Uma das razões que fazem de Saccharomyces cerevisiae um organismo modelo é o grau de conservação dos mecanismos celulares que existe entre esta levedura e eucariotos superiores. Porém, mesmo após 21 anos do seqüenciamento do seu genoma, ainda existem mais de 600 ORFs com função desconhecida. Neste trabalho, selecionamos quatro delas para o estudo detalhado. MRPL34 (YDR115w) está presente na subunidade maior do ribossomo mitocondrial de levedura e apresenta similaridade com o gene L34 de E. coli e MRP-L34 de humanos. O mutante Δmrpl34 apresenta DNA mitocondrial (mtDNA) instável e para estudá-lo foram gerados alelos sensíveis à temperatura (ts). Com os ensaios de síntese protéica mitocondrial in vivo foi possível identificar clara diminuição da síntese de proteínas do mutante condicional. Mrpl34p foi identificada no extrato ribossomal, conforme esperado. A desestruturação da subunidade maior do ribossomo mitocondrial, utilizando os mutantes ts, nos forneceu indícios sobre intermediários existentes no seu processo de montagem. Verificamos que a porção N-terminal da proteína é responsável pelo endereçamento à mitocôndria. YPR116w também apresenta alta instabilidade do DNA mitocondrial, desta forma, mutantes termossensíveis foram utilizados nos experimentos. Uma das estratégias utilizadas visou a busca de parceiros genéticos. Verificamos que ylr091wp aumenta a estabilidade do mtDNA de ts- ypr116w, sugerindo atividade supressora. Também averiguamos que o alelo ts-ypr16w apresenta menor quantidade de tRNA mitocondrial, através de ensaios de Northen blot. Duas das ORFs escolhidas (YDL119c e YOR022c) tiveram sua caracterização inicial publicada em 2016, refletindo a importância deste tipo de pesquisa. Vimos que a proteína codificada por YDL119c está localizada na membrana interna da mitocôndria e que o mutante Δyor022c apresenta quantidades reduzidas de cardiolipina, quando crescido à 37ºC. / One of the reasons that turn Saccharomyces cerevisiae a model organism is the degree of conservation of cellular mechanisms that exist between this yeast and higher eukaryotes. However, even after 21 years of sequencing their genome, there are still more than 600 ORFs with unknown function. In this work, we selected four of them for the detailed study. MRPL34 (YDR115w) is present in the major subunit of the yeast mitochondrial ribosome and bears similarity to the L34 gene of E. coli and MRP-L34 from humans. The Δ mrpl34 mutant shows unstable mitochondrial DNA (mtDNA) and to study it, temperature sensitive alleles (ts) were generated. With the mitochondrial protein synthesis assays in vivo, it was possible to identify a clear decrease in the protein synthesis of the conditional mutant. Mrpl34p was identified in the ribosomal extract as expected. The disassembly of the major subunit of the mitochondrial ribosome, using the ts mutants, provided us some clues about intermediates in its assembly process. We have verified that the N-terminal portion of the protein is responsible for addressing the mitochondria. YPR116w also shows high mitochondrial DNA instability, in this way, thermosensitive mutants were used in the experiments. One of the strategies used was the search for genetic partners. We verified that ylr091wp increases the stability of ts-ypr116w mtDNA, suggesting suppressor activity. We also found that the ts-ypr16w allele has a smaller amount of mitochondrial tRNA, through Northen blot assays. Two of the chosen ORFs (YDL119c and YOR022c) had their initial characterization published in 2016, reflecting the importance of this type of research. We have seen that the protein encoded by YDL119c is located on the inner membrane of the mitochondria and that the Δyor022c mutant presents reduced amounts of cardiolipin when grown at 37 ºC.

