The conformation of paclitaxel in the bound state on the protein has been proposed to be the T-taxol conformation, and paclitaxel analogs constrained to the T-taxol conformation proved to be significantly more active than paclitaxel in both cytotoxicity and tubulin polymerization assays, thus validating the T-taxol conformation as the tubulin-binding conformation. In this work, eight compounds containing an aza-tricyclic moiety as a mimic of the baccatin core of paclitaxel have been designed and synthesized as water-soluble simplified paclitaxel analogs, among which 3.50-3.52 and 3.55 were conformationally constrained analogs designed to bind to the paclitaxel binding site of tubulin, based on their similarity to the T-taxol conformation. The open-chain analogs 3.41-3.43 and 3.57 and the bridged analogs 3.50-3.52 and 3.55 were evaluated for their antiproliferative activities against the A2780 cell lines. Analogs 3.50-3.52 and 3.55 which were designed to adopt the T-taxol conformation showed similar antiproliferative activities compared to their open-chain counterparts. They were all much less active than paclitaxel. In the second project, a series of paclitaxel analogs with various thio-containing linkers at C-2′ and C-7 positions were designed and synthesized in our lab. These analogs were attached to the surfaces of gold nanoparticles by CytImmune Sciences for the development of mutifunctional tumor-targeting agents. The native analogs and the gold bound analogs were evaluated for their antiproliferative activities against the A2780 cell line. All the compounds tested showed comparable or better activities than paclitaxel. Stability studies were performed for selected analogs in hydrolysis buffer, which showed that the analogs released paclitaxel in buffer over time. In the third project, the synthesis of a conformationally constrained paclitaxel analog which was designed to mimic the REDOR-taxol conformation was attempted. Two synthetic routes were tried and significant progress was made toward the synthesis of the conformationally constrained analog. However, both of the current synthetic routes failed to produce the key intermediate that would serve as the precursor for a ring-closing metathesis reaction to furnish the macrocyclic ring. / Ph. D.

No description available.

La morphogenèse des plantes repose sur deux mécanismes cellulaires : la division et l'élongation. Par ailleurs, la croissance est source de contraintes mécaniques qui affectent les cellules et guident la morphogenèse. Si les contraintes mécaniques influencent l'orientation du plan de division dans les cellules animales, rien n'est prouvé pour les cellules végétales. À l'heure actuelle, la forme de la cellule est proposée comme le facteur principal gouvernant l'orientation du plan dans les divisions symétriques : les cellules se divisent selon un des plans les plus courts. Cette règle géométrique a été validée dans des tissus à croissance ou courbure isotropes, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents demeurent inconnus. Dans cette thèse, un pipeline a été mis au point pour analyser les divisions cellulaires dans les différents domaines du méristème apical caulinaire d'Arabidopsis thaliana et questionner l'application de la règle géométrique dans ce tissu. La zone frontière du méristème présente une proportion anormalement basse de plans de division très courts. Des simulations de tissus en croissance, dans lesquelles une règle de division mécanique a été implémentée, ont montrées le même biais sur les orientation des plans, comparé à la règle géométrique. Des ablations laser de quelques cellules de l'épiderme ont également été effectuées afin de perturber localement le patron de contraintes mécaniques. Les résultats montrent que l'orientation du plan des divisions postérieures à cette perturbation suit le nouveau patron de contraintes. Enfin, une nouvelle méthode quantitative, basée sur l'utilisation d'un micro-indenteur, a été mise au point pour quantifier la réponse du cytosquelette, et en particulier des microtubules, aux contraintes mécaniques. Le protocole de compression a été testé et validé sur les mutants katanin et spiral2, dans lesquels la réponse aux contraintes est respectivement faible ou amplifiée. / Morphogenesis during primary plant growth is driven by cell division and elongation. In turn, growth generates mechanical stress, which impacts cellular events and channels morphogenesis. Mechanical stress impacts the orientation of division plane in single animal cells; this remains to be fully demonstrated in plants. Currently, cell geometry is proposed to be the main factor determining plane orientation in symmetric divisions: cell divide along one the shortest paths. This geometrical rule was tested on tissues with rather isotropic shapes or growth and the corresponding molecular mechanism remains unknown, although it could involve tension within the cytoskeleton. To address these shortcomings, we developed a pipeline to analyze cell divisions in the different domains of the shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana. We computed the probability of each possible planes according to cell geometry and compared the output to observed orientations. A quarter of the cells did not follow the geometrical rule. Boundary domain was enriched in long planes aligned with supracellular maximal tension lines. Computer simulations of a growing tissue following a division rule that relies on tension gave the most realistic outputs. Mechanical perturbations of local stress pattern, by laser ablations, further confirmed the importance of mechanical stress in cell division. To explore the role of microtubules in this process, we developed a microindenter-based protocol to quantify the cytoskeletal response to mechanical stress. This protocol was tested and validated in the katanin and spiral2 mutants, in which the response to stress is delayed or promoted respectively.

