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Organização do fuso mitótico em células normais e tumorais: associação de drogas que atuam sobre os microtúbulos e a agressividade tumoral. / Mitotic spindle organization in normal and tumoral cells: interation of drug effects on microtubules and tumoral agressiveness.Lima, Beatriz Brandão Vaz de 26 November 2008 (has links)
Muitas evidências indicam que a tumorigênese em humanos é um processo com várias etapas. A progressão de um tumor em direção a malignidade ocorre de maneiras muito distintas entre os diferentes tipos de câncer. Entender os processos celulares que levam a tumorigênese é importante para se delinear tratamentos mais adequados contra os diversos tipos de câncer. Drogas antimitóticas (ou venenos de fuso) são utilizadas no tratamento de alguns cânceres, e entre eles está o câncer de mama. A ação dessas drogas reside sobre a mitose, e têm como alvo os fusos mitóticos, estruturas essenciais que dirigem o ciclo celular na divisão das células. Recentemente, pesquisadores têm delineado possíveis respostas da célula aos venenos de fuso, e essas respostas são dependentes da concentração da droga. Baixas concentrações de venenos de fuso provocam o aparecimento de populações celulares aneuplóides, que ocorrem quando a célula sai do bloqueio mitótico. O presente trabalho utilizou as drogas vincristina e paclitaxel sobre linhagens celulares de mama humana (células normais e tumorais) para pesquisar se as drogas são capazes de induzir células aneuplóides. Os resultados obtidos no presente trabalho indicam que baixa concentração de vincristina e paclitaxel pode induzir o aparecimento de população aneuplóide através de mitoses aberrantes. Os venenos de fuso induzem a formação de mitoses contendo múltiplos fusos mitóticos, e essas mitoses não ficam bloqueadas, dando origem a células aneuplóides. O papel da aneuploidia na tumorigênese não foi ainda estabelecido, mas indiferente da sua importância no desenvolvimento do tumor, encontrar maneiras de inibir sua formação ou de super induzir seu aparecimento podem ter implicações significativas para as terapias contra o câncer. / Several lines of evidence indicate that tumorigenesis in humans is a multistep process and that these steps reflect genetic alterations that drive the progressive transformation of normal cells into highly malignant derivatives. Understanding the cellular processes that lead to tumorigenesis is important to devise more appropriate treatments against various types of cancer. Antimitotic drugs are used in the treatment of some cancers, and among them is breast cancer. The action of these drugs lies on the mitotic spindles, essential structures that drive the cell cycle in the division of cells. Recently, researchers have outlined possible responses to the antimitotic drugs on cells, and these responses are dependent on the concentration of the drug. Low concentrations of drugs can cause the appearance of aneuploid population, which occur when a cell leaves the mitotic block. This study used the drug vincristine and paclitaxel on human breast cancer cell lines (normal and tumoral cells) to find if the drugs are capable of inducing cell aneuploidy. The results of this study indicate that low concentration of vincristine and paclitaxel can induce the emergence of aneuploidy population through aberrant mitosis. The drugs induce the formation of mitosis containing multiple mitotic spindles, resulting in aneuploidy population of cells. The role of aneuploidy in tumorigenesis has not yet been established, but indifferent to this is important find ways to inhibit its formation or the super-induce their appearance. These questions may have significant implications for therapies against cancer.
