No description available.

Bei der routinemäßigen Anwendung der Mikrosporenkultur zur Herstellung doppelt-haploider Linien kommt es bis heute zu Engpässen in der praktischen Rapszüchtung. Die Hauptprobleme stellen eine unzureichende Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate und eine niedrige direkte Regeneration von Pflanzen aus Mikrosporen-Embryonen dar. Ein hoher Prozentsatz an Rapsembryonen aus Mikrosporenkultur durchläuft den Prozess der sekundären Embryogenese, der eine zeitintensive Subkultivierung erfordert. Hierbei werden die direkten Sprossansätze wiederholt von undifferenziertem Gewebe freigeschnitten bis eine Überführung in Erde und die letztendliche Regeneration zu doppelt-haploiden Pflanzen möglich ist. Die vorliegende Doktorarbeit besteht aus zwei Studien, die sich mit dem Thema: „Methodische Verbesserungen der Mikrosporenkultur in Brassica napus L.“ auseinandersetzen. Ziel der ersten Studie war die Erhöhung der Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate von Mikrosporen ohne die Regeneration von Pflanzen aus den Mikrosporen-Embryonen zu verringern und damit die Entwicklung zu doppelt-haploiden Pflanzen zu verzögern. Aufgrund der hohen Toxizität von Colchizin wurden die weniger toxischen Mitosehemmstoffe Amiprophos-methyl (APM) und Pronamid, die eine höhere Affinität zu Pflanzentubulin als Colchizin besitzen, allein und in Kombination mit Colchizin untersucht. Eine Kombination dieser Mitosehemmstoffe führte zu keiner effizienten Diploidisierungsrate; demnach konnte ein synergistischer Effekt ausgeschlossen werden. Die acht untersuchten Winterrapsgenotypen erzielten eine Diploidisierungsrate von 40% bis 64%. Die Mitosehemmstoff-Behandlungen der isolierten Mikrosporen variierten hierbei zwischen 33% (3 µM APM, 72 Stunden) und 70% (25 µM Colchizin, 72 Stunden). Ein signifikanter Einfluss der Mitosehemmstoffe auf die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen konnte nicht nachgewiesen werden. In Abhängigkeit der Genotypen konvertierten 14% bis 23% direkt. Unterschiedliche getestete Colchizinkonzentrationen (250, 150, 125, 25 µM) zeigten für 4 untersuchte Genotypen eine Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate von 58% bis 66%, wobei die Behandlung 250 µM Colchizin für 48h die höchste Rate aufwies. Ein signifikanter Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO), das oftmals als Lösungsmittel der angewendeten Mitosehemmstoffe verwendet wird, konnte jedoch nicht in den untersuchten Konzentrationen (0,3% und 3%) in Kombination mit der Colchizin-Behandlung (250 µM, 72 Stunden) auf die Diploidisierungsrate und die direkte Konversionsrate nachgewiesen werden. Weiterhin wurden 17 Winterrapsgenotypen bezüglich ihrer spontanen und ihrer Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate untersucht und deren Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen bestimmt. Die ausgewählten Genotypen enthielten sowohl Sorten als auch F1–Hybriden. Die spontan-induzierte Diploidisierungsrate zeigte eine große Variation von 15% bis 69%. Im Vergleich dazu erreichte die Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate Werte von 40% bis 83%. Die Mikrosporen-Embryonen der getesteten Genotypen wiesen ebenfalls eine große Spannbreite bezüglich ihrer direkten Konversionsrate auf. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Einfluss der Mitosehemmstoff-Behandlung auf den Regenerationserfolg der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen. Sowohl die beobachtete spontane und die Mitosehemmstoff-induzierte Diploidisierung als auch die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen waren stark Genotyp-abhängig. Ziel der zweiten Studie war die Erhöhung der direkten Regeneration der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen trotz der starken Abhängigkeit der Genotypen. Zunächst wurde der Einfluss von zehn unterschiedlichen Sprossregenerationsmedien mit und ohne Phytohormone (Gibberellinsäure, 6-Benzylaminopurin, 3-Indolylbuttersäure) und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen von 5 Winterrapsgenotypen untersucht. Die 14-tägige Kältebehandlung erfolgte sowohl unter acht Stunden Licht als auch in Dunkelheit. Die Standardkultivierung der Mikrosporen-Embryonen erfolgte im Kulturraum bei 26 °C und 12 Stunden Licht. 