Les impulsions de champ électrique nanoseconde de forte intensité (nsPEF) ont été proposées pour le traitement du cancer avec des effets secondaires minimes et peu susceptibles de conduire à une résistance de la tumeur au traitement. Le glioblastome multiforme (GBM) est un cancer du cerveau incurable montrant une résistance aux traitements actuels tels que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. Dans cette thèse, l'imagerie des cellules vivantes est utilisée pour étudier in vitro les effets de nsPEF sur une lignée de cellules de glioblastome humain (U87-MG), et pour évaluer la pertinence de l'utilisation des nsPEF en tant que nouveau traitement pour le GBM. En accord avec les résultats publiés précédemment, nous montrons que les cellules U87-MG répondent aux nsPEF avec une poration de la membrane plasmique, une augmentation rapide du calcium intracellulaire et une perte progressive du potentiel de membrane mitochondriale. De nouveaux résultats montrent que 100 impulsions de 10 ns délivrées à 44 kV/cm perturbent la dynamique de croissance des microtubules indépendamment du calcium et du gonflement, ces derniers étant connus pour provoquer la dépolymérisation des microtubules. La microscopie à super-résolution nous a permis de visualiser les flexions et ruptures de microtubules après l'application nsPEF suggérant un effet plus direct des impulsions. L'étude des nsPEF sur le calcium a également été menée via des indicateurs de calcium génétiquement encodés (GECIs) qui permettent une comparaison entre les GECIs et les indicateurs chimiques couramment utilisés. En utilisant le GECI GCaMP, le potentiel d'expression des GECIs dans des endroits subcellulaires spécifiques a permis de mettre en évidence une onde de calcium induite par l'application des nsPEF, grâce à une forme de GCaMP fixée à la membrane plasmatique. Ce phénomène, qui n'est pas habituel avec des indicateurs chimiques cytosoliques classiques en raison de la diffusion, permet de confirmer l'origine extracellulaire des pics de calcium post nsPEF. Cette thèse démontre que les nsPEF appliqués à des cellules U87-MG induisent plusieurs effets cellulaires majeurs et potentiellement destructeurs. La perturbation du réseau de microtubules par les nsPEF pourrait éventuellement être exploitée comme un antimitotique, administré localement, pour le traitement de GBM, avec des effets secondaires systémiques réduits et une faible résistance au traitement. / High powered, nanosecond duration pulsed electric fields (nsPEF) have been proposed as a minimal side-effect, electrical cancer therapy that is unlikely to result in tumour resistance. Glioblastoma multiforme (GBM) is an incurable brain cancer showing resistance to current treatments such as surgery, radiotherapy and chemotherapy. This thesis uses live-cell imaging to look in vitro at the effects of nsPEF on a human glioblastoma cell line (U87-MG) in a first step towards assessing its suitability as a novel treatment for GBM. In agreement with previously published results we show that U87-MG cells respond to nsPEF with plasma membrane poration, a rapid increase in intracellular calcium and a gradual loss of mitochondrial membrane potential. We present novel results showing that 100, 10 ns pulses delivered at 44 kV/cm disrupt microtubule growth dynamics in a way that is independent of calcium and swelling, both of which are known to cause microtubule depolymerisation. Super-resolution microscopy allowed us to visualise microtubules bending and breaking following nsPEF application suggesting a more direct effect of the pulse. We look also at the application of genetically encoded calcium indicators (GECIs) to nsPEF calcium studies making a comparison between GECIs and commonly used chemical indicators. Using the GECI GCaMP, we show the advantages of being able to express GECIs in specific subcellular locations by visualising an nsPEF induced calcium wave with a plasma membrane bound form of GCaMP. This event, which is not evident with classic cytosolic chemical indicators due to diffusion, helps confirm the extracellular origin of the post-nsPEF calcium spike. The work in this thesis demonstrates that nsPEF causes several major, and possibly destructive, cellular events when applied to U87-MG cells. The disruption of the microtubule network by nsPEF could potentially be exploited as a locally administered antimitotic, for GBM treatment, with reduced systemic side effects and lower occurrences of resistance.

