Estudos epidemiológicos estabelecem uma associação evidente entre poluição do ar e o aumento de morbimortalidade cardiovascular e respiratória. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos do material particulado fino (MP2,5) sobre o organismo ainda estão pouco esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o impacto da exposição ao MP2,5 sobre a biologia do endotélio pulmonar e do coração, através da avaliação do perfil de expressão gênica por microarray. Camundongos adultos fêmeas foram anestesiados e submetidos à instilação intratraqueal de MP2,5 (grupo exposto) ou veículo (grupo controle). Os animais foram sacrificados 12 a 18 horas após a instilação e pulmão, coração e sangue da veia cava inferior foram coletados. Os pulmões foram dissociados com colagenase tipo I e células endoteliais foram positivamente selecionadas por captura imuno-magnética através de micro-ímãs acoplados a anti-CD31. O cRNA derivado de endotélio pulmonar e de coração total foi hibridizado em membrana de microarray de baixa densidade desenhada para representar genes relevantes à biologia endotelial. Os genes encontrados diferencialmente expressos no pulmão foram Itgb1, Cxcl1, Tnf, Ecgf1 e Tnfaip3 (hiper-expressos em expostos a MP2,5) e Enpep, Pdgfra, Gzmb, Birc2, Npr1, Angpt1, Cxcl5 e Il7 (hipo-expressos). Não foi possível realizar análise de inferência estatística de membranas do coração neste trabalho. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos exposto e controle na contagem sangüínea de neutrófilos, linfócitos ou plaquetas, apesar dos dois grupos apresentarem plaquetose. Os achados indicam que MP2,5 altera a transcrição de genes envolvidos não só na inflamação e estresse oxidativo, mas também no tônus e remodelamento vascular, que podem ser os responsáveis pelos efeitos cardiovasculares agudos do MP2,5 / Epidemiological studies establish a clear association between air pollution and increased cardiovascular and respiratory morbidity and mortality. However, the molecular mechanisms underlying the effect of fine particulate matter (PM2,5) are still poorly understood. The aim of this study was to characterize the impact of exposure to PM2,5 on the biology of pulmonary endothelium and the heart, through the assessment of gene expression profiling by microarray. Adult female mice were anesthetized and submitted to intratracheal instillation of either PM2,5 (challenged group) or vehicle (control group). The animals were sacrificed 12 to 18 hours after instillation and lung, heart and blood samples from the inferior vena cava were collected. The lungs were dissociated with collagenase type I and endothelial cells were positively selected by immuno-magnetic capture through microbeads coupled to anti-CD31. The cRNA derived from the pulmonary endothelial cells and heart were hybridized to low-density microarray designed specifically to represent genes relevant to endothelial biology. Genes found differentially expressed in the lung were Itgb1, Cxcl1, Tnf, Ecgf1, and Tnfaip3 (over-expressed in challenged group) and Enpep, Pdgfra, Gzmb, Birc2, Npr1, Angpt1, Cxcl5 and IL7 (under-expressed). It was not possible to perform statistical inference of heart samples in this study. There was no statistically significant difference between challenged and control groups in blood counts of neutrophils, lymphocytes or platelets, despite both groups presented increased number of platelets. The findings indicate that PM2,5 alters transcription of genes involved not only in inflammation and oxidative stress, but also in vascular tonus and remodeling, which may be responsible for the acute cardiovascular effects of PM2,5

O carbaril (metilcarbamato de naftila), um inseticida de amplo espectro, foi recentemente associado ao desenvolvimento de melanoma cutâneo em estudo epidemiológico de coorte com trabalhadores agrícolas norte-americanos, expostos também à radiação solar, o principal fator etiológico para o desenvolvimento de tumores cutâneos. Apesar de abrangente e bem planejado, aquele estudo epidemiológico não é suficiente para caracterizar a contribuição direta do inseticida e da radiação solar na melanomagênese. Diversos estudos têm explorado o efeito sinérgico de determinadas substâncias químicas à radiação UV, potencializando seus efeitos deletérios sobre a pele, e possivelmente contribuindo para o desenvolvimento de tumores. A hipótese deste trabalho é de que a exposição ao carbaril associada à radiação solar possa estimular a transformação de melanócitos. Esse estudo visou caracterizar melanócitos humanos após exposição individual ou combinada ao carbaril (100uM) e à radiação solar (375 mJ/ cm2). Em ensaio de microarray, o carbaril, mas não a radiação solar, induziu uma importante resposta a estresse oxidativo, evidenciada pelo aumento da expressão de genes antioxidantes, como o Hemeoxigenase-1 (HMOX1), e pela diminuição da expressão do gene MiTF, regulador da atividade melanocítica; os resultados foram confirmados por qRT-PCR. Além disso, tanto o carbaril quanto a radiação solar induziram respostas que sugerem dano ao DNA e alteração de ciclo celular. A expressão dos genes nestas categorias, como p21 e BRCA1/2, foi notavelmente mais intensa no grupo de tratamento combinado e de fato, ensaios por citometria de fluxo