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Association of Pericentrin with the γ Tubulin Ring Complex: a DissertationZimmerman, Wendy Cherie 03 June 2004 (has links)
Pericentrin is a molecular scaffold protein. It anchors protein kinases, (PKB, (Purohit, personal communication), PKC, (Chen et al., 2004), PKA Diviani et al., 2000), the γ tubulin ring complex, (γ TuRC) (Zimmerman et al., 2004), and possibly dynein (Purohit et al., 1999) to the spindle pole. The γ TuRC is a ~ 2 MDa complex which binds the minus ends of microtubules and nucleates microtubules in vitro, (Zheng et al., 1995). Prior to this work, nothing was known about the association of the γTuRC with pericentrin. Herein I report the biochemical identification of a large protein complex in Xenopus extracts containing pericentrin, the γ TuRC, and other as yet unidentified proteins. Immunodepletion of γ tubulin results in co-depletion of pericentrin, indicating that virtually all the pericentrin in a Xenopus extract is associated with γ tubulin. However, pericentrin is not a member of the, γ TuRC, since isolated γ TuRCs do not contain pericentrin. The association of pericentrin with the γ TuRC is readily disrupted, resulting in two separable complexes, a small pericentrin containing complex of approximately 740 KDa and the the γ TuRC, 1.9 MDa in Xenopus. Co overexpression/ coimmunoprecipitation and yeast two hybrid studies demonstrate that pericentrin binds the γTuRC through interactions with both GCP2 and GCP3. When added to Xenopus mitotic extracts, the GCP2/3 binding domain uncoupled γ TuRCs from centrosomes, inhibited microtubule aster assembly and induced rapid disassembly of pre-assembled asters. All phenotypes were significantly reduced in a pericentrin mutant with diminished GCP2/3 binding, and were specific for mitotic centro somal asters as I observed little effect on interphase asters or on asters assembled by the Ran-mediated centrosome-independent pathway. Overexpression of the GCP2/3 binding domain of pericentrin in somatic cells perturbed mitotic astral microtubules and spindle bipolarity. Likewise pericentrin silencing by small interfering RNAs in somatic cells disrupted γ tubulin localization and spindle organization in mitosis but had no effect on γ tubulin localization or microtubule organization in interphase cells. Pericentrin silencing or overexpression induced G2/antephase arrest followed by apoptosis in many but not all cell types. I conclude that pericentrin anchoring of γ tubulin complexes at centrosomes in mitotic cells is required for proper spindle organization and that loss of this anchoring mechanism elicits a checkpoint response that prevents mitotic entry and triggers apoptotic cell death. Additionally, I provide functional and in vitro evidence to suggest that the larger pericentrin isoform (pericentrin B/ Kendrin) is not functionally homologous to pericentrin/pericentrin A in regard to it's interaction with the γ TuRC.
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The Role of DIAPH1 in the Megakaryopoiesis / Le rôle de DIAPH1 dans la mégacaryopoïèsePan, Jiajia 26 November 2014 (has links)
Les mégacaryocytes sont les précurseurs cellulaires hautement spécialisés qui produisent des plaquettes via des extensions cytoplasmiques appelées proplaquettes. La formation des proplaquettes exige de profonds changements dans l’organisation du cytosquelette: microtubules et actine. Les formines sont une famille de protéines hautement conservées chez les eucaryotes composées de plusieurs domaines qui régulent le remodelage et la dynamique du cytosquelette d'actine et des microtubules. La plupart des formines sont des effecteurs protéiques des Rho-GTPase. DIAPH1, un membre de la famille des formines, est un homologue chez les mammifères du gène diaphanous de la drosophile qui fonctionne comme un effecteur de la petite GTPase Rho et régule le cytosquelette d'actomyosine ainsi que les microtubules. Il contient le domaine de liaison à Rho (Rho-binding domain) dans la partie amino-terminale et deux régions distinctes d’homologie aux formines, FH1 localisée au centre de la protéine et FH2 dans la partie carboxy-terminale. DIAPH1 co-régule le cytosquelette des microtubules et d'actine à travers respectivement ses régions de FH2 et FH1. DIAPH1 est donc un gène candidat idéal dans toutes les fonctions cellulaires qui exigent une coopération entre cytosquelettes d’actine et de microtubules.L'objectif de ce projet de thèse était d’étudier le rôle de DIAPH1 dans la mégacaryopoïèse. A la fin de la maturation des mégacaryocytes, la formation de proplquettes et la migration sont associées à des modifications importantes de la structure du cytosquelette. Nous avons émis l’hypothèse que grâce à la sa double fonction dans la polymérisation de l'actine et la stabilisation des microtubules, DIAPH1 pourrait jouer un rôle essentiel dans les temps terminaux de la différenciation mégacaryocytaire.Nos résultats ont montré qu’au cours de la différenciation mégacaryocytaire, l’expression de DIAPH1 augmente, alors que celles de DIAPH2 et DIAPH3 diminuent, ce qui suggère que DIAPH1 pourrait jouer un rôle plus important que DIAPH2 et DIAPH3 dans les stades tardifs de la différenciation mégacaryocytaire. Les études en immunomarquage montrent que DIAPH1 co-localise avec l’actine F, la tubuline et la myosine IIa en niveau de la membrane plasmique et des proplaquettes. Nous avons étudié la fonction de DIAPH1 par des stratégies d’invalidation (knockdown) et de surexpression d’une forme active de DIAPH1. Les résultats montrent que DIAPH1 est un effecteur important de Rho, pour réguler négativement la formation des proplaquettes en remodelant le cytosquelette d’actine et les microtubules. Le travail antérieur de notre équipe avait montré que Rho-ROCK régulait aussi négativement la formation des proplaquettes, en inhibant l’activation de la myosine IIa. En inhibant simultanément DIAPH1 et ROCK/myosine, nous avons