La réponse immune lors d'une infection par le VHB est essentielle pour éliminer le virus. Le virus module le système immunitaire pour échapper à son contrôle. Le mécanisme par lequel le virus module l'immunité est encore mal connu. Les cellules dendritiques plasmocytoides (pDC) jouent un rôle crucial dans l'immunité antivirale de part leur capacité à capturer et apprêter les antigènes viraux afin d'induire une réponse immune adaptative. Les pDCs représentent un bon potentiel pour restaurer une immunité anti-VHB fonctionnelle, mais le VHB pourrait moduler les pDCs pour échapper au contrôle immunitaire. Dans une première partie, nous avons évalué le potentiel des pDCs à restaurer l'immunité anti-VHB en contexte d'hépatite B chronique. Nous avons utilisé une lignée de pDCs HLA-A*0201+ chargée avec des peptides HLA-A*0201 restreints dérivés des antigènes HBc et HBs du virus afin d'amplifier des lymphocytes T spécifiques ex vivo à partir de cellules de patients atteints d'hépatite B chronique. Nous avons ensuite établi un modèle de souris humanisées (Hepato-HuPBL) afin d'évaluer le potentiel thérapeutique de la stratégie in vivo. La stimulation de PBMC ou de lymphocytes infiltrant le foie (LIL) issus de patients HLA-A*0201+ par la lignée de pDC chargée avec le peptide HBc a permis d'amplifier des lymphocytes T spécifiques de HBc et fonctionnels dans 45,8% des cas. Le groupe de non répondeurs était caractérisé par la présence d'Ag HBe ou un plus fort niveau de lymphocytes T régulateurs. L'efficacité thérapeutique du vaccin de pDC a été évaluée dans un modèle de souris NOD-SCID β2m-/- reconstituées avec des PBMC issus de patient VHB et xenotransplantées avec des hépatocytes humains transfectés avec le VHB. La vaccination de ces souris avec la lignée de pDC chargée avec les peptides HBc et HBs a permis l'amplification de lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB capables de lyser spécifiquement les hépatocytes infectés in vivo. Ainsi, la lignée de pDC chargée avec des peptides dérivés du VHB est capable d'amplifier des lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB et fonctionnels in vitro et in vivo. Cette nouvelle stratégie d'immunothérapie pourrait donc restaurer une immunité antivirale et permettre l'élimination du virus chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Dans une deuxième partie, nous avons évalué le rôle physiopathologique des pDCs au cours de l'infection chronique par le VHB et les conséquences fonctionnelles sur le cross-talk pDC/NK. Des défauts fonctionnels des pDCs et des cellules NK ont été observé chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Cependant le cross-talk pDC/NK ainsi que les mécanismes en jeu n'ont pas encore été élucidé. Nous avons étudié le phénotype et la capacité de répondre à une stimulation TLR-L des pDCs de patients comparé aux pDCs de donneurs sains puis nous avons étudié les conséquences sur le cross-talk entre pDCs de patients (virémiques ou avirémiques) et cellules NK hétérologues. Les pDCs de patients montrent un phénotype plus activé que les pDCs de donneurs sains mais ne sont pas capables de répondre à une stimulation TLR9-L. De plus, les pDCs de patients virémiques ne sont pas capables d'activer les fonctions cytotoxiques des cellules NK. Cette perturbation du cross-talk pDC/NK semble liée à un défaut de production d'IFNα et d'expression d'OX40L par les pDCs de patients virémiques, ainsi qu'à la présence d'une quantité importante d'IP-10 dans le plasma des patients. Ainsi, le VHB pourrait échapper à l'immunité en altérant la fonction des pDCs et perturbant le cross-talk pDC/NK par un mécanisme dépendant de IP-10, OX40L et IFNα.

IntroductionLes cicatrices chéloïdes (CC) sont des pathologies de la cicatrisation cutanée entraînant des gênes fonctionnelles et esthétiques souvent invalidantes. Elles sont liées à un excès de fabrication et une désorganisation du collagène lié en parti à un dérèglement du TGFβ. Les lasers thermiques permettent d'améliorer la cicatrisation par le biais d'une modification de la réponse inflammatoire. En effet, une élévation de la température entre 45 et 53°C entraine une hyperexpression des HSP 70, responsables d’une modification de l’expression du TGFβ. Le laser diode 810nm a déjà prouvé son efficacité mais il est contre indiqué chez les sujets de phototypes foncés qui sont les plus à risque de développer des CC. L'objectif de ce travail était d'évaluer l'effet d’un laser thermique sur les cicatrices chéloïdes chez l’animal et dans le cadre d’une étude clinique.Détermination des paramètres su laserDes études sur des explants de peau, puis sur des sujets volontaires sains ont permis de montrer que la longueur d’onde 1210 nm était la plus adaptée dans cette indication car elle est peu absorbée par la mélanine. Le choix des paramètres du laser ont également été déterminés afin d’obtenir une élévation contrôlée de la température cutanée. En théorie, un tir de laser diode 1210 nm, 5.1W/cm² pendant 10 secondes permet d’élever la température jusqu’à 53°C.Mise