Orientador: Carlos Camargo Alberts / Resumo: A filogenia dos psitacídeos ainda é algo de muita divergência entre os taxonomistas. Embora sejam muito diversificados morfologicamente, principalmente em suas cores, os psitacídeos constituem um grupo muito homogêneo, gerando muitas contradições e controvérsias em sua classificação. Este trabalho buscou utilizar duas fontes de dados para um estudo filogenético, sendo elas: comportamento de auto limpeza e a análise de DNA mitocondrial. Para o estudo, foram selecionadas 17 espécies (Amazona aestiva, Amazona brasiliensis, Amazona farinosa, Amazona rhodocorytha, Amazona vinacea, Aratinga solstitialis, Diopsitaca nobilis, Eos bornea, Eupsittula aurea, Guaruba guarouba, Pionopsita pileata, Pionus maximiliani, Pionus menstruus, Primolius maracanã, Psittacara leucophthalmus, Pyrrhura frontalis e Pyrrhura perlata). O estudo do comportamento de auto limpeza se deu através de observações e registros videográficos no Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros, em Sorocaba – SP. A análise de DNA mitocondrial foi feita através de dados obtidos no “GenBank”. Resultados da análise comportamental apontam congruência entre a filogenia obtida e outros estudos filogenéticos moleculares e morfológicos, evidenciando que analises filogenéticas através do comportamento podem ser uma fonte de dados viável. Enquanto a filogenia resultante da análise de máxima verossimilhança das sequências de DNA mitocondrial 12S e 16S apontam que com dados obtidos no GenBank podemos realizar uma reconstrução fil... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

As abelhas da tribo Meliponini (abelhas sem ferrão) estão amplamente distribuídas pelas regiões tropicais do planeta, tendo um importante papel na polinização, sendo o gênero Melipona o que contém o maior número de espécies. A espécie Melipona marginata é uma das menores e mais ancestrais do grupo, e a exemplo de outras espécies nidifica em ocos de árvore. M. marginata, assim como outras espécies do gênero Melipona, vêm sofrendo com a destruição do seu ambiente natural, pelo desmatamento, sendo, aparentemente mais exigente que outras espécies quanto ao tamanho do fragmento florestal para se manter, devido a isso é encontrada apenas em fragmentos maiores, mais antigos e menos perturbados. Tendo em vista a perda de hábitat e o pouco conhecimento da biologia dessa espécie, este trabalho pretende analisar populações de M. marginata, através da técnica PCR+RFLP do DNA mitocondrial e marcadores microssatélites, visando contribuir para entendimento da estrutura populacional de M. marginata. Foram analisados 54 ninhos, provenientes dos estados de MG, SP, PR, SC e RS. Oito regiões do DNA mitocondrial foram amplificadas, e posteriormente digeridas com 12 enzimas de restrição. Foram detectados 14 haplótipos, sendo apenas um compartilhado. A população de SP apresentou o maior número de haplótipos. Os testes estatísticos demonstraram que as populações estão estruturadas e isoladas, não havendo fluxo gênico entre as populações. Já nas análises dos microssatélites foram analisados 4 locos, apresentando alta variabilidade genética, onde também foi verificado que as populações se encontram estruturadas. Os resultados obtidos podem ser explicados principalmente pela redução da área de floresta, mas, podem se dever a eventos antigos em conseqüência de mudanças climáticas ocorridas durante as últimas glaciações. / The tribe Meliponini (stingless bees) is present in all tropical regions of the world and has an important role in pollination. The genus Melipona has the highest number of species in the tribe. The specie Melipona marginata is considered the most ancestral within the genus, and like other species builds the nests in hollow of trees. Unfortunately several bee species have suffered with the devastation of their natural environment. M. marginata seems to be very dependent on the size of the forest fragment, being found only in the biggest, oldest and consequently more preserved ones. In view of the habitat loss and few biological knowledge about this specie, this research intended to analyse M. marginata populations molecularly, through mitochondrial DNA PCR-RFLP and microsatellite data., Fifty four colonies were analyzed, from MG, SP, PR, SC and RS states. Eight mitochondrial DNA regions were amplified and screened with 12 restriction enzymes. Fourteen haplotypes were verified and among them just one was shared. SP population showed the highest number of haplotypes. Statistic tests showed that the 5 populations were genetic structured and isolated, therefore not presenting gene flow. The 4 microsatellites loci analyzed showed high genetic variability. The statistics analysis indicated that the 5 populations are structure and isolated. These results can be explained mainly because the decrease of forest leading to population isolation, however we can not discard the hypothesis that this current scenario is a consequence of climatic changes occurred during the last glaciations.