Les microtubules sont des éléments dynamiques du cytosquelette qui contrôlent à la fois l’organisation du cytoplasme, la polarité, la migration et la division cellulaire. Notre laboratoire a précédemment montré que la kinase de stress JNK (c-Jun NH2-terminal Kinase) régule la dynamique des microtubules dans les cellules épithéliales de mammifères, en augmentant les vitesses de polymérisation, ainsi que les fréquences de sauvetage (transition vers une phase de repolymérisation). Alors que certaines protéines neuronales capables de réguler la dynamique des microtubules ont été identifiées comme des substrats de JNK, leurs équivalents dans les cellules épithéliales sont largement méconnus. Dans le but de comprendre comment JNK module la dynamique des microtubules dans les cellules épithéliales de mammifère, nous avons étudié deux substrats potentiels de JNK : la -tubuline et le facteur de sauvetage CLIP-170. Nous avons bien mis en évidence in vitro, une phosphorylation de la -tubuline par JNK sur une thréonine non-consensus, mais cette phosphorylation n’a pas été retrouvée dans les cellules HeLa, suggérant que la -tubuline n’est pas un substrat naturel de JNK in vivo. Nous avons mis en évidence par ailleurs que CLIP-170 est un nouveau substrat de JNK. Dans les cellules épithéliales, JNK activée phosphoryle trois résidus (Thr25, Thr45 et Ser147) situés dans la partie N-terminale de CLIP-170 de part et d’autre du premier domaine CAP-Gly qui est nécessaire pour l’interaction avec les microtubules. Ces acides aminés présentent des différences aussi bien dans leur phosphorylation basale que dans leurs cinétiques de phosphorylation par JNK sous divers stress. De plus, nous avons trouvé que dans différentes cellules épithéliales, la phosphorylation de ces sites est conservée. In vitro, ces résidus sont directement phosphorylés par JNK, préférentiellement quand le domaine N-terminal de CLIP-170 lie la tubuline. De plus, l’expression de mutants de CLIP-170 phospho-mimétiques et non-phosphorylables a montré que la phosphorylation de chaque site augmente la fréquence des sauvetages microtubulaires. Cette modulation n’est pas corrélée à une augmentation de la capacité de CLIP-170 à former des comètes aux extrémités plus en croissance ou à être retenue aux croissements microtubulaires, qui sont des sites de sauvetage potentiels.Ce travail a permis de décrire les premières phosphorylations de CLIP-170 qui stimulent sa fonction de sauvetage in vivo. Il souligne par ailleurs la complexité des mécanismes de sauvetage, qui demeurent un aspect encore énigmatique de l’instabilité dynamique des microtubules. L’activité de JNK sur CLIP-170 ne permet d’expliquer qu’une partie des effets de la kinase sur la dynamique des microtubules, aussi la recherche d’autres protéines cibles de JNK pouvant réguler notamment leur vitesse de polymérisation, reste à entreprendre. / Microtubules are dynamic cytoskeleton elements, which control cytoplasm organization, cell polarity, migration and division. Our laboratory has previously shown that the stress kinase JNK (c-Jun NH2-terminal Kinase) regulates microtubule dynamics in mammalian epithelial cells, by increasing their growth rates, and their rescue frequencies (transition towards phases of repolymerization). While several neuronal proteins regulating microtubule dynamics have been identified as JNK substrates, their counterparts in epithelial cells are largely unknown. With the aim to understand how JNK modulates microtubule dynamics in mammalian epithelial cells, we studied two putative substrates of JNK: -tubulin and the rescue factor CLIP-170. Regarding -tubulin, using an in vitro kinase assay, we found that a non-consensus threonine is actually phosphorylated by JNK, but we were not able to find this phosphorylation in HeLa cells, suggesting that -tubulin is not a natural JNK substrate. In parallel, we