13% bis 39% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt, wobei die höchste Rate von 43% nach Kultivierung der Embryonen auf Gamborg B5-Medium mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure resultierte. Die Mittelwerte der Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen aller untersuchten Genotypen und Kulturmedien wurden durch die 14-tägige Kältebehandlung (28%) gegenüber der Standardkultivierung (14%) signifikant erhöht. Nachfolgend wurde der Einfluss der vier effizientesten Sprossregenerationsmedien und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 1.5 °C und bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die Konversionsrate von Mikrosporen-Embryonen von 13 Winterrapsgenotypen untersucht. Die Kältebehandlung bei 1.5 °C erfolgte unter Lichtabwesenheit als auch unter acht Stunden Licht. Die Kältebehandlung bei 4 °C erfolgte dagegen in Dauerlicht und Dauerdunkel. Zwischen 29% und 76% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt. Im Vergleich zur Kultivierung unter Standardbedingungen konnte mit der Kältebehandlung eine signifikante Erhöhung erzielt werden (von 21% auf bis zu 71%). Nach vorheriger Kultivierung der Mikrosporen-Embryonen auf den unterschiedlichen Kulturmedien variierte die Konversionsrate zwischen 50% (MS) und 60% (B5 mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure). Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass trotz einer vorherrschenden starken Abhängigkeit vom Genotyp, die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen mit Kältebehandlung (1.5 °C im Dauerdunkel) signifikant erhöht werden konnte. Fast alle Genotypen zeigten Konversionsraten der Mikrosporen-Embryonen von über 70%. Es ist demnach möglich die sekundäre Embryogenese und die damit verbundene zeitintensive in vitro-Subkultivierung erheblich zu reduzieren, und dadurch den Entwicklungsprozess von doppelt-haploiden Linien zur Verwendung in der praktischen Rapszüchtung zu beschleunigen.

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2016-09-27T14:35:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Francieli_Cima.pdf: 1564850 bytes, checksum: 1875a0cdb8f46c6a1880c860e06bdbe3 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-09-28T17:12:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação_Francieli_Cima.pdf: 1564850 bytes, checksum: 1875a0cdb8f46c6a1880c860e06bdbe3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T17:12:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Francieli_Cima.pdf: 1564850 bytes, checksum: 1875a0cdb8f46c6a1880c860e06bdbe3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / No Brasil, a cultura do trigo ocupa lugar de destaque nos sistemas de produção da Região Sul, representando uma opção muito importante como um cereal de inverno. O melhoramento genético das culturas autógamas tem contado com vários métodos para produzir cultivares mais recentes e superiores com características melhoradas. Um exemplo muito bem sucedido tem sido o método de produção de plantas duplohaploides usado para acelerar o desenvolvimento de uma nova cultivar. Em trigo, a cultura de micrósporos isolados tem sido usada para a obtenção de plantas duplohaploides. No entanto, esta técnica tem sido caracterizada como altamente genótipo-dependente e de produzir altas taxas de plantas albinas. Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar um protocolo através da cultura in vitro de micrósporos isolados utilizando-se genótipo de trigo com alta produção de plantas albinas. Para este estudo, plantas F1 oriundas do cruzamento de trigo entre Toropi x BRS 194 foram usadas como doadoras de micrósporos. Foram realizados três experimentos. No primeiro experimento, anteras foram removidas das espiguetas e tratadas em três soluções de pré-tratamentos à 4°C: a) manitol (62 g L-1) + 15 µM de sulfato de cobre (CuSO4.5H20); b) manitol (62 g L-1) e c) 15 µM de sulfato de cobre. No segundo experimento, foram testadas as mesmas soluções de pré-tratamento do experimento anterior, com a diferença de que neste experimento, espiguetas inteiras foram usadas para o pré-tratamento. No terceiro experimento, somente o pré- tratamento a frio foi aplicado nas espigas e houve uma modificação no meio de indução, quando foram testados nove tratamentos: controle (meio de indução padrão); sulfato de cobre (2,0 µM); prolina (10 mM); glutationa (2,0 µM); cefotaxima (100 mg L-1); sulfato de cobre (4,0 µM); sulfato de cobre (2,0 µM) + prolina (10 mM); sulfato de cobre (2,0 µM) + glutationa (2,0 µM); sulfato de cobre (2,0 µM) + cefotaxima (100 mg L-1). Os resultados obtidos nos experimentos 1 e 2 mostrou que a solução de pré-tratamento contendo 15 µM de sulfato de cobre foi mais eficiente para desencadear a embriogênese dos micrósporos e regenerar plantas verdes em trigo. No terceiro experimento, o meio de indução suplementado com 100 mg L-1 de cefotaxima mostrou um aumento na formação de embriões e também na regeneração de plantas verdes. / In Brazil, the wheat crop occupies an outstanding place in the production systems of the Southern Region, representing a very important option as a winter cereal. Genetic improvement of self-fertilizing crops has relied on several methods to produce newer and superior cultivars with enhanced traits. A very successful example has been the use as double haploids as a method to accelerate the development of a new cultivar. In wheat, isolated microspore culture has been used to obtain doubled haploid plants. However, this technique has been characterized as highly genotype dependent and producing high rates of albino plants. Thus, the objective of this work was to optimize a protocol through the in vitro culture of isolated microspores utilizing a wheat genotype with high production of albino plants. For this study, F1 plants originated from the wheat cross between Toropi x BRS 194 were used as microspore donor plants. Three experiments were carried out. In the first experiment, anthers were treated in three pre-treatment solutions, at 4°C: a) mannitol (62 g L-1) + 15 µM copper sulphate (CuSO4.5H20); b) mannitol (62 g L-1) and c) 15 µM copper sulphate. In the second experiment, the same pre-treatment solutions of the previous experiment were tested, with the difference that in this experiment, whole spikelets were used for the pre-treatment. In the third experiment, only cold pre-treatment was applied to the spikes, and there was a modification in the induction medium, when nine treatments were tested: control (standard induction medium); copper sulphate (2,0 µM); proline (10 mM); glutathione (2,0 µM); cefotaxime (100 mg L-1); copper sulphate (4,0 µM); copper sulphate (2,0 µM) + proline (10 mM); copper sulphate (2,0 µM) + glutathione (2,0 µM); copper sulphate (2,0 µM) + cefotaxime (100 mg L-1). Results obtained in experiments 1 and 2 showed that the pre-treatment solution containing 15 µM of copper sulphate was more efficient to trigger the embryogenesis of microspores and regenerate green plants in wheat. In the third experiment, the induction medium, supplemented with 100 mg L-1 of cefotaxime showed an increase in the formation of embryos and also in the regeneration of green plants.

No description available.

Genotypes of rapeseeds producing yellow seeds were not found in nature. Breeders yellow-seeded rapeseeds have been developed applying different combinations of interspecific crosses. In the Laboratory of Genetics-Biotechnology at the Lithuanian Agricultural University, yellow-seeded spring rapeseeds were developed for the first time without interspecific crosses (Burbulis, 2001). All cultivars of yellow-seeded rapeseed have one essential drawback – unblocking of pigmentation takes place in other generations and seeds of different colours (yellowish brown, brown or black) are formed. Breeders, working with the cultivars of yellow-seeded rapeseed, admit that environmental temperature is one of the factors limiting the manifestation of the trait.