demonstraram parada de ciclo celular na fase S, redução do número de células em apoptose e indução mais rápida de lesões do tipo CPD neste grupo experimental. Nossos dados sugerem que o carbaril é genotóxico para melanócitos humanos, especialmente quando associado à radiação solar / Carbaryl (1-naphthyl-methylcarbamate), a broad spectrum insecticide, has recently been associated with the development of cutaneous melanoma in an epidemiological cohort study with U.S. farm workers also exposed to ultraviolet radiation, which is known to be the main etiologic factor for skin carcinogenesis. Although comprehensive and well designed, the epidemiological study is not sufficient to characterize the direct contribution of the insecticide and solar radiation in melanomagenesis. Several studies have explored the synergistic effect of certain chemicals with UV radiation, increasing its deleterious effects on the skin, possibly contributing to tumor development. We hypothesized that Carbaryl exposure associated with UV solar radiation may induce melanocyte transformation. This study aims to characterize human melanocytes after individual or combined exposure to Carbaryl (100uM) and solar radiation (375 mJ/ cm2). In a microarray analysis, Carbaryl, but not solar radiation, induced an important oxidative stress response, evidenced by the upregulation of antioxidant genes, such as Hemeoxygenase-1 (HMOX1), and downregulation of MiTF, the main regulator of melanocytic activity; results were confirmed by qRT-PCR. Moreover, both Carbaryl and solar UV induced a gene response that suggests DNA damage and cell cycle alteration. The expression of genes in these categories, such as p21 and BRCA1/2, was notably more intense in the combined treatment group in an additive manner and in fact, flow cytometry assays demonstrated cell cycle arrest in S phase, reduced apoptosis induction and faster induction of CPD lesions in this experimental group. Our data suggests that carbaryl is genotoxic to human melanocytes, especially when associated with solar radiation

Le blé tendre, Triticum aestivum, représente une grande ressource dans l’alimentation humaine mais également dans l’industrie. En conséquence, la taille finale du grain de blé constitue une cible privilégiée des programmes de sélections variétales. Pour ces raisons, comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le développement du grain, en particulier lors des phases précoces de la mise en place des structures cellulaires et leur remplissage par des réserves, constitue un enjeu majeur. Le développement du grain de blé est un processus complexe qui nécessite l’intervention séquentielle ou combinée d’un très grand nombre de gènes et de voies métaboliques. Parmi ces voies, le métabolisme carboné (en particulier celui du saccharose), les voies de signalisation par les hormones et la voie Ubiquitine / Protéasome 26S (UPS) semblent jouer un rôle déterminant dans la taille finale et donc le rendement en grain chez les céréales. Pour étudier le développement du grain de blé tendre, des plantes de la variété Récital ont été cultivées en serre dans des conditions optimales sans contraintes. Les grains ont été récoltés à onze stades de développement après floraison, allant de 40°CJ (soit deux jours après floraison) à 500°CJ (soit 25 jours après floraison). Les ARN totaux ont été extraits à partir de ces grains et utilisés pour analyser l’expression des gènes par une approche transcriptomique, soit en utilisant une lame « dédiée », soit en utilisant une lame Nimblegen comprenant 39 179 gènes. Une analyse différentielle utilisant le test LIMMA a permis d’identifier 9284 gènes différentiellement exprimés. L’analyse globale de ces gènes a montré que des modifications transcriptionnelles majeures ont lieu entre les stades 80 et 120 °CJ ainsi qu’entre 220 et 240°CJ. La répartition de ces 9284 en 10 clusters, en fonction de leurs profils d’expression, permet d’identifier les gènes activés en début de la phase de division cellulaire chez le grain, ceux activés pendant la phase de remplissage et ceux présentant un profil dit en « cloche ». Parmi les gènes différentiellement exprimés, nous nous sommes intéressés à ceux qui codent pour des E3 ligases impliquées dans la voie UPS et aux gènes relatifs à 7 hormones végétales (auxine, acide abscissique, acide jasmonique, brassinostéroïdes, cytokinines, gibbérellines et éthylène). Nous avons alors identifié 173 gènes codant pour des E3 ligases (dont certaines sont également des récepteurs hormonaux) et 126 gènes impliqués dans les voies hormonales. Un modèle global décrivant la chronologie d’intervention de ces gènes a été proposé. La majorité des gènes E3 de type SCF (SKP1-Cullin-Fbox), APC/C, Cul3-BTB et Ubox interviendrait dans les phases précoces du développement du grain de blé. Parallèlement, la majorité des gènes relatifs à l’auxine, à l’acide jasmonique et aux brassinostéroïdes interviendrait lors des phases de divisions cellulaires alors que les gènes relatifs à l’éthylène et à l’acide abscissique interviendraient dans les phases de remplissage. Par ailleurs, une méta-analyse a été réalisée et a permis d’identifier 26 gènes candidats codants pour des E3 ligases ainsi que de 12 gènes candidats impliqués dans les voies hormonales qui seraient