As mitocôndrias são os principais locais de geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), que são produzidos como subprodutos da cadeia de transporte de elétrons. O ferro livre e as ERO podem se envolver em processos potencialmente nocivos, sendo que a desregulação do metabolismo do ferro nessa organela tem sido associada a várias doenças, como a Ataxia de Friedreich (FA). O transporte seletivo de quelantes de ferro a esta organela é proposto como um meio de melhorar sintomas de FA. A desferrioxamina (DFO) é um sideróforo bacteriano com grande afinidade ao ferro, mas baixa penetração celular. Já os peptídeos altamente catiônicos TAT49-57 (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg), 1A (Fx-Arg-Fx-Lys-Fx-Arg-Fx -Lys), SS02 (Dmt-(D)-Arg-Phe-Lys) e SS20 (Phe-(D)-Arg-Phe-Lys) são conhecidos por permear as membranas citossólicas e mitocondriais. Nós preparamos conjugados de DFO com peptídeos que penetram as mitocôndrias e estudamos suas características de ligação ao ferro in vitro. Eles foram preparados e conjugados em fase sólida com DFO (produzindo quatro mtDFO), que em seguida foram purificados e caracterizados por meio de LC/MS e análise de aminoácidos. Os mtDFO de alta pureza exibiram capacidade de ligação de ferro idêntica à do quelante livre DFO. Os mtDFO também foram capazes de suprimir a oxidação catalisada pelo sistema ferro-ascorbato. A fim de avaliar a localização intracelular dos mtDFO, estes foram marcados com TAMRA (mtDFO-TAMRA). Frente a uma linhagem de carcinoma de ovario, os mtDFO foram em geral pouco tóxicos e altamente localizados nas mitocôndrias. Não foram observados níveis expressivos de danos a DNA, indução de apoptose, geração de ERO na mitocôndria, arraste de ciclo celular ou de apoptose. Resultados preliminares da aplicação dos mtDFO a cardiomiócitos murínicos com baixo nível de frataxina (modelo de FA) indicam um restabelecimento de aproximadamente 60% na morfologia mitocondrial, o que pode ser interpretado como uma melhora nas funções dessa organela. Estes resultados indicam que os mtDFO produzidos podem ser uma parte importante no arsenal terapêutico para FA. / Mitochondria are the main site for the generation of reactive oxygen species (ROS) as sub products of electron transport chain. Free iron and ROS may interact to generate potentially harmful species, and iron homeostasis in this organelle has been linked to several diseases, such as Friedreich Ataxia (FA). Selective targeting of iron chelators to mitochondria has been proposed as a means of alleviating FA symptoms. Desferrioxamine (DFO) is a bacterial siderophore with high affinity for iron, however low cell penetration. Highly charged peptides TAT49-57 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg), 1A (Fx-Arg-Fx-Lys-Fx-Arg-Fx -Lys), SS02 (Dmt-(D)-Arg-Phe-Lys) and SS20 (Phe-(D)-Arg-Phe-Lys) are known as both cell- and mitochondria-permeant. We prepared conjugates of DFO with mitochondria-penetrating peptides and studied their iron binding characteristics in vitro. They were prepared in solid phase and conjugated to DFO (generating four mtDFO), which were then purified and characterized by LC/MS and Amino acid analysis. MtDFO exhibited iron binding ability identical to free DFO. The mtDFO of high purity were also able to quench the oxidation catalyzed by the iron-ascorbate system. Cell localization studies were performed by tagging mtDFO with TAMRA. In A2780 cells, mtDFO displayed in general low toxicity and high levels of mitochondrial location. No expressive levels of DNA damage, apoptosis, mitochondrial ERO generation or cell cycle arresting were observed. Preliminary results of the application of mtDFO on mouse cardiomiocytes with low levels of frataxin (animal model of FA) indicate a recovery of ca. 60% of mitochondrial morphology. This is interpreted as an improvement of the functions of the organelle. These results indicate that mtDFO may be important allies in the therapy of FA.