Tesis por compendio / Androgenesis induction is an experimental procedure by which microspores are diverted from their original gametophytic pathway towards embryogenesis by applying specific stresses in vitro. It allows for the production of doubled haploid (DH) pure lines through anther culture or isolated microspore culture followed by chromosome doubling. DH technology is interesting for both basic research and plant breeding. In this Thesis, we studied microspore embryogenesis with two parallel approaches: (I) an applied study directed to the development of the first eggplant (Solanum melongena) highly embryogenic line and the improvement of the efficiency of eggplant microspore cultures; and (II) a fundamental research study focused on the relationship between microspore embryogenesis ability, intracellular Ca2+ levels and the dynamics of callose and cellulose deposition for cell wall formation in microspore-derived structures, using rapeseed (Brassica napus) as a model species. As an applied research, we developed and evaluated an eggplant DH population from a commercial hybrid, and identified and characterized the first eggplant highly androgenic DH line (DH36), which may be used to facilitate the study of eggplant androgenesis and for both basic and applied research. In addition, we evaluated different factors involved in microspore embryogenesis induction efficiency in eggplant and optimized the regeneration protocol for DH production via microspore culture. Together, the applied research on eggplant microspore embryogenesis made in this Thesis resulted in the most efficient protocol existing to date for DH production in eggplant. As a fundamental research, we studied the dynamics of Ca2+ during in vivo microsporogenesis and microgametogenesis, as well as during the first stages of in vitro-induced microspore embryogenesis, establishing a link between microspore embryogenesis and changes in Ca2+ levels and subcellular distribution. In addition, we studied the deposition of callose and cellulose during the first stages of microspore embryogenesis and demonstrated that the abnormally increased callose deposition and the inhibition of cellulose deposition observed in embryogenic microspores is most likely caused by a transient increase in the intracellular Ca2+ levels that occurs right after microspore induction. We also found that this particular dynamics of callose and cellulose deposition is related to microspore embryogenesis ability, and is essential for proper progression and success of microspore embryogenesis. In summary, the research made in this Thesis helps to further understand the basis underlying microspore embryogenesis and cell totipotency, and to apply the powerful DH technology to an economically important crop such as eggplant. / La inducción de androgénesis es un procedimiento experimental en el cual las microsporas se desvían de su vía gametofítica original hacia embriogénesis, mediante la aplicación de estreses específicos in vitro. Este fenómeno permite la producción de líneas puras dobles haploides (DH) mediante cultivo de anteras o cultivo de microsporas aisladas seguidos de duplicación cromosómica. La tecnología DH es interesante tanto para la investigación básica como para su aplicación a la mejora genética vegetal. En esta Tesis se estudia la embriogénesis de microsporas y la obtención de DHs con dos enfoques paralelos: (I) un estudio aplicado dirigido al desarrollo de la primera línea de berenjena (Solanum melongena) con alta respuesta androgénica y a la mejora de la eficiencia de los cultivos de microsporas de berenjena; y (II) un estudio de investigación básica centrado en la relación entre la habilidad para la embriogénesis de microsporas, los niveles intracelulares de Ca2+ y la dinámica de la deposición de calosa y celulosa para la formación de paredes celulares en estructuras derivadas de microsporas, utilizando como especie modelo la colza (Brassica napus). Como investigación aplicada, se desarrolló y evaluó una población DH de berenjena a partir de un híbrido comercial, y se identificó y caracterizó la primera línea DH altamente androgénica de berenjena (DH36), que puede usarse para facilitar el estudio de la androgénesis en berenjena y para otros estudios aplicados o básicos. Además, se evaluaron diferentes factores implicados en la eficiencia de la inducción de embriogénesis de microsporas en berenjena, y se optimizó el protocolo de regeneración para la producción de DH mediante cultivo de microsporas. En conjunto, la