préférentiellement exprimés dans l’albumen, un tissu du grain à haute valeur agro-économique. Le modèle proposé et l’identification de ces gènes candidats établissent un cadre pour de futures études visant à comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant le développement du grain de blé. / Wheat grain is an important source of food, feed, and industrial raw materials, but current production levels cannot meet world needs. Elucidation of the molecular mechanisms underlying wheat grain development will contribute valuable information to improving wheat cultivation. One of the most important mechanisms implicated in plant developmental processes is the Ubiquitin-Proteasome System (UPS). Among several implications of the UPS, it has become clear that it plays an essential role in hormone signaling. In particular E3 ubiquitin ligases, from the UPS, have been demonstrated to play critical roles in hormone perception and signal transduction. During these work, wheat cv. Recital were grown in optimum growth conditions. By comparing eleven consecutive time-points from 40°CJ (2 days after anthesis) to 500°CJ (around 25 days after anthesis), 9284 differentially expressed genes were identified during this study. A comparison of these genes in terms of time revealed dynamic transcript accumulation profiles with major re-programming events that occurred during the time intervals of 80-120°Cdays and 220-240°Cdays. The gene expression comparison allows observing genes potentially involved in cell division or grain filling stage. An emphasis was made on the E3 ligases and hormone-related genes (Abscisic acid, Auxin, Brassinosteroid, Cytokinine, Gibberellic acid, Ethylene and Jasmonic acid). 173 E3 ligase coding genes and 126 hormone–related genes were found to be differentially expressed during the cell division and grain filling stages, with a different expression profile for each family. A model describing the timing of the involvement of these genes is proposed to provide a framework for the design of future experiments and for the identification of genes and pathways for further characterization. A majority of the E3 SCF (SKP1-Cullin-F-box), APC/C, Cul3-BTB and Ubox are found expressed in early wheat developmental stages (cell division stage). A majority of auxin, jasmonic acid and brassinostéroïde related genes were found to be up-regulated in early wheat developmental stages while ethylene and abscisic acid related genes were found to be activated during grain filling stage. The differential expression of genes involved in E3 ligase pathways and plant hormone signalling suggested that phytohormones and UPS crosstalk might play a critical role in the wheat grain developmental process. A meta-analysis of these genes led to the identification of 26 E3 ligase candidate genes and 12 hormones-related candidate genes that are preferentially expressed in the endosperm. The functional model that we proposed and the identification of candidate genes should help to better understand wheat grain development.

The development of microarray technology has provided an unprecedented wealth of data on gene expression in various tissue and cell types. Few studies have, however, taken full advantage of these data by selecting and then extensively characterising the functions of particular genes chosen from these microarray datasets. In this study, after analysing differentially-regulated genes revealed by microarray analysis of human mast cells activated via Fc??RI cross-linking, we chose two promising gene candidates for further research, A20 and Gem. Our group??s extensive gene expression database of major leukocytes showed that both A20 and Gem were up-regulated in other leukocyte types, and yet neither of these genes has been extensively explored in mast cells or in the immune system prior to our study. In order to investigate the first of these genes selected for further study, A20, we utilised both A20-deficient mast cells and mast cells in which A20 was over-expressed. Our findings establish for the first time that A20 is an important regulator of mast cell inflammatory responses to both LPS and Fc??RI cross-linking, and that it plays a novel role in mast cell proliferation. Our study of the second gene chosen for investigation, Gem, was conducted in a Gemdeficient mouse model developed by our group. In this study, we investigated the effect of Gem deficiency in two key immune cell types, macrophages and T-cells, complementing the work of a previous group member who investigated Gem deficiency in mast cells. Our results clearly exclude a role for Gem in macrophage and T-cell effector responses, and further establish that Gem is dispensable for in vivo inflammatory responses in models of delayed-type hypersensitivity and allergic airway inflammation. In addition to these findings, and given that the physiological role of Gem was not yet understood prior to our study, we extended our investigation to explore a potential function for Gem in the metabolic system. Using Gem-deficient mice, we found that Gem is necessary for insulin secretion from pancreatic islets. These findings confirm the potential for microarray expression data to reveal excellent gene candidates for further research and functional characterisation.