au point d’un modèle animal de CCIl n’existe pas de modèle animal de CC permettant d’étudier l’effet d’un laser. Nous avons donc mis au point un modèle pour le besoin de l’étude. Des fragments de CC humaines comprenant le derme et l’épiderme ont été greffés chez 40 souris nudes. Une évaluation clinique et histologique a permis de confirmer la bonne intégration du greffon et la persistance de son caractère chéloïde pendant 4 mois.Etude du laser diode 1210nm chez un modèle animal de CCUne étude du laser 1210 nm a été réalisée sur notre modèle animal. Il a été réalisé des tirs de laser directement sur les greffons et des évaluations cliniques et histologiques ont permis de montrer l’absence d’effet indésirable. La mesure de la température cutanée au moment du tir de laser était de 45°C en moyenne.Etude du laser diode 1210nm après excision intra chéloïdienne : étude cliniqueParallèlement à l’étude animale, il a été réalisé une étude pilote visant à évaluer la faisabilité et la sécurité d’un protocole de traitement des cicatrices chéloïdes utilisant le laser diode 1210nm. Il était réalisé une excision intra cicatricielle, puis la suture était irradiée par le laser 1210nm pendant environs 10 secondes. 20 patients ont été inclus dans l’étude. L’objectif de suivi était de 2 ans, mais l’étude est toujours en cours. Jusqu’à présent, il n’a été noté aucun effet délétère du laser. 8 patients ont bénéficié d’injections de corticoïdes en raison de récidive de la chéloïde à 6 mois.ConclusionCe travail à permis de mettre au point un modèle animal original de cicatrice chéloïde permettant pour la première fois l’étude des lasers in vivo. L’utilisation du laser 1210nm, 5.1W/cm2, pendant 10 secondes à entrainé une élévation de la température cutanée jusqu’à 45°C en moyenne sans aucun effet délétère sur la CC chez la souris. L’utilisation du laser thermique diode 1210 nm après une résection intra chéloïdienne n’a montré aucun signe de toxicité chez l’homme. La température cutanée était de 48°C en moyenne à la fin du tir. Une étude à plus grande échelle reste encore à réaliser afin de démontrer une efficacité de ce traitement prometteur. / Introduction Keloid scars (KS) are pathologies of skin healing causing often functional and aesthetic disturbances. They are linked to excess production and disorganization of collagen mostly due to TGF bêta; overproduction. The thermal lasers can improve healing through a modification of the inflammatory response. Indeed, a rise of temperature between 45 and 53 ° C leads to an overexpression of HSP 70, which causes a change in the expression of TGF bêta;. The 810nm laser diode has already proven to be effective but its wavelength cannot used on dark phototypes who are prone to developing KS.The objective of this study was to evaluate the effect of a thermal laser on keloids in animal and in the context of a clinical study.Determination of laser parameters Studies on skin explants, and on healthy volunteers have shown that 1210 nm was the most suitable wavelength for this indication because it is poorly absorbed by melanin. The laser parameters were also carefully determined in order to control the skin temperature elevation. For a 1210 nm laser diode, an irradiance of 5.1W/cm² for 10 seconds leads to a maximum temperature of 53 ° C.Development of a KS animal model. Since, there was no KS animal model of DC , an innovative one was developed for this specific study. Fragments of human KS including the dermis and epidermis were transplanted in 40 nude mice. A clinical and histological evaluation confirmed the successful integration of the graft. At 4 months, it was proven that the KS remained unchanged. Study of the 1210nm diode laser in an KS animal modelThe 1210 nm laser was evaluated on our KS animal model. Laser irradiation was performed on the grafts. Clinical and histological evaluations have shown no adverse reactions. A 45 ° C mean temperature was recorded during laser irradiation .Study of l the 1210nm diode laser after intrakeloid excision. Parallel to the animal study, a pilot study was performed to assess the feasibility and safety of a 1210nm diode laser irradiation. An intrakeloid excision was achieved; the suture was then irradiated for about 10 seconds. 20 patients were included in the study. The study is still ongoing. A 2-year follow up is scheduled. So far, it was noted that no harmful effects of the laser. 8 patients received injections of corticosteroids due to of keloid recurrence at six months.conclusionAn original KS animal model was developed for the first time to study of the in vivo effects of laser irradiation. It was demonstrated that a 1210nm diode laser (5.1W/cm², for 10 seconds) led to a 45°C skin temperature without any deleterious effect. The 1210 nm diode laser after intrakeloid excision showed no signs of toxicity in humans. In humans, the maximum temperature was 48 ° C +/- 3°C . A long term follow-up on a large series of patients is still necessary to confirm the effectiveness of this promising treatment.

