletas de formigas em diferentes áreas do hospital no período de 2009 a 2010, que foram semeadas em meios de cultura de Löwenstein-Jensen e de Stonebrink para isolamento de micobactérias. As culturas sugestivas foram submetidas à coloração de Ziehl-Neelsen para bacilos álcool-ácido resistentes e identificação por métodos moleculares (PRA para o gene hsp65 com o par de primers TB11 e TB12 gênero-específico e sequenciamento genético do DNA). Resultados - Do total de 247 amostras de formigas coletadas e semeadas, 70 por cento das formigas pertenciam à espécie Tapinoma melanocephalum, 25 por cento a espécie Dorymyrmex sp., 3 por cento a espécie Camponotus sp. e 2 por cento a espécie Pheidole sp., dados similares foram observados anteriormente em pesquisas realizadas em hospitais. Quinze amostras apresentaram bacilos álcool-ácido resistentes de crescimento rápido. Nos métodos moleculares, doze pertenciam ao Gênero Mycobacterium. No PRA-hsp 65, e no sequenciamento genético do DNA, quatro amostras foram identificadas quanto à espécie (duas Mycobacterium chelonae, uma Mycobacterium parafortuitum e uma Mycobacterium murale), quatro micobactérias com resultados idênticos no PRA e não identificadas no sequenciamento foram sugestivas de uma nova espécie, e duas amostras não foram identificadas. Mycobacterium chelonae isolada nesta pesquisa foi previamente descrita como agente causador de abscessos em humanos. Conclusão - Estes dados confirmam a presença de micobactérias veiculadas por formigas no ambiente hospitalar, representando um potencial vetor mecânico destas para pacientes e profissionais de saúde, principalmente em infecções nosocomiais / Introduction- Urbanization triggers numerous disorders, such as the dissemination of arthropods and, consequently, dissemination of diseases transmitted by them. Some ant species are very adaptable to the human environment. At hospitals, once they are mechanical vectors of bacteria, and the diversity of species found in these environments, they can represent a potential risk to public health. The increase of nosocomial infections involving environmental mycobacteria, with outbreaks in Brazil from 1998 to 2009 in 23 states called the interest of health professionals and health agencies. Purpose - Evaluate the potential of ants as vectors of mycobacteria in a hospital specialized in the care of patients with tuberculosis. Methods Samples of ants were collected from different areas of the hospital from 2009 to 2010, and workers were inoculated in Löwenstein-Jensen and Stonebrink media for mycobacteria isolation. The suggestive cultures were subjected to Ziehl-Neelsen stain for acid-fast bacilli and identification were performed by molecular methods (PRA for the hsp65 gene with the pair of primers TB11 - TB12 and genetic sequencing). Results - The total of 247 samples of ants collected and sown, 70 per cent belonged to species of ants Tapinoma melanochepalum, 25 per cent Dorymyrmex sp.,3 per cent Camponotus sp. and 2 per cent Pheidole sp., data similar with previous studies conducted in hospitals. Fifteen fast-growing mycobacteria were isolated. In molecular methods, twelve belonged to the genus Mycobacterium. In PRA-hsp65, and the genome sequencing of DNA, four samples were identified at species level (two Mycobacterium chelonae, one Mycobacterium parafortuitum and one Mycobacterium murale), four mycobacteria with similar results in the PRA and not identified in the sequencing, suggestive of a new species and two unidentified samples. M. chelonae was previously reported as causative agent of abscess in humans. Conclusions - These results confirm the presence of mycobacteria carried by ants in the hospital, representing a potential mechanical vector for these patients and healthcare professionals, particularly in nosocomial infections