A busca por novos fármacos inspirados em substâncias de origem natural é uma estratégia conhecida e há tempos utilizada. As lactonas sesquiterpênicas (LST) são um grupo de substâncias amplo e diverso com várias atividades farmacológicas descritas, e cuja característica estrutural determinante é a de um esqueleto principal contendo 15 átomos de carbono e um anel lactônico. O mecanismo de ação das LST está intrinsicamente relacionado com reações de adição do tipo Michael frente a biomoléculas, provocando alquilações. Há na literatura estudos aprofundados sobre a química medicinal das LST, entretanto pouco há sobre o metabolismo desse grupo de substâncias em ambientes fisiológicos. Neste sentido, este trabalho é focado no estudo do metabolismo e também das vias de fragmentação por eletrospray da budleína A, que possui estrutura química do tipo furanoeliangolido, e pertence à classe dos germacranolidos. Foram realizados ensaios in vitro utilizando-se os modelos de oxidação biomimética com metaloporfirina, microssomas hepáticos e metabolismo pela microbiota intestinal de ceco de porco (pig cecum model), sendo nos dois últimos testado também o correlato 4,5-dihidro-2\',3\'-epoxi-15-desoxigoyazensolido. O estudo de fragmentação também abordou a comparação entre budleína A e a centraterina - um estereoisômero que se diferencia apenas pela orientação da cadeia lateral ligada ao C-8 - em espectrômetros distintos e com suporte de métodos computacionais para cálculos de energia (Gaussian 03 em base B3LYP/6-31G(d)). Nos estudos de fragmentação observou-se a diferença de intensidade dos sinais para íons fragmento comuns às duas LST (m/z 275, 257 e 83), além da presença do íon fragmento de m/z 293 apenas para a budleína A, permitindo a diferenciação destes isômeros por meio de espectrometria de massas com ionização por eletrospray, sem a necessidade de ressonância de magnética nuclear. Os produtos de oxidação detectados na reação com metaloporfirinas acusaram a epoxidação na cadeia lateral envolvendo C-2\' e C-3\' com a formação de diastereoisômeros. No ensaio com microssomas não foram detectados produtos para a budleína A, enquanto que para a substância correlata observou-se a abertura do epóxido na cadeia lateral e adição de uma hidroxila, formando um diol vicinal. No modelo de ceco de porco observaram-se a formação de adutos de LST com o aminoácido cisteína, os quais foram posteriormente degradados pela ação da microbiota intenstinal, dando origem a diversos metabólitos compostos pela LST e partes de cisteína. Sendo assim, este trabalho lança bases para a maior compreensão do metabolismo de LST do tipo furanoeliangolido em modelos distintos e também contribui para os estudos de espectrometria de massas para este tipo de substância, além de descrever uma ferramenta analítica útil na diferenciação de dois estereoisômeros. / The search for new drugs inspired on compounds from natural products is a wellknown strategy with several successful cases. Sesquiterpene lactones (STL) are a wide and diversified group of compounds which has already many pharmacological activities reported. Their fundamental moiety includes a skeleton containing 15 carbons and a lactone ring and the mechanism of action is related to Michael addition type reactions with biomolecules, promoting alkylation. There are a high amount of studies regarding the medicinal chemistry of the STL, however there are few information about the metabolism of these compounds under physiological environments. On this way, the aims of this work are focused on the study of the metabolism as well as the fragmentation pathways of budlein A, which is a furanoheliangolide and belongs to the germacranolides class. On this work the following experiments were carried out: in vitro oxidative metabolism with metalloporphyrin and microsomes; intestinal metabolism by using the pig cecum model (microbiota). For microsomes and intestinal metabolism the compound 4,5- dihydro-2\',3\'-epoxy-15-deoxy-goyazensolide was also applied. Fragmentation studies compared the fragmentation patterns of budlein A and centratherin - which is a stereoisomer with -orientation for the side chain bonded at C-8 - by using different spectrometers being supported by computational methods for energies calculations (Gaussian 03 at level B3LYP/6-31G(d)). For the fragmentation studies it was observed the difference of signal intensities for fragment ions which are common for both STL (m/z 275, 257 e 83), moreover the ion m/z 293 was detected only for budlein A, allowing the differentiation between these isomers by electrospray ionization mass spectrometry instead nuclear magnetic resonance. The reactions with metalloporphyrin yielded two diastereoisomers of the STL with an epoxide at the side chain between C-2\'and C-3\'. On the microsome assay any product was detected for budlein A, while for the correlated compound the epoxide ring was opened and a hydroxyl was added at C-3\', forming a vicinal diol. On the pig cecum model it was observed the formation of adducts due to the reaction of the STL and the amino acid cysteine. These adducts were later degraded by the action of the microbiota yielding different metabolites composed by STL and residues of cysteine. Thus, this work may contribute to the improvement of the knowledge about the metabolism of STL furanoheliangolide type in different models as well as for the studies regarding the mass spectrometry of this type of compound. The development of a useful analytical tool for the differentiation of two isomers was also an important achievement.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.