La réponse immune lors d'une infection par le VHB est essentielle pour éliminer le virus. Le virus module le système immunitaire pour échapper à son contrôle. Le mécanisme par lequel le virus module l'immunité est encore mal connu. Les cellules dendritiques plasmocytoides (pDC) jouent un rôle crucial dans l'immunité antivirale de part leur capacité à capturer et apprêter les antigènes viraux afin d'induire une réponse immune adaptative. Les pDCs représentent un bon potentiel pour restaurer une immunité anti-VHB fonctionnelle, mais le VHB pourrait moduler les pDCs pour échapper au contrôle immunitaire. Dans une première partie, nous avons évalué le potentiel des pDCs à restaurer l'immunité anti-VHB en contexte d'hépatite B chronique. Nous avons utilisé une lignée de pDCs HLA-A*0201+ chargée avec des peptides HLA-A*0201 restreints dérivés des antigènes HBc et HBs du virus afin d'amplifier des lymphocytes T spécifiques ex vivo à partir de cellules de patients atteints d'hépatite B chronique. Nous avons ensuite établi un modèle de souris humanisées (Hepato-HuPBL) afin d'évaluer le potentiel thérapeutique de la stratégie in vivo. La stimulation de PBMC ou de lymphocytes infiltrant le foie (LIL) issus de patients HLA-A*0201+ par la lignée de pDC chargée avec le peptide HBc a permis d'amplifier des lymphocytes T spécifiques de HBc et fonctionnels dans 45,8% des cas. Le groupe de non répondeurs était caractérisé par la présence d'Ag HBe ou un plus fort niveau de lymphocytes T régulateurs. L'efficacité thérapeutique du vaccin de pDC a été évaluée dans un modèle de souris NOD-SCID β2m-/- reconstituées avec des PBMC issus de patient VHB et xenotransplantées avec des hépatocytes humains transfectés avec le VHB. La vaccination de ces souris avec la lignée de pDC chargée avec les peptides HBc et HBs a permis l'amplification de lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB capables de lyser spécifiquement les hépatocytes infectés in vivo. Ainsi, la lignée de pDC chargée avec des peptides dérivés du VHB est capable d'amplifier des lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB et fonctionnels in vitro et in vivo. Cette nouvelle stratégie d'immunothérapie pourrait donc restaurer une immunité antivirale et permettre l'élimination du virus chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Dans une deuxième partie, nous avons évalué le rôle physiopathologique des pDCs au cours de l'infection chronique par le VHB et les conséquences fonctionnelles sur le cross-talk pDC/NK. Des défauts fonctionnels des pDCs et des cellules NK ont été observé chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Cependant le cross-talk pDC/NK ainsi que les mécanismes en jeu n'ont pas encore été élucidé. Nous avons étudié le phénotype et la capacité de répondre à une stimulation TLR-L des pDCs de patients comparé aux pDCs de donneurs sains puis nous avons étudié les conséquences sur le cross-talk entre pDCs de patients (virémiques ou avirémiques) et cellules NK hétérologues. Les pDCs de patients montrent un phénotype plus activé que les pDCs de donneurs sains mais ne sont pas capables de répondre à une stimulation TLR9-L. De plus, les pDCs de patients virémiques ne sont pas capables d'activer les fonctions cytotoxiques des cellules NK. Cette perturbation du cross-talk pDC/NK semble liée à un défaut de production d'IFNα et d'expression d'OX40L par les pDCs de patients virémiques, ainsi qu'à la présence d'une quantité importante d'IP-10 dans le plasma des patients. Ainsi, le VHB pourrait échapper à l'immunité en altérant la fonction des pDCs et perturbant le cross-talk pDC/NK par un mécanisme dépendant de IP-10, OX40L et IFNα. / The immune control of HBV infection is essential for viral clearance. The virus is able to modulate the immune system to escape this control. The mechanisms involved remain largely unknown. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) play a crucial role in anti‐viral immunity due to their ability to capture and process viral antigens and subsequently induce adaptive immune responses. PDCs are therefore promising to restore functional anti‐HBV immunity, but HBV could modulate the pDCs to escape the immune control. First, we investigated the potential of pDCs in triggering anti‐viral immunity against HBV during chronic infection. We used a HLA‐A*0201+ pDC line loaded with HLA‐A*0201-restricted peptides derived from HBc/HBs antigens to amplify specific T cells ex vivo from chronic HBV patients. Then we established an Hepato-HuPBL humanized mouse model to address the therapeutic potential of the strategy in vivo. Stimulation of PBMC or liver-infiltrated lymphocytes from HLA‐A*0201+ chronic HBV patients by the HBc peptide-loaded pDC line elicited functional HBV-specific CD8 T cells in 45.8% of cases. The “non-responder” group of patients was characterised by the presence of HBe Ag or higher level of regulatory T cells. The therapeutic efficacy of the pDC-based vaccine was evaluated in NOD-SCID β2m-/- mice reconstituted with HBV patients' PBMC and xenotransplanted with human HBV-transfected hepatocytes. Vaccination of these mice with the HBc/HBs peptide‐loaded pDC line elicited HBV-specific T cells in vivo able to specifically lyses infected hepatocytes. Thus pDCs loaded with HBV‐derived peptides can elicit functional virus-specific T cells in vitro and in vivo. This new cell-based immunotherapeutic strategy could restore functional anti‐viral immunity and clear the virus in chronic HBV patients. In the second part, we investigated the pathophysiological role of pDCs from chronic HBV patients and the functional consequences on pDC-NK cross-talk. Functional impairment have been observed in both pDC and NK cells in chronic HBV patients. However, the cross-talk pDC/NK and the mechanisms involved have not been elucidated. We studied the phenotype and the ability to respond to a TLR-L stimulation of the pDCs from HBV patients compared to healthy donors, and we investigated the consequences on the cross-talk between patients' (viremic or aviremic) pDCs and heterologous NK cells. PDCs show higher levels of activation in patients compared to healthy donors but were not able to respond to TLR9-L stimulation. In addition, pDCs from viremic chronic HBV patients failed to trigger a normal NK cytolytic function after TLR9-L stimulation. This pDC-dependant NK dysfunction was related to impaired IFNα secretion and OX40L expression by pDCs from viremic patients, and related to high plasma IP-10 levels found in patients. In conclusion HBV could escape the immune system by impairing pDC function and subsequent pDC/NK cross-talk by a mechanism involving IP10, OX40L and IFNα.