In der molekularen Diagnostik besteht ein Bedarf an schnellen und spezifischen Testsystemen, die entweder für die Labordiagnostik oder in Point of Care-Umgebungen eingesetzt werden können. Um dieses Ziel zu erreichen, stehen die Miniaturisierung und Parallelisierung im Mittelpunkt des Forschungsinteresses. Die führende Methode im Bereich der DNA-Analytik ist derzeit die Realtime-PCR. Dieser Technologie sind hinsichtlich der Multiplexfähigkeit technologischen Hürden gesetzt, da derzeit nur eine Analyse von maximal vier Parametern parallel in einem Versuchsansatz erfolgen kann. Microarrays stellen hingegen die benötigten Voraussetzungen zur Verfügung, um als Werkzeuge für die Multiparameteranalyse in verschiedensten Anwendungsbereichen zu dienen. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es, Multiplex-PCRs und diagnostische Microarrays zu entwickeln, die für analytische Fragestellungen eine schnelle und zuverlässige Multiparameteranalytik ermöglichen, um die bisherigen Einschränkungen aktueller Nachweisverfahren zu vermeiden. Als Anwendungen wurden zum einen ein Nachweissystem für acht relevante Geflügelpathogene zur Überwachung in der Geflügelzucht, zum anderen ein Nachweissystem zur Identifikation potentiell allergener Lebensmittelinhaltstoffe entwickelt. Neben der Entwicklung geeigneter PCR und Multiplex-PCR-Verfahren sowie spezifischer Microarrays für die Detektion der gesuchten Zielsequenzen stand auch die weiterführende Integration von DNA-Amplifikation und Microarray-Technologie im Fokus dieser Arbeit. Die OnChip-Amplifikation stellt eine Möglichkeit dar, um DNA-Analytik und Detektion in einem Reaktionsschritt zu integrieren. Entsprechend wurden die in der Arbeit entwickelten PCR- und Multiplex-PCR-Verfahren zum Nachweis potentieller allergener Lebensmittelinhaltsstoffe für die OnChip-Amplifikation adaptiert und Reaktionsbedingungen getestet, die eine Multiparameteranalyse auf dem Chip ermöglichen. Die entwickelten OnChip-PCR-Verfahren zeigten eine hohe Spezifität sowohl in Single- als auch in der Multiplex-OnChip-PCR. Eine Sensitivität von 10 Kopien bzw. <10ppm konnte in Single-OnChip-PCRs für den Nachweis allergener Lebensmittelinhaltsstoffe gezeigt werden. In Multiplex-OnChip-PCRs konnten 10-100ppm allergene Verunreinigungen spezifisch in unterschiedlichen Lebensmitteln nachgewiesen werden. Ein weiterer Schritt in Richtung einer möglichen Verwendung im Point of Care-Bereich stellt der Einsatz eines isothermalen Amplifikationsverfahrens dar. Vorteil eines solchen Verfahrens ist die Möglichkeit, auf das ansonsten benötigte Thermocycling zu verzichten. Dies vereinfacht eine Integration der OnChip-Amplifikation in mobile Analysegeräte oder Lab on Chip-Systeme und qualifiziert das Verfahren für den Einsatz in Point of Care-Umgebungen. In dieser Arbeit wurde eine noch junge isothermale Amplifikationsmethode, die helikase-abhängige Amplifikation (HDA), hinsichtlich ihrer Eignung für die Integration auf einem Microarray getestet. Hierfür konnte die bislang erste OnChip-HDA für Einzel- und Duplex-Nachweise von Pathogenen entwickelt werden. / In molecular diagnostics there is a need for fast and specific assay systems that could be used in the clinics and in point of care settings alike. Therefore miniaturisation and parallelisation are in the main focus of current assay development researches. The current gold standard for DNA analytics is the realtime PCR. However, this technology has its restraints in context to multiplex analysis. With the currently available technology an efficient multiplexing is only possible for four different targets per analysed sample. Microarrays in contrast offer the needed multiplex capabilities and have advanced to capable tools used in multiple fields of application. One focus of this work was the integration of Multiplex PCR and microarray technology, developing a microarray capable of analysing multiple parameters in one given sample, circumventing the problems and restraints of the exsisting technologies. As an example microarray assays for two different application fields were developed. One microarray assay for the detection of pathogens in poultry and another microarray assay for the detection of potentially allergenic food ingredients. Single- and Multiplex OnChip-PCR assays for both applications were developed and tested. OnChip-PCRs developed in this work showed high specificity in Single- and Multiplex-OnChip amplifications. The sensitivity was in the range of 10 DNA copies or 10ppm respectively for Single-OnChip-PCR in experiments for the detection of allergenic food contaminations. In Multiplex-OnChip-PCR experiments 100 DNA copies or 100ppm of food contaminents could be detected in different food matrices. A further focus of this work was the adaption of the OnChip amplification for the use in Point of Care settings. Isothermal amplification is a promising approach having the advantage of avoiding the thermocycling needed in the PCR. This opens up certain opportunities for the development of smaller, more flexible mobile diagnostic analysis devices. In this work we have evaluated the helicase dependent amplification (HDA) in terms of usability in OnChip amplification. In this work it was shown for the first time that HDA could be used for the detection of different pathogens in an Duplex-OnChip-PCR, showing the potential of this technology for integration in Point of Care settings.