A subfamília Palaemoninae é um táxon bastante diverso, com alta variabilidade nas formas e estruturas de seus representantes. A grande diversidade de habitats e diferentes estratégias reprodutivas e comportamentais que esses crustáceos apresentam se reflete na sua elevada diversidade morfológica. O uso de ferramentas moleculares pode auxiliar em questões sobre a taxonomia, descendência e relações de parentesco para algumas espécies desse gênero, contribuindo pra a melhor compreensão de suas histórias evolutivas. Para a espécie Palaemon argentinus o uso de marcadores mitocondriais possibilitou a análise da homogeneidade genética da espécie, condizente com a hipótese de ocupação recente em ambientes dulcícolas. Complementarmente, foi demonstrada uma forte correspondência entre a estrutura populacional de P. argentinus e os eventos glaciais que moldaram a região de abrangência da espécie. Além disso, foram desenhados “primers” específicos para regiões microssatélites de P. argentinus que poderão ser utilizados em estudos futuros a respeito dos eventos que moldaram a história evolutiva recente desses camarões. A aplicação de ferramentas moleculares também resulta em importantes contribuições para o conhecimento sobre a evolução de Macrobrachium potiuna, para a qual foi verificado que a variação genética intraespecífica pode ser resultante de estruturação geográfica devido ao isolamento pela distância e às especializações de habitat, corroborando para a existência de espécies crípticas dentro de um grande “pool” de variação genética nesse grupo com taxonomia confusa.

Há algum tempo dados genéticos vêm sendo utilizados para inferências quanto à natureza do tráfico de escravos ocorrido no período colonial no Atlântico Sul e sobre a origem dos africanos que chegaram ao Brasil. A utilização de marcadores de linhagem mais específicos, como é o caso do DNA mitocondrial (mtDNA) e da região não-recombinante do cromossomo Y (NRY) pode se constituir em poderoso instrumento para o esclarecimento dessas questões. Este trabalho utilizou esses enfoques através do seqüenciamento da HVS-I do mtDNA (highly variable segment I) e de testes em 30 SNPs (single nucleotide polymorphisms) localizados na região não-recombinante do cromossomo Y, em uma amostra de 133 indivíduos classificados como derivados de africanos (preto e pardo) do estado do Rio Grande do Sul (Porto Alegre e região metropolitana), bem como 144 homens classificados do mesmo modo no estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro e região metropolitana). Os dados do mtDNA indicaram que 89,5% e 78% das matrilinhagens encontradas, respectivamente, no Rio de Janeiro e em Porto Alegre eram de origem africana. Destas, 69% e 82% eram de origem da África Centro-oeste (região típica de povos que falam línguas Bantus), enquanto que a fração complementar teria uma origem no Oeste africano (não-Bantu). Estes resultados estão de acordo com os registros históricos. Os marcadores do cromossomo Y revelaram que 56% (Rio de Janeiro) e 36% (Porto Alegre) destes cromossomos tinham uma origem africana. No entanto, diferentemente do que aconteceu com o mtDNA, as análises não permitiram discriminar os locais de origem dentro do continente africano. Parece, portanto, haver maior estruturação nos dados obtidos com o mtDNA do que com o cromossomo Y, sugerindo uma maior taxa de migração dos homens do que das mulheres dentro do grande tronco lingüístico Niger-Congo. Porto Alegre e Rio de Janeiro quando comparadas em relação ao mtDNA, não apresentam diferenciação significativa, embora pudessem ser observadas algumas diferenças, em destaque a maior presença de linhagens mitocondriais de origem ameríndia em Porto Alegre (16,4%) do que no Rio de Janeiro (8,5%). Já a diferença entre Porto Alegre e o Rio de Janeiro foi significativa quanto aos dados do cromossomo Y. Especialmente notável, é a presença de cromossomos de origem indígena em Porto Alegre: haplogrupos Q* e Q3*, nas freqüências de 3,5% e 1,7%, respectivamente. Analisando somente os indivíduos tipados tanto para o mtDNA quanto para os marcadores do Y, nota-se que ~ 50% deles nas duas amostras apresentam linhagens mitocondriais e do cromossomo Y de origem africana, enquanto de forma complementar, o número de indivíduos com matrilinhagens africanas e cromossomos Y europeus e/ou asiáticos ou ameríndios foi de ~ 41% e ~ 35% para o Rio de Janeiro e Porto Alegre, respectivamente. As amostras estudadas, portanto, caracterizam-se como sendo amplamente mescladas, apenas metade dos genomas considerados sendo de origem completamente africana. / Genetic data have been used for