Mon travail de thèse porte sur les épilepsies focales avec ou sans malformations cérébrales de type dysplasie corticale focale. Il s'articule autour de (1) une étude fonctionnelle et génétique sur tissu cérébral postopératoire humain et (2) la caractérisation d'un nouveau modèle génétique chez l'animal. Tout d'abord, des mutations germinales hétérozygotes perte de fonction ont été identifiées dans DEPDC5, NPRL2 et NPRL3 qui codent pour le complexe GATOR1, un inhibiteur du complexe 1 de mTOR (mTORC1). Par la suite, des mutations somatiques cérébrales gain de fonction ont été identifiées dans MTOR. Nous avons émis l'hypothèse que ces mutations entrainent une hyperactivité de mTORC1, responsable des malformations cérébrales et de l'épilepsie des patients. J'ai observé une hyperactivité de mTORC1 dans les cellules cytomégaliques obtenues à partir de tissu cérébral post-opératoire de patients porteurs de mutations dans les gènes de GATOR1 ou MTOR. En parallèle, la caractérisation du premier modèle KO de Depdc5 a montré que les rats Depdc5+/- présentent des anomalies corticales rappelant celles des patients : délamination des couches corticales et cellules cytomégaliques avec une hyperactivité de mTORC1. Ce phénotype est prévenu par l'injection de rapamycine, un inhibiteur spécifique de mTORC1. Une susceptibilité accrue aux crises épileptiques induites par le pentylènetétrazole ainsi qu'un défaut des propriétés neuronales passives et actives ont été rapportés chez les rats Depdc5+/-. En conclusion, mes travaux de thèse ont contribué à mettre en évidence l'implication de la voie GATOR1-mTORC1 dans les épilepsies et dysplasies corticales focales. / In my PhD thesis work, I investigated focal epilepsies with and without brain malformations such as focal cortical dysplasia. I focused on two complementary aspects: (1) genetics and functional studies on human tissue samples and (2) characterization of a novel genetic animal model. First, germline heterozygous loss-of-function mutations were identified in DEPDC5, NPRL2 and NPRL3 genes that encode proteins which together form the GATOR1 complex, a repressor of the mTOR complex 1 (mTORC1). Additionally, brain somatic gain-of- function mutations were identified in MTOR gene that encodes mTOR itself. Both types of mutations are thought to lead to mTORC1 hyperactivity, and cause brain malformation and epilepsy in patients. To test this hypothesis, mTORC1 activity was monitored on post-operative brain tissue from patients carrying GATOR1 or mTOR genes mutations. Cytomegalic cells with mTORC1 hyperactivity were observed. Besides, the characterization of the first Depdc5 KO model revealed that Depdc5+/- rats present cortical structural abnormalities reminiscent of patient histopathology hallmarks: cortical layer dyslamination and cytomegalic cells with increased mTORC1 activity. This phenotype was prevented by rapamycin injection, a specific mTORC1 inhibitor. An increased susceptibility to pentylenetetrazol-induced epileptic seizures, as well as impaired passive and active neuronal properties were observed in Depdc5+/- rats compared to Depdc5+/+ rats. In conclusion, my PhD work largely contributed to emphasize the prominent role of the GATOR1-mTORC1 pathway in focal cortical dysplasia and epilepsies.

Le chien présente de nombreuses maladies génétiques dont les rétinopathies auxquelles je me suis intéressée. Historiquement, l’homme a appliqué aux chiens une sélection artificielle extrêmement forte, créant ainsi près de 400 races répondant à des besoins spécifiques. En uniformisant ainsi de nombreux traits phénotypiques et comportementaux, l’homme a sélectionné les allèles recherchés mais a également concentré involontairement des allèles délétères responsables de maladies génétiques. Ces maladies étant pour beaucoup cliniquement et génétiquement similaires aux maladies humaines, le chien constitue alors un modèle de choix pour en rechercher les bases génétiques et développer de nouvelles thérapies pour un bénéfice mutuel pour l’homme et le chien. J’ai travaillé sur l’Atrophie Progressive de la Rétine (APR) dans deux races avec le concours du Dr Gilles Chaudieu et des clubs de race : le border collie et le berger picard. Concernant l’APR du border collie, les analyses réalisées avant mon arrivée avaient identifié un locus de 20Mb sur le chromosome X. J’ai tout d’abord mis à jour les données épidémiologiques et cliniques d’environ 500 chiens et poursuivi la collecte de prélèvements. Une analyse de liaison génétique pangénomique sur 130 chiens m’a permis de confirmer le mode de transmission et le locus. J’ai ensuite conduis plusieurs analyses génétiques (« homozygosity mapping », analyses des génotypes, séquençage de gènes candidats) sans pour autant réduire le locus ni identifier de mutation causale. Dans ce contexte et grâce à l’avènement des nouvelles technologies de séquençage, j’ai choisi de séquencer le génome complet de trois chiens atteints et deux porteurs apparentés. Ce travail m’a permis d’identifier 117variants dont 9 dans le locus d’intérêt, mais aucun dans des régions codantes. Je me suis donc focalisée sur les variants de régions régulatrices pour 13 gènes candidats. De plus, j’ai identifié cinq variants structuraux, encore en cours d’étude. Concernant l’APR du berger picard, nous avons relancé le projet par la collecte de prélèvements et la réalisation d’un pedigree de 154 chiens. Ce travail a amené à une collaboration tripartite internationale par le séquençage de deux chiens atteints et deux indemnes d’APR, dont les analyses sont en cours. Cette thèse m’a permis d’aborder la génétique d’une maladie génétique rare chez l’homme grâce à un modèle spontané original ; et même si ce travail n’a pas abouti à l’identification de mutations à ce jour, ces APR restent de bons modèles génétique et thérapeutique pour les rétinites pigmentaires humaines. / Dogs are affected by numerous genetic diseases including retinopathies, the subject of my thesis. Historically, humans have exerted a very strong artificial selection to dogs, thus creating some 400 breeds to perform specific tasks or to harbour specific traits. By such an homogenisation of phenotypic and behavioural traits, humans have selected desired alleles but also concentrated undesired deleterious alleles responsible of genetic diseases. These diseases are clinically and genetically similar to human genetic diseases, making dogs a model of choice to search for the genetic bases of such genetic diseases