montré que ces deux voies jouent un rôle additif dans la formation des proplaquettes.Ces résultats suggèrent que la coopération entre les voies DIAPH1 et ROCK/myosine est nécessaire pour la formation de structures cellulaire dépendant de l'actomyosine, telles les fibres de stress et l'anneau contractile en agissant à la fois sur le remodelage du cytosquelette et en assurant un équilibre entre l'actomyosine et microtubules. / Megakaryocytes (MKs) are the highly specialized precursor cells that produce platelets via cytoplasm extensions called proplatelets. Proplatelet formation (PPF) requires profound changes in microtubule and actin organization. Formins are a family of highly conserved eukaryotic proteins with multidomains that govern dynamic remodeling of the actin and microtubule cytoskeletons. Most formins are Rho-GTPase effectors proteins. DIAPH1, a member of the formin family, is a mammalian homolog of Drosophila diaphanous gene that works as an effector of the small GTPase Rho and regulates the actomyosin cytoskeleton as well as microtubules. It contains the Rho-binding domain in the N-terminal and two distinct regions of formin homology, FH1 in the center and FH2 in the C-terminus. DIAPH coordinates microtubules and actin cytoskeleton through its FH2 and FH1 regions respectively, making DIAPH an ideal candidate in cell functions that depend closely on the cooperation between the actin and microtubule cytoskeletons.The objective of the project was to decipher the role of DIAPH1 in megakaryopoiesis. At the end of the MK maturation, PPF and MK migration are associated with profound changes in cytoskeleton organization. Due to its dual function in actin polymerization and microtubule stabilization, DIAPH1 was an obvious candidate to play an essential role in PPF and MK migration.Our results showed that DIAPH1 expression increased during MK differentiation, whereas DIAPH2 and DIAPH3 expression decreased, suggesting that DIAPH1 may play a more important role than DIAPH2 and DIAPH3 in the late stages of MK differentiation. Immunostaining showed that DIAPH1 co-localized with F-actin, tubulin and myosin IIa along the plasma membrane and proplatelet. Using a knockdown strategy with shRNA and expression of an active form of DIAPH1, we showed that DIAPH1 is an important effector of Rho that negatively regulates PPF by remodeling actin and microtubule cytoskeletons. A previous work of our team has shown that Rho-ROCK also negatively regulates in PPF by inhibiting myosin IIa activation. By the double inhibition of the DIAPH1 and the ROCK/Myosin pathway, we showed that DIAPH1 and ROCK played additive roles in the negative regulation of PPF. These observations suggest that the cooperation between DIAPH1 and ROCK is required for the formation of cell structures dependent on actomyosin, such as the stress fibers and the contractile ring. Collectively, these results strongly suggest that cooperation of DIAPH1/microtubules and ROCK/Myosin may regulate PPF by modifying the balance between actomyosin and microtubules.
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LKB1, gardien de la prolifération hépatocytaire et de l’intégrité génomique / LKB1, gatekeeper of hepatocyte proliferation and genomic integrityMaillet, Vanessa 28 November 2017 (has links)
La Liver Kinase B1 (LKB1) est une protéine pléiotrope, impliquée dans divers processus biologiques. Dans le foie, LKB1 est notamment connue pour être un régulateur clé du métabolisme et de la polarité cellulaire. Au cours de notre étude, nous avons investigué l’implication de LKB1 dans le contrôle de la prolifération des hépatocytes au cours du processus de régénération hépatique physiologique (hépatectomie partielle des 2/3). Nous avons démontré que la perte de Lkb1, spécifiquement dans les hépatocytes, favorise la récupération de la masse hépatique après hépatectomie partielle, en induisant une augmentation drastique de la réponse proliférative hépatocytaire, indépendamment de la balance métabolique/énergétique. Ainsi, LKB1 agit comme un senseur négatif de la prolifération et régule la transition G0/G1, en particulier en contrôlant la signalisation de l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Par ailleurs, plus tard pendant la régénération, LKB1 garantit également l’intégrité mitotique. En effet, la suppression de Lkb1 entraîne des altérations majeures de la formation du fuseau mitotique. Nos résultats établissent également que LKB1 contrôle la polarité de la division cellulaire, indépendamment de l'activité de l’AMPK (AMP-activated protein kinase), une cible clé de LKB1. Par conséquent, la perte de LKB1 conduit à une altération majeure du profil de ploïdie, au stade tardif du processus de régénération. L’ensemble de notre étude souligne le double rôle de LKB1, au cours de la régénération hépatique, en tant que gardien de la prolifération hépatocytaire et de l'intégrité génomique. / Liver Kinase B1 (LKB1) is involved in pleiotropic biological processes and known to be a key regulator of hepatic metabolism and polarity. Here, we investigated the contribution of LKB1 in hepatocyte proliferation and liver regeneration process. We demonstrated that loss of hepatic Lkb1 promotes liver mass recovery, through an increase of hepatocytes proliferation, independently on metabolic/energetic balance. LKB1 regulates G0/G1 progression, specifically by controlling Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) signaling. In addition, later during regeneration, LKB1 controls mitotic fidelity. Deletion of Lkb1 results in major alterations of mitotic spindle formation, along the polarity axis, independently of AMP- activated protein kinase (AMPK) activity, a key target of LKB1. Consequently, LKB1 deficiency leads to an alteration of ploidy profile, at late stage of regenerative process. Overall our study highlights the dual role of LKB1, during liver regeneration, as a guardian of hepatocyte proliferation and genomic integrity.