some time now for inferences about the nature of the slave trade that occurred in South Atlantic in the Colonial Period, as well as about the origins of the Africans who arrived in Brazil. The use of lineage-specific markers, like mitochondrial DNA (mtDNA) and those of the non-recombining region of the Y chromosome (NRY), can constitute a powerful tool for elucidation of these questions. This work utilized this approach through sequencing of the mtDNA HVS-I (highly variable segment I), as well by testing 30 SNPs (single nucleotide polymorphisms) located in chromosome Y’s nonrecombining region in a sample of 133 individuals classified as African-derived (black or mulatto) from the state of Rio Grande do Sul (Porto Alegre and metropolitan region), as well as 144 men classified in the same manner in the state of Rio de Janeiro (Rio de Janeiro and metropolitan region). The mtDNA data indicated that 89.5% and 78% of the matrilineages found in Rio de Janeiro and Porto Alegre were of African origin. Of these, respectively, 69% and 82% were of Central-West African origin (region typically of people who speak Bantu languages), while the complementary fraction would have the West African origin (non-Bantu). These results are in accordance with the historical records. The Y chromosome markers revealed that 56% (Rio de Janeiro) and 36% (Porto Alegre) of these chromosomes should have an African origin. But differently of what occurred with the mtDNA results, the analyses did not allow a discrimination of the places of their origin within the African continent. It seems, therefore, that a higher structuration occurs in the mtDNA data as compared to the Y chromosome results, suggesting a higher male in relation to female migration rates within the large Niger-Congo linguistic family. Porto Alegre and Rio de Janeiro do not present significant mtDNA frequency differences, although the Amerindian mtDNA presence is higher in Porto Alegre (16.4%) than Rio de Janeiro (8.5%). On the other hand, Porto Alegre and Rio de Janeiro do show significant differences in the Y chromosome data. Especially notable is the presence of Amerindian chromosomes in Porto Alegre: frequencies of, respectively, 3.5% and 1.7% for haplogroups Q* and Q3*. Considering just the individuals simultaneously typed for mtDNA and the Y chromosome, it is verified that ~50% of then show mtDNA and Y chromosome lineages of African origin, while the number of individuals with African mtDNA but European and/or Asiatic or Amerindian lineages was ~41% for Rio de Janeiro and ~35% for Porto Alegre. The samples studied, therefore, can be characterized as amply admixed, only half of the genomes considered being completely of African origin.

O padrão filogeográfico do lagarto teídeo Cnemidophorus vacariensis, endêmico dos Campos de Cima da Serra do sul do Brasil, foi estudado com a análise de dois segmentos de DNA mitocondrial (12S e 16S) e caracteres morfológicos. Através de métodos de máxima parcimônia, máxima verossimilhança e bayesianos, ambos marcadores moleculares demonstraram, concordantemente, a presença de diferenciação genética entre os clados do Rio Grande do Sul (RS), Santa Catarina (SC) e Paraná (PR). A existência de fluxo gênico foi registrada entre as linhagens do RS e SC, enquanto a população do PR está isolada das demais por, no mínimo, 300 quilômetros. Morfologicamente, a população proveniente do PR exibiu uma tendência de discriminação em três caracteres, enquanto os clados do RS e SC não apresentaram diferenças. Foi possível correlacionar, em parte, os resultados das análises molecular e morfológica, indicando concordância entre as duas abordagens. Os haplótipos exclusivos encontrados sugerem que as populações de C. vacariensis vivenciaram uma história evolutiva de isolamento, o que provavelmente ocorreu no Pleistoceno, quando pulsos de retração e expansão dos biomas abertos se alternavam, exibindo uma dinâmica que pode ter fragmentado por diversas vezes as regiões campestres que este lagarto habitava. Os principais distúrbios que os Campos de Cima da Serra enfrentam atualmente são as queimadas, a pecuária e a silvicultura de espécies exóticas, ameaças que tornam urgentes a definição de estratégias de conservação da região e sua biota. Os lagartinhos-pintados (Cnemidophorus vacariensis) ocorrem em afloramentos rochosos pouco extensos e se deslocam pouco, de modo que Unidades de Conservação de pequeno tamanho poderiam ser efetivas para a sua conservação. Porém, é importante considerar que cada linhagem evolutiva possui um potencial genético distinto das demais e todas devem ser conservadas.