Per varie ragioni, tra cui le loro specifiche condizioni di crescita, la diagnosi di infezione e di contaminazione alimentare da clostridi presenta ancora numerose difficoltà sia a livello clinico-batteriologico che a livello molecolare. In questo lavoro di tesi si è cercato di ampliare lo spettro di conoscenze riguardo i clostridi e la loro diffusione; durante il primo anno di ricerca è stato studiato, applicando nuove tecniche di microscopia, il processo di germinazione di Clostridium tyrobutyricum, uno dei batteri maggiormente responsabili del gonfiore tardivo dei formaggi a pasta dura; l’applicazione di tecniche di Real-Time PCR ha nel contempo reso possibile una determinazione quantitativa dello stesso in latte. Successivamente, è stata condotta un’analisi di tipizzazione molecolare di clostridi nell’ambito di una filiera agro-zoo-casearia finalizzata alle matrici di processo al fine di individuare le possibili vie di diffusione dei microrganismi. La parte finale del lavoro è stata dedicata allo studio di espressione genica di un altro Clostridium responsabile di gonfiore ma scelto perché geneticamente indistinguibile da Clostridium botulinum, ovvero il Clostridium sporogenes; l’analisi trascrizionale dei suoi geni durante le fasi vegetativa, di sporulazione, germinazione ed esocrescita ha permesso di assegnare diverse funzioni a geni singoli o a gruppi di geni allo scopo di utilizzare queste informazioni per formulare ipotesi future anche su altre specie di clostridi patogeni. / For several reasons, including their specific growth requirements, the diagnosis of infections and food contamination caused by clostridia still presents much difficulty at the clinical, bacteriological and molecular levels. The main purpose of this work is to learn more about clostridia and their interactions with environment. First, new microscopy techniques have been used to study the germination process in Clostridium tyrobutyricum, an anaerobic bacterium responsible for late blowing defects during cheese ripening; meanwhile, the application of real-time PCR methods have been employed to enumerate C. tyrobutyricum cells and spores in milk. Then, a molecular genotyping has been set in order to identify the most common clostridia in a agro-dairy production aimed to detect the possible ways of diffusion of these microbial species. The last part concerns the study of expression patterns of Clostridium sporogenes, an apathogenic gram positive clostridium usually involved in food damage and frequently isolated from late bowled cheese; Clostridium sporogenes is genetically indistinguishable from Clostridium botulinum and is often used as a model for the toxic subtypes. The objective of this study is to use an array-based large-scale transcriptional analysis in order to study gene expression in four different steps of Clostridium sporogenes life cycle: vegetative cells, sporulating cells, dormant spores and germinating ones. Our aims includes being able to relate gene-expression patterns to specific phenotypes and to discover gene expression divergences between the different phases of living, germination and outgrowth of spore-forming bacteria. An important aim is to assign functions to groups of or individual C. sporogenes genes and use this information to formulate specific hypotheses for further testing also on pathogenic clostridia types.

Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger boviner Mastitiden. Die Vielgestaltigkeit der Resistenzmuster und Virulenzfaktoren seiner Stämme macht ihn zu einem Problemkeim aus therapeutischer und prophylaktischer Sicht. Seine Fähigkeit zur Bildung hitzestabiler Enterotoxine verleiht ihm lebensmittelhygienische Relevanz. Mehrfachresistente Stämme stellen gefährliche Zoonose-Erreger dar. Ziel der durchgeführten Untersuchung war es daher, Aufschluss über Resistenzdeterminanten und Virulenzfaktoren der in Thüringer Milchviehherden vorkommenden Staphylococcus aureus zu erhalten, wobei eine Microarray-gestützte Genotypisierung zum Einsatz kam. Weiterhin sollte analysiert werden, ob der Genotyp der Isolate mit dem Phänotyp korreliert. In 34 Thüringer Milchviehherden wurde der gesamte Bestand der laktierenden Kühe zweimal auf Basis von Viertelgemelksproben bakteriologisch untersucht. Die Beurteilung der Kulturen erfolgte im Nativausstrich nach 48-stündiger Bebrütung und zusätzlich nach Voranreicherung in einer Glucose-Bouillon mit anschließender 24-stündiger Bebrütung. Staphylococcus aureus-positiv waren 1902 von insgesamt 81 567 Milchproben. Aus diesen wurden 189 für die Herden repräsentative Isolate ausgewählt und mittels Microarray-Technologie umfassend charakterisiert und klassifiziert. Zudem wurde der Phänotyp der Isolate auf Äskulin- und Columbia-Blutagar erfasst und das Resistenzverhalten mittels Agardiffusionstest ermittelt. Die 189 typisierten Staphylococcus aureus konnten elf verschiedenen klonalen Komplexen (CC) zugeordnet werden. Der Großteil der Isolate (80,4 %) zählte zu CC133, CC151 und CC479. Diese Isolate besaßen mit einer Ausnahme das Leukozidin-Gen lukF-P83/lukM. Die übrigen Isolate, die negativ auf lukF-P83/lukM getestet wurden, gehörten acht vergleichsweise sporadisch vorkommenden CC (CC7, CC9, CC20, CC45, CC50, CC97, CC101, CC398) an. In nur 0,7 % der zu den drei dominanten CC zählenden Isolate war das Beta-Laktamase-Gen blaZ vorhanden, während es bei 54,1 % der sporadisch vorkommenden CC detektiert wurde. Das Methicillin-Resistenzgen mecA wurde bei lediglich vier Isolaten (2,1 %) nachgewiesen, die alle CC398 angehörten. Sie verfügten neben Resistenzen gegenüber β-Laktam-Antibiotika über eine Tetrazyklin-Resistenz. Darüber hinaus wurde in einem Isolat das Makrolid/Lincosamid/Streptogramin-Resistenz vermittelnde vgaA und in einem Isolat das Aminoglykosid-Resistenz vermittelnde aacA-aphD detektiert. Humanmedizinisch relevante Enterotoxin-, Exfoliatin- oder PVL-Gene wurden in den vier Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) nicht gefunden. Im Agardiffusiontest zeigten diese Isolate eine Penicillin- und eine Tetrazyklin-Resistenz, jedoch keine Resistenz gegenüber Oxacillin, welches als MRSA-Marker gilt. Die Gene der klassischen, humanmedizinisch bedeutsamen Enterotoxine A, B und C waren bei 12,7 % der Isolate vorhanden, wohingegen die Gene von Enterotoxin D und E nicht vorkamen. Insgesamt fanden sich Enterotoxin-Gene bei 78,3 % der typisierten Staphylococcus aureus, wobei die für Enterotoxin G, I, M, N, O und U kodierenden dominierten. Phänotypisch unterschieden sich die CC bezüglich Hämolyse und Pigmentierung, wobei alle CC398-Isolate als eierschalenfarben mit doppelzoniger Hämolyse auftraten. Hämolysin-Gene besaßen alle Isolate, ein Zusammenhang zu den phänotypisch ausgeprägten Hämolysezonen bestand jedoch nicht. Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass in Thüringer Milchviehbeständen zwei epidemiologisch unterschiedliche Varianten von Staphylococcus aureus existieren. Die in dieser Studie dominierenden, lukF-P83/lukM-positiven CC133, CC151 und CC479 verursachten einen Großteil der Infektionen und gelten als auf das Euter beschränkte Erreger. Sie können daher als „euterassoziiert“ angesehen werden. Dagegen verfügten die anderen in dieser Untersuchung detektierten, lukF-P83/lukM-negativen CC über Charakteristika „umweltassoziierter“ Keime. Sie besitzen ein breites Wirtsspektrum und treten auch außerhalb des bovinen Euters in der Umgebung der Kühe auf. Die Prüfung auf lukF-P83/lukM erwies sich als zuverlässige Methode, zwischen beiden epidemiologischen Varianten zu unterscheiden. Folglich lässt die An- oder Abwesenheit dieser Genkombination einen Rückschluss auf die in der Herde verbreiteten CC zu. Das ermöglicht die Berücksichtigung der CC-spezifischen Erreger-Eigenschaften bei der Etablierung von Sanierungsprogrammen, die somit effizient gestaltet werden können. MRSA waren in Thüringer Milchviehbeständen wenig verbreitet und nur schwach mit Resistenzdeterminanten und humanmedizinisch bedeutsamen Pathogenitätsfaktoren ausgestattet. Diese MRSA aus Rohmilchproben sind daher nicht mit multiresistenten Isolaten aus der Humanmedizin zu vergleichen. Gene für humanmedizinisch relevante Enterotoxine, für die ein Zusammenhang mit Lebensmittelintoxikationen belegt ist, wurden selten, andere Enterotoxin-Gene jedoch häufig nachgewiesen.