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Des microtubules détyrosinés : quelles conséquences pour la cellule?Caudron, Fabrice 20 March 2007 (has links) (PDF)
Les microtubules (MT) sont des structures dynamiques contrôlant divers aspects essentiels de l'architecture<br />cellulaire. En particulier, les bouts plus des MT (bouts +) sont capables d'accumuler des protéines spécifiques jouant un rôle dans le contrôle de la dynamique microtubulaire et dans l'interaction des MT avec le cortex cellulaire. Ces interactions sont notamment décisives pour le positionnement correct du fuseau mitotique. La description des mécanismes permettant l'accumulation de protéines aux bouts + est donc importante pour la compréhension des fonctions microtubulaires.<br />La tyrosine C-terminale de la tubuline α est cruciale pour l'interaction de protéines à domaine CAP-Gly avec les bouts +. En effet, CLIP-170 et son homologue de S.cerevisiae Bik1p se lient moins bien aux bouts + des MT dépourvus de tyrosine C-terminale (MT Glu).<br />Dans ce travail de thèse, nous avons étudié les perturbations associées au déficit de liaison de Bik1p aux bouts + des MT Glu dans S. cerevisiae.<br />Les modèles actuels proposent que Bik1p est amenée aux bouts + par son association avec la kinésine Kip2p. La dynéine (Dyn1p) est alors recrutée par Bik1p aux bouts + pour être ciblée vers le cortex. Nous montrons<br />que, dans des levures n'exprimant que de la tubuline détyrosinée (souche tub1-Glu), Kip2p et Dyn1p sont<br />correctement associées aux bouts +, malgré le déficit de liaison de Bik1p. Nous proposons que, dans les cellules<br />sauvages, le complexe Kip2p/Bik1p transporte Dyn1p le long des MT vers les bouts +. Kip2, Bik1p et Dyn1p<br />s'associent alors aux bouts + de façon indépendante.<br />De plus, nous montrons que des formes constitutionnellement actives de la petite protéine G Rho1p favorisent l'association de Bik1p avec les bouts +. Ces données seront importantes pour comprendre le rôle des Rho GTPases dans la régulation des MT, notamment dans la migration cellulaire.<br />L'ensemble de ce travail suggère de nouveaux modèles pour la formation et la fonction des complexes protéiques associés aux bouts +.<br />Finalement, nous avons recherché de manière systématique les mutations qui, associées avec la mutation tub1-Glu, sont létales chez la levure (létalité synthétique). Ce crible a identifié des composants participant à la formation de la membrane et de la paroi cellulaire. Ces gènes pourraient être impliqués, au niveau cortical, dans la mise en place des interactions des microtubules avec le cortex, et montrent l'importance de la tyrosine C-terminale de la tubuline α dans cette fonction.