investigación aplicada sobre la embriogénesis de microsporas realizada en esta Tesis proporciona el protocolo más eficiente existente hasta la fecha para la producción de DH en berenjena. Como investigación fundamental, se estudió la dinámica del Ca2+ durante la microsporogénesis y la microgametogénesis in vivo, así como durante las primeras etapas de la embriogénesis de microsporas inducida in vitro, y se estableció un vínculo entre la embriogénesis de microsporas y los cambios en el nivel y distribución intracelular de Ca2+. Además, se estudió la deposición de calosa y celulosa durante las primeras etapas de la embriogénesis de microsporas y se demostró que la excesiva deposición de calosa y la inhibición de la deposición de celulosa, exclusivas de las microsporas embriogénicas, están causadas por el aumento transitorio de Ca2+ intracelular que se produce justo tras la inducción. Hemos demostrado que esta particular dinámica de la deposición de calosa y celulosa está relacionada con la capacidad androgénica, y que es fundamental para la correcta progresión y éxito de la embriogénesis de microsporas. En resumen, la investigación realizada en esta Tesis ayuda a comprender mejor la base de la embriogénesis de microsporas y de la totipotencia celular, y a aplicar la potente tecnología DH a un cultivo económicamente importante como es la berenjena. / La inducció d'androgènesi és un procediment experimental en el qual les microspores es desvien de la seua via gametofítica original cap a un nou destí embriogènic, mitjançant l'aplicació d'estressos específics in vitro. Aquest fenomen permet la producció de línies pures dobles haploides (DH) mitjançant cultiu d'anteres o cultiu de microsporas aïllades seguits de duplicació cromosòmica. La tecnologia DH és interessant tant per a la recerca bàsica com per a la seua aplicació a la millora genètica vegetal. En aquesta Tesi s'estudia l'embriogènesi de microspores i l'obtenció de DHs amb dos enfocaments paral·lels: (I) un estudi aplicat dirigit al desenvolupament de la primera línia d'albergina (Solanum melongena) amb alta resposta androgènica i a la millora de l'eficiència dels cultius de microspores d'albergina; i (II) un estudi de recerca bàsica centrat en la relació entre la capacitat per a l'embriogènesi de microspores, els nivells intracel·lulars de Ca2+ i la dinàmica de la deposició de cal·losa i cel·lulosa per a la formació de parets cel·lulars en estructures derivades de microsporas, utilitzant com a espècie model la colza (Brassica napus). Com a recerca aplicada, es va desenvolupar i avaluar una població DH d'albergina a partir d'un híbrid comercial, i es va identificar i caracteritzar la primera línia DH altament androgènica d'albergina (DH36), que pot usar-se per a facilitar l'estudi de l'androgènesi en albergina i per a altres estudis aplicats o bàsics. A més, es van avaluar diferents factors implicats en l'eficiència de la inducció d'embriogènesi de microspores en albergina, i es va optimitzar el protocol de regeneració per a la producció de DH mitjançant cultiu de microspores. En conjunt, la recerca aplicada sobre l'embriogènesi de microspores realitzada en aquesta Tesi proporciona el protocol més eficient existent fins avui per a la producció de DH en albergina. Com a recerca fonamental, es va estudiar la dinàmica del Ca2+ durant la microsporogènesi i la microgametogènesi in vivo, així com durant les primeres etapes de l'embriogènesi de microspores induïda in vitro, i es va establir un vincle entre l'embriogènesi de microspores i els canvis en el nivell i distribució intracel·lular de Ca2+. A més, es va estudiar la deposició de cal·losa i cel·lulosa durant les primeres etapes de l'embriogènesi de microspores i es va demostrar que l'excessiva deposició de cal·losa i la inhibició de la deposició de cel·lulosa, exclusives de les microspores embriogèniques, estan causades per l'increment transitori del Ca2+ intracel·lular que es produeix just després de la inducció. Hem demostrat que aquesta particular dinàmica de la deposició de cal·losa i cel·lulosa està relacionada amb la capacitat androgènica, i que és fonamental per a la correcta progressió i èxit de l'embriogènesi de microspores. En resum, la recerca realitzada en aquesta Tesi ajuda a comprendre millor la base de l'embriogènesi de microspores i de la totipotència cel·lular, i a aplicar la potent tecnologia DH a un cultiu econòmicament important com és l'albergina. / Rivas Sendra, A. (2017). Calcium and cell wall dynamics during microspore embryogenesis and double haploid production in rapeseed and eggplant [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/85548 / Compendio