Das Bakterium Bradyrhizobium japonicum ist wie andere Rhizobien in der Lage mit Pflanzen der Familie Fabales (Leguminosen) eine Symbiose einzugehen. Im symbiontischen Zustand fixieren die Mikrosymbionten atmosphärischen, molekularen Stickstoff und stellen diesen den Pflanzen in verwertbarer Form zur Verfügung. Im Gegenzug erhalten die Bakterien von den Pflanzen verschiedene Verbindungen als Kohlenstoff- und Energiequelle. Dem geht ein komplexer Signalaustausch voraus um die gegenseitige Erkennung der Partner und die Spezies-spezifische Symbiose zu ermöglichen. Auf Seite der Bakterien erfolgt die Reaktion auf die Gegenwart pflanzlicher Signalmoleküle. In B. japonicum induziert das Flavonoid Genistein die Transkription einer Reihe von Genen. Durch die Expression der nod-Gene erfolgt eine Synthese von Lipochitooligosacchariden. Diese sogenannten Nodulationsfaktoren rufen wiederum eine Reaktion in der Wirtspflanze hervor. Um die zugrunde liegende Genexpression und deren Regulationsmechanismen zu erforschen, standen bis dato nur Methoden für die Untersuchung einzelner Gene zur Verfügung. Die erstmals 1995 publizierte Microarraytechnologie eröffnete die Möglichkeit zu einem Zeitpunkt die Gentranskription eines gesamten Organismus zu untersuchen (Schena et al. 1995). Um mit dieser Technologie die Gentranskription bei B. japonicum zu untersuchen, wurde ein auf PCR-Produkten basierender Microarray hergestellt. Grundlage für die Synthese genspezifischer PCR-Produkte war die symbiontische Region von B. japonicum und andere zu diesem Zeitpunkt bekannte Gensequenzen (Göttfert et al. 2001). Nach der 2002 erfolgten Veröffentlichung des Genoms von B. japonicum erfolgte ein Abgleich der bisher verwendeten Sequenzen mit der vollständigen Sequenzinformation (Kaneko et al. 2002a). Nach Synthese der PCR-Produkte und deren Kontrolle durch Sequenzierung erfolgte die Herstellung des Microarrays unter Einsatz eines Microarrayspotters. Geeignete Techniken der cDNA-Markierung und die Microarray-Hybridisierung wurden mit Total-RNA von B. japonicum-Kulturen ausgetestet und etabliert. Eine differentielle Expremierung war eine Stunde nach Genistein- bzw. Methanolgabe zum Kulturmedium nicht nachweisbar. Zum darauffolgenden Zeitpunkt konnte die bekannte Induktion der nod-Gene durch dass Flavonoid Genistein beobachtet werden. Diese Induktion fiel in den verbleibenden zwei Zeitpunkten stark ab. Dieser Abfall der Induktionsrate ließ sich nicht mit dem Genisteingehalt im Kulturmedium erklären, da dieser Zeitraum konstant blieb. Vier Stunden nach Genisteingabe war die Induktion der Gene nolA und nodD2, deren Produkte sind an der negativen Regulation der nod-Gene beteiligt, nachweisbar. Dies wäre eine mögliche Erklärung für den Abfall der Induktion der nod-Gene. Im gleichen untersuchten Zeitraum wurde die Transkription verschiedener Gene der Stickstofffixierung und Denitrifikation durch das Flavonoid Genistein induziert. Auch für die bekannten Regulatoren dieser Gene war eine Induktion nachweisbar. Nach bisherigen Arbeiten war die Expression dieser Gene auf mikroaerobe und anaerobe Zustände, wie z.B. dem symbiontischen Stadium, beschränkt. Eine Induktion durch Flavonoide ist bisher nicht beobachtet worden. Um die Verwendbarkeit des Microarrays auch für den symbiontischen Zustand von B. japonicum zu testen, wurden Versuche mit Wurzelknöllchen von Sojabohne (Glycine max) durchgeführt. Dafür wurden Keimlinge der Sojabohne (G. max) mit B. japonicum inokuliert und die Total-RNA der entstehenden Wurzelknöllchen isoliert. Jedoch war eine Kreuzhybridisierung mit pflanzlicher Total-RNA zu beobachten. Der auf PCR-Produkten basierende Microarray ist für die Untersuchung des symbiontischen Stadiums von B. japonicum nicht einsetzbar. Im Vergleich dazu wurde ein auf Oligomeren basierender, kommerzieller Microarray für diesen Versuch getestet. Die Kreuzhybridisierung mit pflanzlicher Total-RNA war auf die Oligomere für die 16S rDNA und 23S rDNA reduziert.