found that CLIP-170 is a new substrate of JNK in epithelial cells. Activated JNK phosphorylates three residues (Thr25, Thr45 and Ser147) located in the N-terminal part of CLIP-170, on each side of the first CAP-Gly domain, which is required for CLIP-170 interaction with microtubules. These residues exhibit differences in their level of basal phosphorylation and their kinetics of phosphorylation by JNK under various stresses. Moreover, we found that in different epithelial cells, the phosphorylation of these sites is conserved. Using an in vitro kinase assay, we found that all these residues are directly phosphorylated by JNK, preferentially when the N-terminal domain of CLIP-170 binds tubulin. Furthermore, using phospho-mimetic and non-phosphorylatable CLIP-170 mutants in epithelial cells, we revealed that the phosphorylation of each site increases microtubule rescues. Such modulation operates without increasing CLIP-170 capability to form comets at the microtubule growing plus ends or to accumulate at microtubule crossings, which are potential rescue sites.This work described the first phosphorylations that enhance CLIP-170 rescue factor function in vivo. It also points out to which extent rescue mechanisms are complex and remain an elusive aspect of dynamic instability. JNK-mediated phosphorylation of CLIP-170 only partly explains the kinase effects on microtubule dynamics. Therefore, identifying other JNK targets that may regulate microtubule polymerization rate, remains to be addressed.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La phosphorylation des protéines constitue la modification post-traductionnelle la plus importante chez les eucaryotes. Réalisée par des protéines kinases, elle intervient dans plusieurs processus cellulaires et en particulier dans la signalisation. La grande famille des kinases est subdivisée en plusieurs groupes dont les MAPKs qui sont caractérisées par un relais de phosphorylation comprenant trois niveaux (MAPKKK-MAPKK-MAPK). Le rôle des MAPKs a été démontré chez un grand nombre d’organismes et est lié fonctionnellement à plusieurs processus biologiques. Dans ce projet, nous avons essayé de mettre en évidence la fonction de trois MAPKKK (MKKK19, MKKK20 et MKKK21) chez Arabidopsis thaliana, une plante modèle dont le génome a été entièrement séquencé en 2000. Ces trois kinases sont similaires aux kinases FRK1 et FRK2 qui sont impliquées dans le développement des gamètes mâles et femelles chez la pomme de terre sauvage Solanum chacoense. Les MKKK19-21 sont fortement exprimées au niveau de la fleur et plus précisément dans le pollen. L’analyse des lignées de plantes simples mutants pour ces trois kinases ne montre aucun défaut développemental évident en conditions normales suggérant fortement une redondance fonctionnelle entre ces gènes. Par contre, les plantes sous-exprimant les MKKK19-21 produisent un grand nombre de grains de pollen déformé et non viable. La croissance des tubes polliniques est aussi affectée dans ces mutants. Les observations microscopiques ont montré que c’est au stade tricellulaire de la microsporogenèse que ces lignées mutantes sont affectées. Ainsi, ces trois kinases joueraient un rôle important dans la phase tardive du développement pollinique chez Arabidopsis. De façon à déterminer les protéines pouvant agir tant en amont qu’en aval des MKKK19-21, un criblage par la méthode de double hybride chez la levure a été réalisé à partir d’une banque d’ADNc des transcrits d’A.thaliana. Ceci nous a permis d’identifier un grand nombre d’interactants, dont plusieurs protéines kinases pouvant former des voies de signalisation avec les trois MKKK19-21. C’est le cas de la MPK18 qui interagit spécifiquement avec la MKKK20 et pour laquelle un rôle dans la régulation des microtubules corticaux (MTC) avait été démontré. Les résultats de l’analyse des mutants MKKK20 ainsi que