and to develop new therapies for a mutual benefit for dogs and humans. I worked on Progressive Retinal Atrophies (PRA) in two breeds, thanks to the contribution of the veterinary ophthalmologist Dr. Gilles Chaudieu and the breed clubs of border collies and berger picard. Concerning the border collie PRA, genetic analyses performed before my thesis allowed the identification of a locus of 20Mb on the X chromosome. I first completed and supplemented the epidemiological and clinical data for about 500 dogs and continued the sample and data collection. A first genetic linkage analysis on 130 dogs allowed to confirm the transmission mode and the locus. I then performed several genetic analyses (« homozigosity mapping », genotypes analyses, candidate gene sequencing) without significantly reducing the locus,neither finding the causal mutation, unfortunately. In this context and thanks to the development of new sequencing technologies, I chose to sequence the entire genome of three PRA affected border collies and two unaffected related dogs. This work allowed the identification of 117variants, 9 in the locus but none in coding regions. I thus focused my research on genetic variants from potential regulatory regions for 13 candidate genes. In addition, I identified five structural variants. The analysis of these variants is still ongoing. Concerning the berger picard PRA, we have re-initiated the project by collecting samples and designing a large pedigree of 154 dogs. This workled to an international collaboration by the sequencing of the entire genomes of 2 affected and 2 unaffected bergers picards for which the statistical analyses are ongoing. This thesis allowed me to work on the genetics of rare diseases in humans with a spontaneous and original animal model and even if thiswork has not yet reached the identification of the mutations, these two PRAs in these two breeds remain good genetic and therapeutic models for human RP RetinitisPigmentosa.

Des modifications du gène PMP22 (Peripheral Myelin Protein 22) sont responsables de neuropathies du système nerveux périphérique : l’Hypersensibilité à la Pression (HNPP : Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy) lorsqu’il est délété, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth type 1A) lorsqu’il est dupliqué et CMT1E ou HNPP lors de mutations ponctuelles. Cependant, le rôle de la protéine PMP22 dans ces neuropathies demeure obscur. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux partenaires d’interactions potentiels de PMP22 : l’intégrine α6β4 (un récepteur des laminines), pourrait être impliqué dans le CMT1A. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle de rat transgénique portant des copies supplémentaires de PMP22 de souris. Chez ce modèle, nous avons mis en évidence des variations d’expression génique des intégrines, ainsi qu’une mauvaise localisation cellulaire de celles-ci. Ces variations des niveaux d’expression des intégrines sont les témoins d’un retard de la maturation des cellules de Schwann myélinisantes, expliquant la diminution de l’épaisseur des gaines de myéline, observée chez les rats CMT1A. Dans un second temps, nous avons étudié le cas particulier d’un patient sans expression de PMP22, en raison de deux mutations composites sur les deux allèles de PMP22. Nous avons observé que l’absence de PMP22 chez l’homme entraine une absence complète de myéline due à un blocage de l’initialisation de la myélinisation lors de la formation du mésaxone. Dans un troisième temps, nous avons effectué une étude comparative de modèles animaux et de patients atteints de CMT1A / 1E et d’HNPP permettant de valider l’utilisation de tels modèles dans l’étude de ses neuropathies. Enfin, nous nous sommes intéressés d’un point de vue informatique à la structure tridimensionnelle de différentes protéines dont PMP22 grâce à la dynamique moléculaire. Ce modèle tridimensionnel de PMP22 est le point de départ de l’étude des mutations ponctuelles ainsi que des interactions de PMP22 avec son environnement. Grâce aux animaux modèles et à l’étude de patients, nous avons montré le rôle indispensable de PMP22 dans l’initialisation de la myélinisation ainsi que son effet sur les intégrines dans le CMT1A. L’utilisation de modèles informatiques tridimensionnels créés de PMP22 permettra de comprendre les effets des mutations ponctuelles sur sa structure, et ses interactions. / Interactions study of PMP22 protein with integrins in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A pathogenesisChanges in the PMP22 gene (Peripheral Myelin Protein 22) are responsible for peripheral nervous system neuropathies: Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy (HNPP) when PMP22 is deleted, Charcot Marie Tooth disease subtype 1A (CMT1A) when PMP22 is duplicated and CMT1E or HNPP when point mutations are present on the PMP22 gene. However, the PMP22 role in these neuropathies remains unclear. Firstly, we studied one of the PMP22 interaction partner: the α6β4 integrin (a laminin receptor), which could be involved in the CMT1A. During this study, we used a transgenic rat model carrying supplementary copies of PMP22 gene from mouse. With this model, we showed variations of expression of integrins genes and a mislocalization of integrins proteins. These variations of integrins witnesses a delay in myelinating Schwann cells maturation, explaining the reduction of myelin sheath thickness observed on CMT1A rats. In a second time, we studied the case of a patient without PMP22 expression, carrying compound mutations one the two alleles of PMP22. We showed that the lack of PMP22 on human leads to a complete lack of myelin due to a blocking in mesaxon formation. In a third time, we conducted a comparative study of animal models and patients with CMT1A / 1E and HNPP. This study allows us to validate the use of such models in the study of neuropathies. Finally, thanks to computational tools we studied the three-dimensional structure of different protein, including PMP22 by using molecular dynamics. This three-dimensional model is the starting point of point mutations study as well as PMP22 interactions with its environments. With animal models and through the study of patients, we have demonstrated the indispensable role of PMP22 in myelin initiation as well as, its effect on integrins expression in CMT1A. The use of PMP22 three-dimensional computational model will help us to understand effects of point mutation on PMP22 structure and interactions.