A busca por novos fármacos inspirados em substâncias de origem natural é uma estratégia conhecida e há tempos utilizada. As lactonas sesquiterpênicas (LST) são um grupo de substâncias amplo e diverso com várias atividades farmacológicas descritas, e cuja característica estrutural determinante é a de um esqueleto principal contendo 15 átomos de carbono e um anel lactônico. O mecanismo de ação das LST está intrinsicamente relacionado com reações de adição do tipo Michael frente a biomoléculas, provocando alquilações. Há na literatura estudos aprofundados sobre a química medicinal das LST, entretanto pouco há sobre o metabolismo desse grupo de substâncias em ambientes fisiológicos. Neste sentido, este trabalho é focado no estudo do metabolismo e também das vias de fragmentação por eletrospray da budleína A, que possui estrutura química do tipo furanoeliangolido, e pertence à classe dos germacranolidos. Foram realizados ensaios in vitro utilizando-se os modelos de oxidação biomimética com metaloporfirina, microssomas hepáticos e metabolismo pela microbiota intestinal de ceco de porco (pig cecum model), sendo nos dois últimos testado também o correlato 4,5-dihidro-2\',3\'-epoxi-15-desoxigoyazensolido. O estudo de fragmentação também abordou a comparação entre budleína A e a centraterina - um estereoisômero que se diferencia apenas pela orientação da cadeia lateral ligada ao C-8 - em espectrômetros distintos e com suporte de métodos computacionais para cálculos de energia (Gaussian 03 em base B3LYP/6-31G(d)). Nos estudos de fragmentação observou-se a diferença de intensidade dos sinais para íons fragmento comuns às duas LST (m/z 275, 257 e 83), além da presença do íon fragmento de m/z 293 apenas para a budleína A, permitindo a diferenciação destes isômeros por meio de espectrometria de massas com ionização por eletrospray, sem a necessidade de ressonância de magnética nuclear. Os produtos de oxidação detectados na reação com metaloporfirinas acusaram a epoxidação na cadeia lateral envolvendo C-2\' e C-3\' com a formação de diastereoisômeros. No ensaio com microssomas não foram detectados produtos para a budleína A, enquanto que para a substância correlata observou-se a abertura do epóxido na cadeia lateral e adição de uma hidroxila, formando um diol vicinal. No modelo de ceco de porco observaram-se a formação de adutos de LST com o aminoácido cisteína, os quais foram posteriormente degradados pela ação da microbiota intenstinal, dando origem a diversos metabólitos compostos pela LST e partes de cisteína. Sendo assim, este trabalho lança bases para a maior compreensão do metabolismo de LST do tipo furanoeliangolido em modelos distintos e também contribui para os estudos de espectrometria de massas para este tipo de substância, além de descrever uma ferramenta analítica útil na diferenciação de dois estereoisômeros. / The search for new drugs inspired on compounds from natural products is a wellknown strategy with several successful cases. Sesquiterpene lactones (STL) are a wide and diversified group of compounds which has already many pharmacological activities reported. Their fundamental moiety includes a skeleton containing 15 carbons and a lactone ring and the mechanism of action is related to Michael addition type reactions with biomolecules, promoting alkylation. There are a high amount of studies regarding the medicinal chemistry of the STL, however there are few information about the metabolism of these compounds under physiological environments. On this way, the aims of this work are focused on the study of the metabolism as well as the fragmentation pathways of budlein A, which is a furanoheliangolide and belongs to the germacranolides class. On this work the following experiments were carried out: in vitro oxidative metabolism with metalloporphyrin and microsomes; intestinal metabolism by using the pig cecum model (microbiota). For microsomes and intestinal metabolism the compound 4,5- dihydro-2\',3\'-epoxy-15-deoxy-goyazensolide was also applied. Fragmentation studies compared the fragmentation patterns of budlein A and centratherin - which is a stereoisomer with -orientation for the side chain bonded at C-8 - by using