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contrôle de la polarité des cellules adhérentesThéry, Manuel 24 January 2006 (has links) (PDF)
Les travaux effectués au cours de cette thèse et présentés dans ce manuscrit consistent en l'utilisation de micro-patrons adhésifs pour l'étude de l'organisation spatiale des organites intracellulaires. Nous avions comme modèle de travail la compartimentation et la polarisation des cellules au sein des tissus. Dans cette situation, les cellules n'adhèrent pas de façon homogène et isotrope à leur environnement. Au contraire, elles s'attachent à leur voisines et à la matrice extracellulaire, en des endroits particuliers, grâce à des complexes transmembranaires, les adhésions. Ces adhésions sont une des bases structurales de la construction du cytosquelette. Leur distribution spatiale peut être anisotrope, et parfois asymétrique, ce qui guide la polarité intrinsèque des cellules. <br />Nous avons utilisé la technique d'impression par micro-contact pour manipuler la forme des cellules et la distribution de leurs adhésions. Les cellules adoptent l'enveloppe convexe du patron adhésif quelle que soit sa géométrie. Si, par exemple, les cellules sont contraintes de s'attacher à un T ou un V, sans pouvoir établir de contact en dehors de ce patron, elles adopteront dans les deux cas la même forme triangulaire. Nous avons utilisé cette propriété pour imposer aux cellules des formes identiques sur des patrons adhésifs différents afin d'analyser le rôle spécifique de la distribution des adhésions sur l'organisation du cytosquelette et des compartiments intracellulaires.<br /> Nos mesures montrent que les cellules développent des tensions élevées dans les filaments d'actine, assemblés en fibres de stress, au-dessus des zones non adhésives. Sur les zones adhésives, la tension est plus faible, et la polymérisation de l'actine en un réseau branché induit la formation de protrusions membranaires. La localisation des protrusions est donc complémentaire de celle des zones contractiles.<br />Cette polarisation du système actine dirige le recrutement de certaines protéines dont l'activité influence la dynamique des microtubules. La croissance des microtubules en contact avec le cortex cellulaire est modulée différemment selon que l'actine forme des fibres de stress ou un réseau branché. Cependant, quel que soit le comportement des extrémités du réseau de microtubules à la périphérie, le centre du réseau, le centrosome, se maintient toujours au centre de la cellule. Le noyau est exclu de ce centre et se positionne vers les zones de contraction. Ainsi, à l'intérieur de la cellule, l'orientation de l'axe noyau-centrosome répond à l'asymétrie établie en périphérie.<br />La polarité du cortex est conservée pendant la division cellulaire ou mitose. Le corps cellulaire, qui s'est arrondi à l'entrée en mitose, est maintenu en contact avec le substrat adhésif par des fibres de rétraction riches en actine. Les mesures expérimentales de l'orientation des divisions, sur différents patrons adhésifs, révèlent que la distribution spatiale des ancrages de ces fibres sur la cellule guide l'orientation du fuseau mitotique, et par conséquent, le plan de division des cellules. En effet, les pôles du fuseau se positionnent en face des zones corticales où sont arrimées les fibres de rétraction, indépendamment de la forme qu'avait la cellule avant l'entrée en mitose. <br /> Il existe des moteurs moléculaires ancrés dans le cortex des cellules et capables de tirer sur les microtubules astraux émanant des pôles du fuseau. En faisant l'hypothèse que ces moteurs ne sont activés que dans les zones où se situent les fibres de rétraction, on peut établir un modèle physique permettant de rendre compte de toutes les observations expérimentales effectuées.
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controle de la transition meiose I/meiose II et role de DOC1R au cours de l'arret CSF lors de la maturation meiotique chez la sourisTerret, Marie-Emilie 02 July 2004 (has links) (PDF)
La maturation méiotique des vertébrés diffère de la mitose par plusieurs aspects. J'ai étudié deux de ces particularités. 1) En méiose I, les chromosomes homologues sont ségrégés, en mitose, les chromatides sœurs sont séparées. En mitose, un mécanisme de contrôle bloque la cellule en métaphase en inhibant l'APC/C tant que tous les chromosomes ne sont pas correctement alignés sur le fuseau. En méiose I, des résultats contradictoires existent selon les espèces quant à l'existence d'un mécanisme de contrôle de ce type. J'ai montré que l'activité séparase (activité indirectement régulée par l'APC/C) est requise pour effectuer la transition métaphase/anaphase en méiose I, suggérant qu'un mécanisme de contrôle de ce type est requis chez la souris, organisme proche de l'homme. 2) A l'issue de la maturation méiotique, l'ovocyte reste bloqué en métaphase de méiose II en attendant la fécondation, alors que la mitose s'achève toujours. Ce blocage est dû à l'activité CSF et requiert la voie Mos/.../MAPK. J'ai montré que DOC1R, un nouveau substrat des MAPK, contrôle l'organisation des microtubules au cours de l'arrêt CSF. Ces résultats font évoluer la vision de l'arrêt CSF qui était considéré comme une voie linéaire aboutissant à la stabilisation du MPF. L'arrêt CSF est une voie non linéaire contrôlant aussi la morphologie de l'ovocyte.