les essais kinases nous ont permis de placer la MKKK20 en amont de la MPK18 dans la régulation des MTC. De plus, nous avons pu montrer que la MKK3 interagit spécifiquement avec la MKKK20 parmi les dix MKKs d’Arabidopsis et que ces deux kinases peuvent former un module MAPK aussi lié fonctionnellement aux MTC. L’analyse des doubles mutants (mkkk20/mpk18 et mkk3/mpk18) ainsi que les essais kinases et les observations microscopiques des polymères microtubulaires nous ont permis de caractériser deux voies impliquées dans la régulation des MTC. La première voie, celle de la MKKK20 et de la MPK18 est non canonique, ne nécessitant pas la présence d’une MKK entre les deux, alors que la deuxième voie serait canonique et comprend la MKKK20, MKK3 et possiblement d’autre(s) MPK(s) en aval. Nos résultats suggèrent que ces deux voies sont indépendantes et non synergiques jouant un rôle dans l’instabilité dynamique des MT chez Arabidopsis. / Protein phosphorylation is the major post-translational molecular mechanism through which many eukaryotic proteins are regulated. Phosphorylation is involved in several biological processes and is carried out by kinase enzymes. The very large family of kinases is divided into many subgroups including MAPKs which function as a canonical module of three stepwise phosphorylation events (MAPKKK-MAPKK-MAPK). In this project, we aimed to study the function of three MAPKKK, MKKK19, 20 and 21 in Arabidopsis thaliana, as it has been shown that two of their potential orthologues, FRK1 and 2 in Solanum chacoense are involved in male (pollen) and female (embryo sac) gametophyte development. We found that the MKKK19-21 were highly expressed in reproductive organs, more specifically inside pollen grains. MKKK19-21 single mutants showed WT phenotype under normal conditions, suggesting a possible functional redundancy from these genes. To overcome this, down-regulation of endogenous MKKK19-21 expression via transformation of WT A. thaliana with an artificial microRNA (amiRNA) construct was made. This led to the production of plants exhibiting a high number of dead pollen grains, as well as with defects in pollen tube growth for the viable ones. Microscopic observations of microsporogenesis showed that pollen developmental defects occurred at the tricellular stage. Consequently, the three MKKK19-21 are functionally important for the late stage of pollen development in A. thaliana. In order to find proteins acting both upstream and downstream of MKKK20, a yeast two-hybrid screen was performed against an Arabidopsis cDNA library. This led to the identification of a large number of interacting proteins. These proteins belong to several functional categories with some that could act in signaling pathways with MKKK19-21. Among them, MAPK18 that was demonstrated to regulate cortical microtubules (CMT) and that was found to interact specifically with MKKK20. The results of MKKK20 mutant plants analyses and kinase assays indicate that MKKK20 would act upstream of MPK18 in regulating CMT. The MKK3 was also found from a directed Y2H screen, and was shown to specifically interact with MKKK20 among the 10 Arabidopsis MKKs. MKK3 mutant analysis showed that both kinases could form a MAPK signaling pathway functionally linked to CMT. Furthermore, double mutants (mkkk20/mpk18 and mkk3/mpk18) analysis and kinase assays as well as microscopic observations of microtubule polymers allowed us to postulate that two different signaling pathways are involved in the regulation of CMT. The first one, considered as non-canonical MAPK pathway consists of MKK20 and MPK18, bypassing the need of an MKK, while the second one is a canonical pathway that comprises MKKK20, MKK3 and possibly other MPK(s). We concluded from these results that the two pathways are independent and do not work synergistically in MT dynamic instability in Arabidopsis cells.