different spectrometers being supported by computational methods for energies calculations (Gaussian 03 at level B3LYP/6-31G(d)). For the fragmentation studies it was observed the difference of signal intensities for fragment ions which are common for both STL (m/z 275, 257 e 83), moreover the ion m/z 293 was detected only for budlein A, allowing the differentiation between these isomers by electrospray ionization mass spectrometry instead nuclear magnetic resonance. The reactions with metalloporphyrin yielded two diastereoisomers of the STL with an epoxide at the side chain between C-2\'and C-3\'. On the microsome assay any product was detected for budlein A, while for the correlated compound the epoxide ring was opened and a hydroxyl was added at C-3\', forming a vicinal diol. On the pig cecum model it was observed the formation of adducts due to the reaction of the STL and the amino acid cysteine. These adducts were later degraded by the action of the microbiota yielding different metabolites composed by STL and residues of cysteine. Thus, this work may contribute to the improvement of the knowledge about the metabolism of STL furanoheliangolide type in different models as well as for the studies regarding the mass spectrometry of this type of compound. The development of a useful analytical tool for the differentiation of two isomers was also an important achievement.

O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontra-se distribuído nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Estudos químicos têm demonstrado diversidade de metabólitos secundários com atividade biológica. Os alcalóides são metabólitos característicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6- diidropiridin-2(1H)-ona, é um alcalóide encontrado em muitas espécies. Tem atividade citotóxica contra células de linhagem tumoral, ansiolítica, antidepressiva, antifúngica e antiagregação plaquetária, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo fármaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a fármaco é um fator importante na avaliação da sua segurança e eficácia. Ensaios in vitro estão crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepáticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de fígado de ratos, bem como a determinação dos possíveis metabólitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da piplartina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Como condição de análise, empregou-se uma coluna C18, fase móvel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazão de 1 mL min-1. Para extração da piplartina dos microssomas hepático de ratos foi empregado a extração líquido-líquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Após otimização da extração, o método foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 ?M, obtendo-se uma equação da reta y= 0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificação de 2,4 ?M. A recuperação média foi de 85%. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. A piplartina manteve-se estável até 50 minutos em condições de incubação, e até 6h sob a bancada. Após validação da metodologia, estabeleceram-se as condições lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubação: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e então efetuou-se a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos da piplartina empregando as condições de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 ± 0,26 ?M/?g mL-1/min, h= 2,53 ± 0,37, S50= 44,69 ± 0,32 ?M e CLmax= 0,054 ?L/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinação dos possíveis metabólitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possível identificar a formação de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta útil, rápida e simples para determinação da cinética enzimática, e na condução dos estudos preliminares de metabolismo in vitro. / The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 ?M, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 ?M. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 ± 0.26 ?M/mg mL-1/min, h = 2.53 ± 0.37, S50 = 44.69 ± 0.32 ?M, and CLmax = 0.054 ?L/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies.