[ES] Los dobles haploides son una gran herramienta para la mejora genética de híbridos debido a que se puede alcanzar la homocigosis completa en una sola generación. Entre las técnicas usadas para obtener estas plantas, la inducción de la embriogénesis de microsporas, mediante el cultivo de anteras o de microsporas, es la más eficiente y la más usada. La embriogénesis de microsporas es también un ejemplo de totipotencia de las células vegetales gracias a su habilidad de reprogramar su desarrollo gametofítico hacia una ruta esporofítica, donde las células proliferan de forma organizada para crear un nuevo organismo. Como en muchos otros procesos in vitro, las condiciones de cultivo deben ser optimizadas para incrementar la eficiencia. En la presente Tesis Doctoral, hemos usado dos especies como sistemas experimentales para estudiar y optimizar el cultivo de microsporas. Por un lado, usamos berenjena (Solanum melongena) como un ejemplo de cultivo de importancia económica en el que los protocolos todavía tienen mucho margen de mejora. La optimización de la densidad celular y los reguladores de crecimiento han demostrado ser útiles para modificar la eficiencia del cultivo de microsporas de berenjena. Por otra parte, hemos utilizado el cultivo de microsporas de Brassica napus para estudios básicos puesto que ha sido ampliamente usado como modelo para entender procesos celulares que ocurren durante este cambio en el desarrollo. Se detalla un protocolo estandarizado para el cultivo de microsporas de B. napus, el cual ha sido utilizado en todos los cultivos en esta Tesis para explorar una serie de procesos y estructuras celulares potencialmente implicados en el cambio de desarrollo hacia embriogénesis. Estos procesos incluyen estrés del retículo endoplásmico, muerte celular programada, autofagia y estructura y composición de la pared celular. Estudiamos en paralelo el cultivo de microsporas de dos genotipos de B. napus con diferente respuesta androgénica en condiciones estándar y añadiendo Tricostatina A, un modulador epigenético que ha mostrado ser beneficioso para la respuesta androgénica en algunos casos. En conjunto, esta Tesis representa un avance en la optimización del cultivo de microsporas en estas especies y arroja luz sobre el papel de algunos procesos en el contexto de embriogénesis de microsporas. / [CA] Els dobles haploides són una gran eina en millora vegetal per a la producció d'híbrids, a causa de la seua total homozigosi, que es pot aconseguir en només una generació in vitro. Entre les diverses tècniques que s'utilitzen per tal d'obtenir aquestes plantes, la inducció de l'embriogènesi de microspores, mitjançant cultiu d'anteres o microspores, és la més comuna i eficient. L'embriogènesi de microspores també és un exemple de la totipotència de les cèl·lules vegetals, capaços de reprogramar-se d'una via gametofítica a una via esporofítica, on proliferen de manera organitzada per crear un nou organisme. Com en moltes altres tecniques in vitro, s'han d'optimitzar les condicions del cultiu per tal d'augmentar l'eficiència. En la present Tesi Doctoral, hem utilitzat dues espècies de plantes com a sistemes experimentals per estudiar i optimitzar el cultiu de microspores. Per una banda, hem utilitzat l'albergínia (Solanum melongena) com a exemple de cultiu d'importància econòmica on els protocols encara tenen marge per a l'optimització. La optimització de la densitat de cèl·lules en cultiu i la concentració de reguladors de creixement van demostrar ser útils per modificar l'eficiència de la resposta dels cultius de microspores d'albergínia. D'altra banda, hem utilitzat cultius de microspores de Brassica napus principalment per a estudis bàsics, ja que s'utilitza àmpliament com a model per entendre els processos cel·lulars que es produeixen durant aquest canvi de desenvolupament. Es detalla un protocol estandarditzat per al cultiu de microspores de B. napus, que s'ha utilitzat en tots els cultius inclosos en aquesta Tesi per explorar una sèrie de processos i estructures cel·lulars potencialment implicades en el canvi de desenvolupament cap a l'embriogènesi. Aquests inclouen l'estrès del reticle endoplasmàtic, la mort cel·lular programada, l'autofàgia i l'estructura i composició de la paret cel·lular. Vam estudiar en paral·lel cultius de microspores de dos genotips de B. napus amb diferent resposta androgènica, cultivats en condicions estàndard i