A fenilcetonúria (PKU) é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de fenilalanina (Phe) e seus metabólitos nos tecidos dos pacientes afetados. O dano neurológico é a marca da PKU e a Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. A alanina (Ala) é nutricionalmente um aminoácido não essencial. Ela é o principal aminoácido gliconeogênico porque pode originar piruvato e glicose, tendo sido, por este motivo, usada como um suplemento dietético em combinação com o hormônio de crescimento no tratamento de crianças subnutridas afetadas por algumas doenças metabólicas herdadas, para induzir o anabolismo. O principal objetivo do presente trabalho foi medir as atividades dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CCR) e succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral de ratos Wistar sujeitos à hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida e à administração crônica de Ala, desde o 6± até o 21± dia de vida pós-natal. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e Ala nas atividades da SDH e CCR em córtex cerebral de ratos de 22 dias de idade. Os resultados mostraram uma redução nas atividades da SDH e complexos I + III no córtex cerebral de ratos sujeitos à HPA e também no córtex cerebral de ratos sujeitos à administração de Ala. Também verificamos que ambos: Phe e Ala inibiram in vitro a atividade dos complexos I + III por competição com NADH. Considerando a importância da SDH e CCR para a sustentação do suprimento energético para o cérebro, nossos resultados sugerem que o déficit energético possa contribuir para a neurotoxicidade da Phe em PKU. Em relação à Ala, ficou evidenciado que mais investigações serão necessárias antes de considerar a suplementação com Ala como uma terapia adjuvante válida para crianças com estas doenças.

A origem geográfica e rotas de dispersão dos dois mais importantes parasitas da malária humana, Plasmodium falciparum e P. vivax, continuam controversos. Para entender a história evolutiva destes parasitos propomos neste projeto inferir as vias e as datas de introdução de P. vivax e P. falciparum nas Américas, com base na análise do genoma mitocondrial completo de parasitos coletados em todas as regiões endêmicas, além de analisar a existência da relação genética entre os isolados de P. vivax e P. simium e inferir a possível transmissão lateral. O alinhamento de 941 sequências de P. vivax e 1795 de P. falciparum permitiram agrupar os isolados em quatro regiões distintas. As rotas migratórias de P. vivax sugere que o continente americano foi colonizado em diferentes momentos e por parasitos de diferentes regiões África, Sul da Ásia e Melanésia, explicando a alta diversidade genética existente neste continente, enquanto que P. falciparum foi introduzido nas Américas por duas regiões distintas, África e Sudeste Ásiático. Já os 10 isolados de P. simium sequenciado neste estudo apresentaram uma menor diversidade genética quando comparado com os isolados de P. vivax, sugerindo que a direção da transmissão lateral foi de humanos para macacos. / The geographical origin and dispersal routes of the two most important human malaria parasites, Plasmodium falciparumand P. vivax, remain controversial. In order to understand the evolutionary history of these parasites this project aims to infer the routes and dates of introduction of P. vivax and P. falciparum in the Americas. Analysis were based on complete mitochondrial genomes of parasites collected in all endemic regions, and we explored the existence of a genetic relationship between P. vivax and P. simium isolates to infer a possible lateral transmission route. The alignment of 941 sequences of P. vivax and 1795 of P. falciparum made it possible to group the isolates into four distinct regions. The migratory routes of P. vivax suggest that the American continent was colonized at different times by parasites from different regions - Africa, South Asia and Melanesia, explaining the high genetic diversity present in this continent, while P. falciparum was introduced in the Americas from two distinct regions, Africa and Southeast Asia. The 10 P. simium isolates sequenced in this study had a lower genetic diversity when compared to P. vivax isolates, suggesting that the direction of lateral transmission was from humans to monkeys.