Les douleurs neuropathiques sont secondaires à une maladie ou à une lésion affectant le système nerveux somatosensoriel et sont mal soulagées par les antalgiques usuels. Dans notre travail préclinique, nous avons étudié l’effet de différentes molécules, dont des antidépresseurs et antiépileptiques recommandés dans le traitement des douleurs neuropathiques. Dans un modèle murin de neuropathie traumatique, nous avons étudié l’influence de la période de traitement, précoce ou tardif, sur l’allodynie mécanique. Un traitement précoce par gabapentine ou par carbamazépine permet d’observer un effet préventif sur la chronicisation de l’allodynie. Dans un modèle murin de neuropathie diabétique, nous avons caractérisé l’action anti-allodynique d’un traitement par nortriptyline et par terbutaline. En clinique, nous avons réalisé un travail d’enquête rétrospective sur des patients opérés par thoracotomie. L’analyse des résultats montre une diminution significative du risque de présenter des douleurs chroniques avec des caractéristiques neuropathiques chez les patients traités par β2-agonistes au long cours. / Neuropathic pain is caused by a lesion or disease of the somatosensory nervous system and is badly relieved by usual antalgics. In our preclinical work, we studied the effect of various molecules, in particular antidepressant and anticonvulsant drugs wich are recommended in the treatment of neuropathic pain. In a murine model of traumatic neuropathy, we studied the influence of the period of treatment, early or late, on the mechanical allodynia. An early treatment with gabapentin or carbamazepine leads to a preventive effect on sustained allodynia. In a murine model of diabetic neuropathy, we characterized the antiallodynic action of nortriptyline and terbutaline. In our clinical work, we realized a retrospective survey on patients operated by thoracotomy. The analysis of the results show a significant decrease of the risk to suffer from chronic pain with neuropathic characteristics in patients treated with long-term β2- agonists.

La restriction alimentaire chronique correspond à un des troubles du comportement alimentaire observé en particulier dans l’anorexie mentale (AN) de type restrictif, pathologie qui touche essentiellement les adolescentes et les jeunes femmes. En plus de ce comportement restrictif, une activité physique importante est observée chez un grand nombre de patientes (40 à 80% des cas). Cette maladie se traduit par de nombreuses altérations physiologiques comme des perturbations neuroendocrines, métaboliques, osseuses (ostéopénie, ostéoporose) et ce quelle que soit la cause psychiatrique qui a conduit au développement de ce comportement. De plus, de nombreux arguments suggèrent que l’AN pourrait être considérée comme un trouble « addictif » qui se manifesterait par une addiction à la perte de poids et/ou à la restriction alimentaire ou encore à l’activité physique suggérant une altération du système dopaminergique de récompense. Ainsi, quelles que soient les origines de la maladie, l’AN entraîne des perturbations périphériques et centrales susceptibles d’être impliquées dans une première phase dite « d’adaptation » permettant aux malades de survivre à ces conditions drastiques. Les patients peuvent par la suite tomber dans une seconde phase de « chronicisation » dans laquelle ces mêmes facteurs pourraient être responsables de la dégradation de l’état des malades et conduire, dans les cas les plus graves d’épuisement, à la mort.Notre étude a comme pivot la ghréline, hormone orexigène, dont les concentrations plasmatiques sont augmentées significativement chez les patients anorexiques. Sécrétée principalement en périphérie par les cellules de l’estomac, elle va cibler plusieurs organes aussi bien périphériques que centraux. En particulier, au niveau périphérique, cette hormone agit au niveau du foie dont la principale fonction connue est le maintien de l’homéostasie glucidique. Elle agit également au niveau du tissu adipeux qui est alors stimulé, favorisant ainsi sa croissance avec un stockage des réserves et au niveau musculaire en entrainant entre autre une diminution des réserves de triglycérides. Au niveau du système nerveux central, parmi les sites d’action de la ghréline, on trouve les structures impliquées aussi bien dans le contrôle, qualifié d’homéostatique, de la prise alimentaire représenté par l’hypothalamus, que dans le contrôle, dit hédonique (motivation/récompense), de ce même comportement correspondant au circuit méso-limbique. Pour étudier son implication dans les mécanismes adaptatifs, et éventuellement, dans l’aggravation de la maladie, nous avons mis au point un modèle animal de restriction alimentaire chronique mimant les symptômes physiologiques de l’AN. Notre premier objectif a été de caractériser (« phénotypage ») ce modèle sur le plan physiologique (métabolique, endocrinien) afin de l’utiliser pour notre deuxième objectif : évaluation du rôle de la ghréline comme potentiel facteur prédictif de l’évolution de la maladie.Les données obtenues valident notre modèle comme un modèle pertinent pour étudier sur le long terme les altérations physiologiques et centrales décrites dans l’AN de type restrictif. Nous montrons que l’exercice physique modéré associé à la restriction alimentaire a des effets stabilisateurs sur de nombreux paramètres métaboliques limitant ainsi un épuisement prématuré des ressources énergétiques. En ce qui concerne la ghréline, les concentrations plasmatiques élevées observées dans notre modèle pourraient contribuer également à une régulation adaptative du métabolisme énergétique. / Chronic food restriction is one of the major features observed in anorexia nervosa (AN), especially in the restrictive type. This major eating disorder affects mainly teenager