afegint-hi Tricostatina A, un modulador epigenètic que s¿ha demostrat beneficiós per a la resposta androgènica en alguns casos. En conjunt, aquesta Tesi representa un avanç en l'optimització dels cultius de microsporas en aquestes espècies i aporta llum sobre el paper d'alguns processos en el context de l'embriogènesi de microspores. / [EN] Doubled haploids are a great tool for hybrid breeding due to their complete homozygosity achievable in only one in vitro generation. Among the several techniques used to obtain these plants, induction of microspore embryogenesis, via anther or microspore culture, is the most common and efficient approach. Microspore embryogenesis is also an example of totipotency of plant cells due to their ability to reprogram themselves from a gametophytic to a sporophytic pathway, where cells proliferate in an organized way to create a new organism. As in many other in vitro procedures, culture conditions must be optimized in order to increase efficiency. In the present Doctoral Thesis, we used two plant species as experimental systems to study and optimize microspore culture. On one hand, we used eggplant (Solanum melongena) as an example of economically important crop where protocols have still room for optimization. Optimization of cell density and growth regulators demonstrated to be useful to modify the efficiency of eggplant microspore cultures. On the other hand, we used B. napus microspore cultures principally for basic studies since it is widely used as a model to understand cellular processes occurring during this developmental switch. A standardized protocol for Brassica napus microspore culture is detailed, which was used in all the cultures included in this Thesis to explore a series of processes and cellular structures potentially involved in the developmental switch towards embryogenesis. These included endoplasmic reticulum stress, programmed cell death, autophagy, and cell wall structure and composition. We studied in parallel microspore cultures from two B. napus genotypes with different androgenic response cultured in standard conditions and adding Trichostatin A, a epigenetic modulator shown to be beneficial for the androgenic response in some cases. Together, this Thesis represents an advance in the optimization of microspore cultures in these species, and sheds light on the role of some processes within the context of microspore embryogenesis. / Thanks are due to the Electron Microscopy Service of Universitat Politècnica de València, Marisol Gascón (IBMCP Microscopy Service). This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MICINN jointly funded by FEDER and by a Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (656579) to PC-M This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MINECO jointly funded by FEDER. / Camacho Fernández, C. (2021). Microspore embryogenesis: cell wall dynamics and reprogramming of cell fate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/163698

[ES] El calcio (Ca2+) es un catión esencial que juega un papel fundamental en todos los organismos vivos. Desde el punto de vista funcional, el Ca2+ actúa como un segundo mensajero que regula distintos procesos celulares. Trabajos anteriores indican que la señalización mediante Ca2+ podría estar implicada en las primeras etapas de la inducción de la embriogénesis in vitro de las plantas, pero el verdadero papel del Ca2+ en este proceso es aún desconocido. Por eso, el principal objetivo de la presente Tesis es el estudio del papel del Ca2+ en la embriogénesis in vitro mediante dos sistemas in vitro: la embriogénesis somática y la embriogénesis de microsporas. Para determinar la importancia de la homeostasis del Ca2+ en la inducción de la embriogénesis y las dinámicas de los niveles de Ca2+ durante la inducción y el establecimiento de embriones somáticos y derivados de microsporas, se utilizaron tratamientos químicos y se detectaron los niveles de Ca2+ mediante sondas fluorescentes y sensores cameleon codificados genéticamente, visualizados con microscopía fluorescente y confocal. Observamos que el aumento de Ca2+ es un marcador temprano en la inducción de la embriogénesis in vitro y que los niveles de Ca2+ durante la embriogénesis in vitro son dinámicos en todos los sistemas estudiados. Además, las oscilaciones en los niveles de Ca2+ podrían estar relacionadas con los procesos de diferenciación que ocurren en las células inducidas una vez une el Ca2+ a la calmodulina. Mostramos que un aumento de Ca2+ dentro de un rango definido de concentración