Dans cette thèse, des méthodes de la physique statistique hors équilibre sont utilisées pour décrire deux processus intracellulaires. Le transport bidirectionnel sur les microtubules est décrit à l'aide d'un gaz sur réseau stochastique quasi-unidimensionnel. Deux espèces de particules sautent dans des directions opposées en interagissant par exclusion. La présence habituelle d'accumulations de particules peut être supprimée en rajoutant la dynamique du réseau, c'est-à-dire de la microtubule. Un modèle simplifié pour la dynamique du réseau produit une transition de phase vers un état homogène avec un transport très efficace dans les deux directions. Dans la limite thermodynamique, une propriété de l'état stationnaire limite la longueur maximale des accumulations. La formation de voies peut être causée par des interactions entre particules. Néanmoins, ces mécanismes s'avèrent peu robustes face à une variation des paramètres du modèle. Dans presque tous les cas, la dynamique du réseau a un effet positif et bien plus important sur le transport que la formation de voies. Par conséquent, la dynamique du réseau semble un point-clé pour comprendre la régulation du transport intracellulaire. La dernière partie introduit un modèle pour la dynamique d'une microtubule sous l'action d'une protéine qui favorise les sauvetages. Des phénomènes intéressants de vieillissement apparaissent alors, et devraient être observables dans des expériences. / This thesis uses methods and models from non-equilibrium statistical physics to describe intracellular processes. Bidirectional microtubule-based transport within axons is modeled as a quasi-one-dimensional stochastic lattice gas with two particle species moving in opposite directions under mutual exclusion interaction. Generically occurring clusters of particles in current models for intracellular transport can be dissolved by additionally considering the dynamics of the transport lattice, i.e., the microtubule. An idealized model for the lattice dynamics is used to create a phase transition toward a homogenous state with efficient transport in both directions. In the thermodynamic limit, a steady state property of the dynamic lattice limits the maximal size of clusters. Lane formation mechanisms which are due to specific particle-particle interactions turn out to be very sensitive to the model assumptions. Furthermore, even if some particle-particle interaction is considered, taking the lattice dynamics into account almost always improves transport. Thus the lattice dynamics seems to be the key aspect in understanding how nature regulates intracellular traffic. The last part introduces a model for the dynamics of a microtubule which is limited in its growth by the cell boundary. The action of a rescue-enhancing protein which is added to the growing tip of a microtubule and then slowly dissociates leads to interesting aging effects which should be experimentally observable.

La protéine Tau joue un rôle essentiel dans les neurones, notamment par ses interactions avec les éléments du cytosquelette. Des études récentes ont également montré que Tau était impliquée dans la motilité des organelles le long des microtubules axonaux. Dans ce mémoire de Maîtrise, nous avons démontré par recouvrement sur gel une nouvelle interaction in vitro pour Tau avec la petite GTPase Rab5, qui est impliquée dans l’endocytose précoce. De plus, nous avons montré que Tau et Rab5 immuno-précipitaient sur une même population de vésicules in vivo. La sur-expression de Tau dans des neurones primaires de l’hippocampe nous a permis de montrer que Tau et Rab5 avaient une distribution similaire dans l’axone des neurones, suggérant un rôle de Tau dans l’ancrage des endosomes précoces sur les microtubules. Par contre, à la différence de ce qui a pu être observé dans certaines études, la sur-expression de Tau n’a pas inhibé le transport axonal des endosomes précoces. Enfin, nous avons montré que Tau interagissait préférentiellement avec la Rab5 active liée au GTP et des résultats préliminaires nous laissent penser que Tau serait un effecteur ou une GAP pour Rab5. Dans les tauopathies, la Tau devient hyperphosphorylée, décroche des microtubules axonaux et forme des agrégats dans le corps cellulaire du neurone. Ces modifications biochimiques et de localisation de la protéine Tau pourraient être la source d’une perte d’interaction de la Tau avec Rab5 et être responsable de certaines atteintes neurologiques observées dans les tauopathies. / Tau protein plays an essential role in neurons, in particular in its interactions with cytoskeletal elements. Recent studies have shown that Tau was also regulating organelles motility along axonal microtubules. In this work, using far-western blot, we have shown a new in vitro interaction for Tau with the small GTPase Rab5, a protein implicated in early endocytosis. Furthermore, we have shown that Tau and Rab5 were immuno-precipited on a same pool of vesicles in vivo. Over-expression of Tau in primary hippocampal neurons have shown that Tau and Rab5 have a similar distribution in axons, suggesting that Tau plays a role as an anchor protein for early endosomes onto microtubules. In contrast to what has been shown earlier in other studies, Tau did not blocked axonal transport of early endosomes. Finally, we have shown that Tau was interacting preferentially with the active form of Rab5 bound to GTP and preliminary results suggest that Tau would be an effector or a GAP for Rab5. In tauopathies, Tau become hyperphosphorylated, loose its affinity with axonal microtubules and form aggregates in the cell body of the neuron. This biochemicals modifications and relocalisation of Tau protein might be responsible for a loss of interaction between Tau and Rab5 and consequently of some of the neuropathological symptoms observed in tauopathies.