girls and young women. Additionally to the restriction behavior, important physical activity is observed in a large number of patients (40-80% of cases). This disease induces various physiological alterations that concern neuroendocrine, metabolic and bone (osteopenia, osteoporosis) pathways, which have dramatic consequences on the patient’s health. Moreover, many arguments suggest that AN could be considered like an "addictiv" disorder supported by an addiction to weight loss and/or food restriction or physical activity. It thus suggests modifications of the central dopaminergic reward system. Furthermore, whatever the origins or the causes of this disorder, AN leads to peripheral and central alterations that might be involved in an "adaptation" phase allowing patients surviving to these drastic conditions. For some patients, a phase of "chronicity" is described in which these physiological changes may worsen the patient conditions and contribute, when exhaustion is amplifying, to death. Our study points out ghrelin, an orexigenic hormone whose plasma concentrations are significantly increased in AN patients. Mainly secreted by stomach cells, it targets multiple peripheral organs as well as numerous neuronal structures in the brain. At the peripheral level, this hormone acts among others in the liver whose main function is the maintenance of glucose homeostasis. It acts also on the adipose tissue to promote its growth that is associated with lipid storage and on muscle resulting in a reduction of triglycerides stock. At the central nervous system level, ghrelin have various targets like the structures involved in the homeostatic as well as hedonic (motivation/reward) control of food intake through the hypothalamus and the meso-cortico-limbic system respectively.To study the involvement of ghrelin in the potential adaptive mechanisms, and even in the worsening of the disease, we have developed an animal model of chronic food restriction associated or not with physical activity, mimicking the physiological symptoms of AN. Our first objective was to characterize and to phenotype the mouse model by evaluating various physiological (metabolic, endocrine) factors in order to study in our second objective the role of ghrelin as a potential predictor of disease progression.We showed that our mouse model constitutes a pertinent model to study on a long term duration the physiological and central altérations described in the restrictive type AN. Moreover, we showed that moderate physical activity associated with food restriction had stabilizing effects on numerous metabolic parameters that may reduce an early exhaustion of energy stocks. Concerning the role of ghrelin in such model, its plasma concentrations were increased like in AN patients and were suggested to contribute to the adaptive regulation of energy metabolism.

Les Henipavirus sont des paramyxovirus zoonotiques émergents hautement pathogènes. Ils sont capables d’infecter un large spectre d’hôtes incluant notamment la chauve-souris frugivore (réservoir naturel), le porc et l’homme. Etant donné leur très grande dangerosité et en l’absence de traitements curatifs ou prophylactiques efficaces, ces virus doivent être manipulés dans un laboratoire de classe P4. Dans une première partie, nous étudions l’effet de composés glyco-amino-glycanes sur l’infection par les Henipavirus ainsi que leur potentielle application en tant que traitement. Dans une seconde partie, nous nous attachons à comprendre les interactions entre le système immunitaire de l’hôte et le virus. Afin de mieux comprendre ces interactions, nous avons utilisé une approche basée sur l’utilisation de souris déficientes pour certaines voies de l’immunité. En effet, bien que les récepteurs cellulaires au virus (EFN B2 et B3) soient fonctionnels chez la souris, celle-ci est résistante à l’infection par voie intrapéritonéale. Nous avons analysé la susceptibilité au virus Nipah (NiV) de souris privées de différentes voies du système immunitaire inné et adaptatif. Les résultats obtenus permettent d’envisager certaines lignées de ces souris comme nouveaux modèles animaux pour l’étude de l’immunopathogénèse du NiV. Cette étude suggère aussi que le système interféron de type I joue un rôle crucial dans la limitation de la propagation virale vers le cerveau et que les lymphocytes T sont nécessaires à la complète élimination du virus. Les macrophages jouent, quant à eux, un rôle central et indispensable, à l’interface entre système inné et adaptatif. Enfin, nous abordons les prémices d’un projet visant à identifier les différences d’interactions au niveau moléculaire entre les protéines non-structurales du virus et les protéines du système immunitaire inné chez l’Homme et la souris afin de voir s’il se dégage des différences d’interactions pouvant expliquer les différences de pathogénie. Ces travaux ont donc permis d’identifier de nouveaux modèles animaux et de mieux caractériser les interactions entre le pathogène et le système immunitaire de l’hôte, de l’échelle moléculaire à l’échelle de l’organisme entier. Néanmoins, les mécanismes précis de ces interactions restent à élucider et permettront certainement de mieux comprendre la grande diversité de pathogénie des Henipavirus. / Henipaviruses are highly pathogenic emerging zoonotic paramyxoviruses. They can infect a broad spectrum of mammals including flying foxes (Pteropus fruit bats), its reservoir, pigs and humans. As there are neither therapeutic drugs nor efficient prophylactic treatment towards these highly lethal viruses, they have to be manipulated in biosafety level-4 laboratories. In the first part of this thesis, we study the role of glyco-amino-glycans on Henipavirus infection and their potential use as treatment. In the second part, we