La inestabilidad microsatélite (MSI) es una característica de los pacientes HNPCC. En estos tumores la perdida del sistema de reparación MMR tiene como consecuencia una acumulación progresiva de mutaciones. Hasta la actualidad no esta claro, como se acumulan estas alteraciones. Sin embargo, la MSI se puede detectar en los pacientes HNPCC antes del diagnóstico del tumor. Uno de nuestros objetivo fue evaluar la presencia de inestabilidad genética en sangre periférica de 2 familias HNPCC tanto portadores como no portadores de una mutación germinal en los genes MLH1 y MSH2. Hemos realizado un análisis extensivo de la distribución alélica de BAT26 meditante una técnica basada en PCR-clonación de esta secuencia. En los pacientes no portadores de la mutación, la distribución alelica de BAT26 sigue una distribución de campana de Gauss sin ningún alelo por debajo de 21Adeninas, mientras que todos los portadores de la mutación demuestran alelos inestables con una frecuencia de 5,6%. Por lo tanto sugerimos que la baja inestabilidad caracteriza los portadores de mutaciones en MMR. Estas observaciones sugieren que las mutaciones somáticas se acumulan antes del diagnostico del tumor, aunque no esta claro si estas acumulación de mutaciones se debe a la pérdida de MMR en un porcentaje pequeño de células o a la haploinsuficiencia del MMR. La detección de estos alelos inestables posiblemente nos puede ayudar en la identificación de portadores asintomáticos que pertenecen a familias con mutaciones germinales no detectables en MMR.Además del defecto en MMR, las alteraciones de los microsatélites en zonas no codificantes podrían tener otras causas. Por este motivo, hemos utilizado un modelo alternativo (DNA mitocondrial) para evaluar si estas alteraciones dependerán solamente del MMR como se ha postulado anteriormente. Las mutaciones somáticas en la secuencia D310 mitocondrial se ha asociado con la progresión tumoral. La inserción o la deleción de nucleótidos se ha encontrado en varios tipos de tumores. La frecuencia de mutaciones en tumores de colon, estómago u endometrio es de 23, 17 y 11%, respectivamente, que es paralelo al grado relativo de MSI observado en tumores con deficiencia en MMR (colon > estómago > endometrio, ratio relativo 10:8:4). Los tumores de colon con mutaciones de +1 nucleótido se ha observado en tumores de estadios avanzados de progresión. Se han identificado dos tumores con una mutación de T > C que restauró una repetición homoplasmica, con deleciones de secuencias de 4 y 6 nucleótidos. Estos resultados demuestran que el incremento mutacional de la secuencia repetitiva mitocondrial depende de la estructura repetitiva del DNA y no es resultado del proceso selectivo durante la tumorogénesis. Estos resultados sugieren que D310 se podría utilizar como reloj molecular para evaluar la historia replicativa de los tumores.La última parte de este estudio se concentra en el análisis de los microsatélites en zonas codificantes y el efecto que podría tener en el proceso tumorogénico. Estas alteraciones podrían cambiar el comportamiento de varias vías donde están implicados estos genes.El mantenimiento de la estabilidad genómica depende de una respuesta celular apropiada al daño y la integridad del sistema de reparación del DNA. Hemos analizado varios genes diana implicados en estas 2 vías en tumores con MSI. Hemos encontrado una alta frecuencia de mutaciones en los genes ATR (21%), MED1 (43%), hMSH3 (56%) y hMSH6 (43%). También se ha detectado una baja frecuencia en CHK1 (9% de los tumores). Estos resultados confirman que ATR, MED1 y CHK1 son genes diana en el proceso tumoral de estómago, y también sugiere que MED1 junto con hMSH3 y hMSH6 aumentan la inestabilidad genómica considerándolos como mutadores segundarios. Además, estos resultados sugieren la inhibición de la vía de respuesta de daño genómico que depende de ATR y CHK1 y que probablemente está implicada en el proceso tumoral en tumores gástricos con MSI. / Microsatellite instability (MSI) characterizes tumors arising in patients with HNPCC syndrome. In these tumors, the loss of MMR compromises the genome