Catecol e catecolaminas foram ensaiados sobre as atividades NADPH e NADH oxidásica dos microssomos. Quantidades catalíticas de adrenalina aumentam de duas a três vezes a velocidade de oxidação do NADPH, após um pequeno período de indução. O efeito da adrenalina é suprimido pela superóxido dismutase, se a enzima é adicionada antes de iniciada a reação. O efeito catalítico é atribuído a dois produtos de oxidação da adrenalina pelo íon superóxido; à quinona, produto de oxidação de dois elétrons e ao adrenocromo, produto de oxidação de quatro elétrons. Provavelmente, o adrenocromo reoxida a NADPH citocromo c redutase, e a quinona formada reage com oxigênio, regenerando adrenocromo. A adrenalina não mostrou qualquer efeito sobre a atividade NADH oxidásica, nem sobre a atividade NADPH oxidásica, estimulada por menadiona. Provavelmente, durante estes processos, dois elétrons são transferidos simultaneamente ao oxigênio. Catecol e catecolaminas duplicam a velocidade de oxidação do NADH em presença de quantidades catalíticas de NADH-citocromo b5 redutase e citocromo b5. Este resultado sugere a formação do íon superóxido, durante a autoxidação do citocromo b5. Catecol e p-hidroquinona promovem, cataliticamente, a oxidação da oxihemoglobina e oximioglobina à forma ferri. A velocidade de oxidação da oxihemoglobina mostra dependência de primeira ordem em relação à concentração de hemeproteína e de meia ordem em relação ao difenol ; contudo a altas concentrações dos catalisadores observa-se saturação, com valores de Vmáx similares para ambos os difenóis. É proposto que uma quinona , inicialmente formada, oxida a oxihemeproteína com liberação de oxigênio; por sua vez, a semiquinona oxida uma segunda molécula de oxihemeproteína, sendo que o oxigênio ligado recebe dois elétrons. Exceto para o caso da oximioglobina, que é mais reativa, a forma reduzida do catalisador deve estar presente para se opor ao desaparecimento da semiquinona por dismutação. Desde que se observa a liberação de oxigênio, esperada para a formação de água, o sistema pode ser considerado modelo de oxidase terminal. Infere-se tentativamente, que a oxihemoglobina tem estrutura HbFe2+ ...O2, e que a velocidade da oxidação catalisada é limitada pela velocidade de produção da verdadeira forma reativa, a estrutura ferri-superóxido, HbFe3+...O-2. / Catechol and catecholamines have been assayed upon the microsomal NADPH and NADH oxidase activities. Adrenaline shows a catalytic effect on the NADPH oxidation characterized by a small lag. The two-to three fold increase in rate can be supressed by dismutase if the enzyme is added before superoxide the reaction begins. The catalytic effect is ascribed to two products of adrenaline oxidation by the superoxide ion; to the quinone, the two electron oxidation product, and to the adrenochrome, the four electron oxidation product. Presumably, the adrenochrome reoxidizes the NADPH-cytochrome c reductase, and the formed quinone reacts with oxygen and regenerates the adrenochrome. Adrenaline neither changed, the NADH oxidase activity nor the menadione-stimulated NADPH oxidase activity. Presumably in these processes, two electrons are simultaneously transferred to the oxygen. Catechol and catecholamines doubled the rate of autoxidation of NADH in the presence of catalytic amounts of NADH-cytochrome b5 reductase and cytochrome b5 This result suggests superoxide ion formation in the autoxidation of the cytochrome. Catechol and p-hydroquinone catalytically promote the oxidation of oxyhemoglobin and oxymyoglobin to the ferri-form. Kinetic data for oxyhemoglobin oxidation indicates a first-order dependence upon the hemoprotein concentration and half-order dependence upon diphenol; however at high catalyst concentration, saturation is observed with similar Vmax values for both diphenols despite the difference in reactivity. It is proposed that initially formed quinone oxidizes the hemoprotein with oxygen release; in turn the semiquinone oxidizes a second molecule of hemoprotein and regenerates the quinone, with the bound oxygen acquiring two electrons. Except for the more reactive oxymyoglobin, the reduced form of the catalyst must be present to oppose semiquinone disappearance by dismutation, Since the expected release of 02 for water formation is observed, the system may be considered a model for terminal oxidase. It is tentatively inferred that oxyhemoglobin has the structure HbFe2+...02 and that the rate of the catalyzed oxidation is limited by the rate of generation of the true reacting form, the superoxide ferri structure, HbFe3+...0-2.