describe the interaction between the host immune system and the pathogen. To investigate these interactions, we took advantage of different transgenic mouse models deficient for some immune pathways. Indeed, although mice possess the viral entry receptor for Henipaviruses, they do not succumbed to intraperitoneal infection. We analyzed the susceptibility to Nipah virus (NiV) infection of mice deleted for different components of innate and adaptive immune systems. Obtained results showed that some of these mice can be used as new models for NiV immunopathogenesis study. This study also suggests that type I interferon system plays a major role in limitation of viral spreading to the brain and that T cells are necessary for full viral clearance. Macrophages act at the crossroad of immunity, between innate and adaptive system. Finally, we deal with the preliminary phases of a project which aims to identify the differences, at a molecular level, of interaction between non-structural viral proteins and innate immunity proteins in mice and human. Such differences could explain the different clinical patterns that are observed in these species. In conclusion, this thesis allowed to identify new animal models and to better characterize host-pathogen interactions, from molecular to whole organism level. However, the precise mecanisms of these interactions remain to be elucidated and would probably help to understand the great diversity of pathogeny of Henipaviruses.

L’addiction aux drogues d’abus est un désordre psychiatrique caractérisé par une consommation compulsive de toxiques, au détriment d’activités alternatives plus bénéfiques à long terme, et malgré les conséquences négatives associées. Cette psychopathologie est ainsi de plus en plus conceptualisée comme le résultat d’une prise de décision pathologique, et l’un des plus grands enjeux de la recherche en addiction est de comprendre les bases neurobiologiques et physiopathologiques de ce dysfonctionnement. Devant les contraintes éthiques, techniques et pratiques inhérentes aux études neurobiologiques chez l’homme, il est important d’utiliser en parallèle des modèles animaux d’addiction. Malheureusement, la validité de la plupart de ces modèles est incertaine. En effet, la prise de drogue est bien trop souvent étudiée dans une situation où la drogue est la seule récompense disponible. Ainsi, dans ces conditions, il est difficile de déterminer si l’animal s’auto-administre une drogue par compulsion, ou simplement parce qu’il n’a pas d’autre activité alternative valable. Une série d’expériences menées dans notre laboratoire depuis plusieurs années a montré que lorsqu’un choix est donné entre une injection intraveineuse de cocaïne ou d’héroïne et un accès à une boisson sucrée, la vaste majorité des rats préfèrent l’eau sucrée. Une minorité de rats persévère cependant dans le choix de la drogue au détriment de l’accès à la boisson sucrée, et constituerait ainsi une population d’individus vulnérables à l’addiction. Au cours de ma thèse, mon principal objectif a été d’étudier les déterminants du choix entre prise de drogue (cocaïne et héroïne) et récompense alternative. Mes travaux de recherche ont permis de déterminer les mécanismes de choix utilisés par le rat, en testant la validité prédictive relative de plusieurs modèles de prise de décision. J’ai également contribué à la mise en évidence d’une interaction forte entre le contexte de choix, les effets directs de la drogue et les capacités cognitives spécifiques au rat. Cette interaction exerce une influence considérable sur le choix de la drogue chez le rat. Cette découverte pourrait conduire à une réinterprétation des expériences de choix menées chez le rat et soulève aussi des interrogations importantes sur la validité relative des procédures de choix pour modéliser l’addiction aux drogues. / Drug addiction is defined as a psychiatric disorder involving compulsive drug use, despite negative consequences, and is increasingly conceptualized as resulting from poor decision making with a preference bias towards the drug at the expense of other socially-valued behaviors. The most important challenge in current addiction research is to understand the physiopathology of this disorder. Animal models are important tools in addiction research, since they are less ethically and technically limited than human studies. However, preclinical research on drug addiction is typically performed in laboratory rats that are given ready access to drugs for intravenous self-administration but without other options. The lack of choice during drug access limits its validity for understanding the physiopathology of addiction. A series of studies from our laboratory has previously shown that when offered a mutually exclusive choice between pressing a lever to get sweet water or an alternative lever to receive an intravenous dose of cocaine or heroin, most rats prefer sweet water. Only a minority of rats persists in drug taking despite the availability of an alternative reward, and thus, appears to be more vulnerable to drug addiction. During my thesis, my main objective was to determine the psychological and behavioral determinants of choice between drugs of abuse (cocaine and heroin) and sweet water. This research allowed us to determine the decision-making processes underlying this choice, by testing the predictive validity of different decision-making models. Additionally, we evidenced a strong interaction between the choice setting, the drug’ direct effects and rats’ specific cognitive abilities that reliably influences drug choices in rats. This finding should lead to a novel interpretation of drug choice studies in rats and also raises important issues regarding the relative validity of choice procedures for modelling drug addiction.