tiene un efecto positivo, dependiendo del sistema, en la producción de embriones, siendo más sensibles aquellos sistemas basados en suspensiones de células aisladas que aquellos que usan tejidos como explantes. Finalmente, estudiamos el papel de la calosa durante la embriogénesis somática, observando que la inhibición de la deposición de calosa impide el desarrollo embrionario, lo que sugiere una relación entre la formación de una barrera de calosa y el establecimiento de la identidad embrionaria en las células somáticas. / [CAT] El calci (Ca2+) és un catió essencial que juga un paper fonamental en tots els organismes vius. Des del punt de vista funcional, el Ca2+ actua com a un segon missatger que regula diferents processos cel·lulars. Treballs anteriors indiquen que la senyalització mitjançant el Ca2+ podria estar implicada en les primeres etapes de la inducció de l'embriogènesi in vitro de les plantes, però el paper real del Ca2+ en aquest procés encara és desconegut. Per això, el principal objectiu de la present Tesi és l'estudi del paper del Ca2+ en l'embriogènesi in vitro mitjançant dos sistemes in vitro: l'embriogènesi somàtica i l'embriogènesi de micròspores. Per tal de determinar la importància de l'homeòstasi del Ca2+ en la inducció de l'embriogènesi i les dinàmiques dels nivells de Ca2+ durant la inducció i l'establiment d'embrions somàtics i derivats de micròspores, es van utilitzar tractaments químics i es van detectar els nivells de Ca2+ mitjançant sondes fluorescents i sensors de cameleon codificats genèticament, visualitzats amb microscòpia fluorescent i confocal. Vam observar que l'augment de Ca2+ és un marcador primerenc en la inducció de l'embriogènesi in vitro i que els nivells de Ca2+ durant l'embriogènesi in vitro són dinàmics en tots els sistemes estudiats. A més, les oscil·lacions en els nivells de Ca2+ podrien estar relacionades amb els processos de diferenciació que tenen lloc en les cèl·lules induïdes una vegada uneix el Ca2+ a la calmodulina. Vam mostrar que un augment de Ca2+ dins d'un rang definit de concentració té un efecte positiu, depenent del sistema, en la producció d'embrions, essent més sensibles aquells sistemes basats en suspensions de cèl·lules aïllades que aquells que usen teixits com a explants. Finalment, vam estudiar el paper de la cal·losa durant l'embriogènesi somàtica, i vam observar que la inhibició de la deposició de cal·losa impedeix el desenvolupament embrionari, la qual cosa suggereix una relació entre la formació d'una barrera de cal·losa i l'establiment de la identitat embrionària en les cèl·lules somàtiques. / [EN] Calcium (Ca2+) is an essential cation that plays fundamental roles in all living organisms. From a functional point of view, Ca2+ acts as a second messenger that regulates different cellular processes. Previous works point to the fact that Ca2+ signaling may be involved in the early stages of induction of in vitro plant embryogenesis, but the actual role of Ca2+ in this process remained unveiled. Thus, the main goal of the present Thesis is to study the role of Ca2+ in in vitro embryogenesis using two in vitro systems: somatic embryogenesis and microspore embryogenesis. Chemical treatments and detection of Ca2+ with fluorescent probes and genetically-encoded cameleon sensors imaged by fluorescence and confocal microscopy were performed to determine the importance of Ca2+ homeostasis for induction of embryogenesis and the dynamics of Ca2+ levels during the induction and establishment of somatic and microspore-derived embryos. We observed that Ca2+ increase is an early marker of induction of in vitro embryogenesis and Ca2+ levels during in vitro embryogenesis are dynamic in all the systems we studied. Moreover, Ca2+ oscillations might be related to the differentiation processes that take place in the induced cells upon binding to calmodulin. We showed that Ca2+ increase within a defined range has system-specific positive effects in embryo yield, being more sensitive those systems using isolated cell suspensions rather than those using tissues as explants. Finally, we studied the role of callose during somatic embryogenesis, and we observed that inhibiting callose deposition prevents embryo development, which suggests a relationship between the formation of a callose barrier and the establishment of embryo identity in somatic cells. / Calabuig Serna, A. (2023). Multidisciplinary study of the role of calcium in plant in vitro embryogenesis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196022