integrity, allowing the progressive accumulation of mutations and the establishment of a mutator phenotype in a recessive manner. It is not clear, however, whether MSI can be detected in HNPCC carriers before tumor diagnosis. The aim of this study was to evaluate the presence of genetic instability in MMR gene carriers in peripheral blood lymphocytes of carriers and non-carriers members of two HNPCC families harboring a germline MLH1 and MSH2 mutation, respectively. An extensive analysis of the allelic distribution of single molecules of the polyA tract bat26 was performed using a highly sensitive PCR-cloning approach. In non-carriers, the allelic distribution of single bat26 molecules followed a gaussian distribution with no bat26 alleles shorter than (A)21. All mutation carriers showed unstable alleles with an overall frequency of 5.6%. We therefore suggest that low levels of genomic instability characterize MMR mutation carriers. These observations suggest that somatic mutations accumulate well before tumor diagnosis. Even though it is not clear whether this is due to the presence of a small percentage of cells with lost MMR or due to MMR haploinsufficiency, detection of these short unstable alleles might help in the identification of asymptomatic carriers belonging to families with no detectable MMR gene mutations.In addition to the defect in MMR, alterations of microsatellites in no- coding regions may have other causes. For this reason we have used an alternative model (mitocondrial DNA) to evaluate if these alterations depend only on the defects of the MMR, as previously thought. Somatic mutations at a mitochondrial noncoding polycytidine D310 repeat have been associated with tumor progression. We analyzed whether these alterations are due to the inherent mutability of repeated sequences. Insertion and deletion mutations were found in colon, stomach, endometrium, breast, lung, and prostate tumors. The mutation frequency in colon, gastric, and endometrial tumors was 23, 17, and 11% respectively, which paralleled the relative extent of microsatellite instability in long mononucleotide repeats observed in tumors with mismatch repair deficiency (colon > stomach > endometrium, relative ratio 10:8:4). Colon tumors with mutations of more than one nucleotide were more advanced in tumor progression. Further, two tumors showing a T > C mutation that restored the homopolymeric repeat, harbored sequential deletion mutations of 4 and 6 nucleotides. These results illustrate that the increased mutability of repeated mitochondrial sequences is dependent on the repetitive structure of the DNA molecule and suggest that mutations in the D310, whether homoplasmic or not, and by extrapolation, mitochondrial mutations in general, are not the result of selective pressure during tumorigenesis. We also suggest that the D310 may be used as an universal molecular clock to estimate the relative mitotic history of tumors.The last part of this thesis concentrates in studying the alterations of microsatellites in coding regions and the effect that these will have in tumorogenesis process. Alteration in these genes sequences may be change the behaviour comportment of several pathways.. Maintenance of genomic stability depends on the appropriate cellular responses to DNA damage and the integrity of the DNA repair systems. We analyzed stomach tumors with MSI for frameshift mutations in several potential targets of the mutator phenotype involved in DNA damage-response pathways, and DNA repair system. High frequency of mutations was found within ATR (21%), MED1 (43%), hMSH3 (56%) and hMSH6 (43%) genes. Also, a low frequency of mutations within the CHK1 gene was detected in 9% of tumors. These results confirm ATR, MED1 and CHK1 as targets of the mutator pathway in stomach tumorigenesis, and also suggest a potential role of MED1 increasing, together with hMSH3 and hMSH6, the genomic instability in the mutator pathway as a secondary mutator. Furthermore, these results suggest that the inhibition of the ATR-CHK1 DNA damage-response pathway might be involved in the tumorigenesis of gastric cancer with MSI.