Reductionist biology has yielded tremendous insight into the basis of biochemistry and genetic disease. However, the remarkable failure of reductionist biology to explain complex problems, especially cancer, has led to the development of systems biology. The vast complexity of biological systems remains the most difficult problem in biology today. In order to understand this complexity, we need tools to massively multiplex measurements of a signaling network. Therefore, we developed lysate microarray technology to fill this need. In this work, we discuss three ways in which lysate microarrays were applied to human disease. In the first work, we discuss a key stage in malaria development. The liver-stage malaria parasite represents a promising target for intervention, and we present the first use of lysate microarray technology as a screening tool for host-parasite interactions in an infectious disease. We identified three cancer-related pathways that are modified in malaria infection, and studied the p53 pathway in depth. Our finding that the parasite downregulates p53 and that treatment with Nutlin-3 strongly decreases parasite load may lead to the development of a prophylactic malaria vaccine. In the second work, we began by screening drug combinations and varying dosing schedule in triple-negative breast cancers (TNBCs). We systematically explored stimulation space and collected a large lysate microarray dataset, which was used for statistical analysis. We identified a sensitization effect when a growth factor signaling inhibitor was presented before a genotoxic agent. This sensitization was generalizable among a subset of TNBCs and may generally be important for cancers driven by growth factor signaling, as we found the effect extends to nonTNBC cancers. We hope this data will be useful in guiding cancer treatment strategies in patients. In the third work, we study the changing role of the DNA Damage Response (DDR) as a cell line evolves towards cancer. We used the MCF10A progression series and studied how these cell lines respond to genotoxic agents. We identified differences in cell fates after treatment, and collected a large lysate microarray dataset for statistical analysis. Early analysis of the data indicates gross rewiring within the DDR between the MCF10A cell lines.

The development of microarray technology has provided an unprecedented wealth of data on gene expression in various tissue and cell types. Few studies have, however, taken full advantage of these data by selecting and then extensively characterising the functions of particular genes chosen from these microarray datasets. In this study, after analysing differentially-regulated genes revealed by microarray analysis of human mast cells activated via Fc??RI cross-linking, we chose two promising gene candidates for further research, A20 and Gem. Our group??s extensive gene expression database of major leukocytes showed that both A20 and Gem were up-regulated in other leukocyte types, and yet neither of these genes has been extensively explored in mast cells or in the immune system prior to our study. In order to investigate the first of these genes selected for further study, A20, we utilised both A20-deficient mast cells and mast cells in which A20 was over-expressed. Our findings establish for the first time that A20 is an important regulator of mast cell inflammatory responses to both LPS and Fc??RI cross-linking, and that it plays a novel role in mast cell proliferation. Our study of the second gene chosen for investigation, Gem, was conducted in a Gemdeficient mouse model developed by our group. In this study, we investigated the effect of Gem deficiency in two key immune cell types, macrophages and T-cells, complementing the work of a previous group member who investigated Gem deficiency in mast cells. Our results clearly exclude a role for Gem in macrophage and T-cell effector responses, and further establish that Gem is dispensable for in vivo inflammatory responses in models of delayed-type hypersensitivity and allergic airway inflammation. In addition to these findings, and given that the physiological role of Gem was not yet understood prior to our study, we extended our investigation to explore a potential function for Gem in the metabolic system. Using Gem-deficient mice, we found that Gem is necessary for insulin secretion from pancreatic islets. These findings confirm the potential for microarray expression data to reveal excellent gene candidates for further research and functional characterisation.