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Towards an Understanding of Zebrafish Epiboly: The Characterization of the Epiboly Initiation Mutant Eomesodermin ADu, Susan 31 December 2010 (has links)
How cell movements are coordinated during
morphogenesis is not well understood. We focus on epiboly, which describes the thinning and spreading of a multilayered cell sheet. The first phase of epiboly involves the doming of the yolk
cell up into the overlying blastoderm. We previously showed that over-expression of a dominant– negative eomesodermin a construct inhibits doming. Here I report my analysis of embryos lacking both maternal and zygotic Eomesodermin A (MZeomesa). eomesafh105 mutant embryos (1) exhibit a doming delay, (2) have defective yolk cell microtubules, (3) have tightly packed deep cells with more bleb – like protrusions and (4) express early endoderm markers abnormally.
Despite these phenotypes, the majority of MZeomesa embryos are able to complete epiboly and form endodermal derivatives. In both Xenopus and mice, Eomesodermin has also been implicated in the regulation of gastrulation movements and cell fate specification, suggesting a
conserved role for Eomesodermin throughout vertebrate development.
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Towards an Understanding of Zebrafish Epiboly: The Characterization of the Epiboly Initiation Mutant Eomesodermin ADu, Susan 31 December 2010 (has links)
How cell movements are coordinated during
morphogenesis is not well understood. We focus on epiboly, which describes the thinning and spreading of a multilayered cell sheet. The first phase of epiboly involves the doming of the yolk
cell up into the overlying blastoderm. We previously showed that over-expression of a dominant– negative eomesodermin a construct inhibits doming. Here I report my analysis of embryos lacking both maternal and zygotic Eomesodermin A (MZeomesa). eomesafh105 mutant embryos (1) exhibit a doming delay, (2) have defective yolk cell microtubules, (3) have tightly packed deep cells with more bleb – like protrusions and (4) express early endoderm markers abnormally.
Despite these phenotypes, the majority of MZeomesa embryos are able to complete epiboly and form endodermal derivatives. In both Xenopus and mice, Eomesodermin has also been implicated in the regulation of gastrulation movements and cell fate specification, suggesting a
conserved role for Eomesodermin throughout vertebrate development.
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Defining the Role of Rubella Virus Nonstructural Proteins in Replication Complex Assembly and Fiber FormationMatthews, Jason D 30 March 2010 (has links)
Rubella virus (RUBV) is a positive-strand RNA virus and the causative agent of rubella and congenital rubella syndrome in humans. To replicate its RNA, RUBV forms membrane-associated spherules, called replication complexes (RCs), the induction of which requires the two virus nonstructural proteins (NSPs), P150 and P90. Interestingly, late in infection the NSPs form a unique cytoplasmic fiber network, similar in appearance to microtubules, the function of which is unknown. Little is known about the roles of the RUBV NSPs in forming these structures and, to this end, we scrutinized the behavior and biochemical properties of the NSPs, both after expression from plasmids and during RUBV infection, using mutagenic, biochemical and pharmacological approaches. The following findings were made: First, the precursor from which P150 and P90 are produced via an embedded protease at the C-terminus of P150, called P200, was required for initial targeting to cytoplasmic foci. P150 was the determinant of fiber formation and while P90 had no specific targeting sequences on its own, P90 sequences within P200 were required for correct targeting of P200. An alpha-helix at the N-terminus of P150 was also important for correct targeting of P200, putatively by mediating the interaction between P150 and P90 within the precursor. Second, the membrane binding domain within the NSPs was within the N-terminal ~450 amino acids of P150. P150 is in an exceptionally tight association with membranes. Third, both the N- and C-terminal regions of P150, and specifically long alpha-helices within these regions, are necessary for fiber formation. Fiber formation relied on an intact microtubule network, but neither microtubule repositioning nor dynamic movement along microtubules was required. Additionally, it was shown that microtubules were not necessary in RUBV replication. Finally, P150 fibers were not required for RUBV replication; however, it was shown that the fibers are likely important in formation of cytoplasmic extensions through which a novel system of cell-to-cell transport of viral RNA in the absence of virus particles appears to occur.
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