Das COP9-Signalosom (CSN) ist ein evolutionär konservierter Proteinkomplex. Er besteht aus acht Untereinheiten und wird als Paralog des Lid-Subkomplexes des 26S Proteasoms angesehen. Das CSN verfügt über diverse enzymatische Aktivitäten, die es zu einem regulatorischen Faktor des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) machen. Das UPS ist für den Abbau von einem Großteil der zellulären Proteine notwendig. Für die Proteolyse bestimmter Proteine werden diese mit einer Polyubiquitinkette markiert. Dies geschieht über eine Enzymkaskade von E1, E2s und E3-Ligasen, wobei die E3s die Substratspezifität bestimmen. Die Interaktion von E3s mit dem CSN ist für deren Assemblierung und Aktivität von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren bindet das CSN eine Vielzahl von proteasomalen Substraten und scheint deren Abbau direkt zu kontrollieren. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion des CSN mit dem Mikrotubuli-bindenden Protein EB1 nachgewiesen werden. EB1 wirkt präferentiell an den (+)-Enden von Mikrotubuli und fördert die Polymerisierung und Stabilität von Mikrotubulifilamenten. EB1 bindet über die Untereinheit CSN5 an das CSN. Die Interaktion von EB1 mit dem CSN findet im Centrosom statt und führt zur Phosphorylierung und Stabilisierung von EB1. Eine verminderte Bindung von EB1 an das CSN oder eine reduzierte Phosphorylierung von EB1 führt zu einem beschleunigten Abbau. Die Funktion der Interaktion zwischen EB1 und dem CSN wurde in CSN-siRNA-Zelllinien untersucht. Dazu wurden die Untereinheiten CSN1, 3 und 5 in HeLa-Zellen permanent herunterreguliert. Die siRNAs gegen CSN1 und 3 (siCSN1, siCSN3) führen zur Reduktion des gesamten CSN Komplexes, der Knockdown von CSN5 (siCSN5) nur zur Verminderung von CSN5. In allen drei Zelllinien ist der Abbau von EB1 beschleunigt, was auf eine verminderte Bindung an, bzw. Phosphorylierung durch das CSN zurückzuführen ist. Dies hat Konsequenzen für die Stabilität von Mikrotubulifilamenten in siCSN1- und siCSN3-Zellen. Diese zeigen eine erhöhte Sensibilität gegenüber Nocodazol, welches die Polymerisierung von Mikrotubuli inhibiert. Des Weiteren konnte ein durch Nocodazol ausgelöster Zellzyklusarrest durch die Überexpression von EB1 oder CSN1 in HeLa-Zellen überwunden werden. / The COP9 signalosome (CSN) is an evolutionary conserved protein complex. It consists out of eight subunits and is a paralogue to the lid subcomplex of the 26S proteasome. The CSN posesses several activities, supporting its function as a regulator of the Ubiquitin Proteasome System (UPS). The UPS mediates the degradation of the majority of the cellular proteins. Prior to degradation, a poly-ubiquitin chain is attached to the proteins. This process is catalyzed by a cascade of E1, E2s and E3-ligases. The CSN is a regulator of the E3-ligases, which determine substrate selectivity of the ubiquitination. The CSN also directly binds and thereby controls degradation of several proteasomal substrates. In the present study a direct interaction between the CSN and the microtubule binding protein EB1 is shown, which is mediated by the subunit CSN5. EB1 binds preferentially to the (+)-ends of microtubules and thereby promotes polymerisation rates and enhances the stability of microtubule filaments. The interaction between the CSN and EB1 is localized to the centrosome and results in EB1 phosphorylation and stabilization. A compromised binding of EB1 to the CSN results in an accelerated degradation. For functional studies of the CSN-EB1 interaction in HeLa cells, siRNA mediated knockdowns of CSN subunits were used. The subunits CSN1, CSN3 and CSN5 were knocked down permanently resulting in a faster proteolysis of EB1. This was a result of decreased amounts of CSN complex in cells with downregulated CSN1 and CSN3. The knockdown of CSN5 affects only subunit CSN5 levels causing a compromised binding of EB1 to the CSN complex. An increased sensitivity to the microtubule disrupting agent nocodazole was observed in the CSN1 and CSN3 knockdown cells. A cell cycle arrest induced in HeLa cells by nocodazole treatment was rescued by overexpression of EB1 or CSN1. The data presented in this study suggest a functional relationship of EB1 and the CSN resulting in a stabilization of microtubule filaments.