A busca de alternativas terapêuticas para o tratamento da doença de Chagas é de grande importância, visto que atualmente existem apenas dois fármacos disponíveis, o benznidazol e o nifurtimox. Ambos apresentam efeitos adversos consideráveis, sendo utilizado, no Brasil, apenas o benznidazol. Compostos nitro-heterocíclicos com atividade frente ao Trypanosoma cruzi, agente causal da doença de Chagas, tem apresentado resultados promissores. Assim, este trabalho abrange o planejamento, síntese, identificação, avaliação da atividade anti-T. cruzi de 5-nitro furfurilidênicos (IC50 T. cruzi) e a citotoxicidade destes compostos frente a macrófagos de linhagem J774 (IC50 J774). A nifuroxazida, composto-protótipo, inspirou as modificações moleculares originando duas séries de compostos furfurilidênicos, uma com estrutura azometínica, série I, e outra com estrutura oxadiazolínica, série II. A escolha de substituintes foi baseada no diagrama de Craig, sendo selecionados dez substituintes para cada série. Foi avaliada a atividade dos vinte compostos planejados frente ao T. cruzi, dos quais os mais ativos foram: 4-butil-[N\'- (5-nitrofuran-2-il)metileno]benzidrazida (4g - IC50 T. cruzi = 1,05 µM, DP = 0,07) e 3-Acetil-5-(4-butilfenil)-2-(5-nitrofuran-2-il)-2,3-di-idro-1,3,4-oxadiazol (5g - IC50 T. cruzi = 8,27 µM, DP = 0,42). Comparados com os fármacos de referência, benznidazol (IC50 T. cruzi = 22,69 µM, DP = 1,96) e nifurtimox (IC50 T. cruzi = 3,78 µM, DP = 0,10), o composto 4g demonstrou atividade anti-T. cruzi superior a ambos. Todos os compostos apresentaram atividade maior do que a nifuroxazida (IC50 T. cruzi = 120,46 µM, DP = 4,06). Para os ensaios de citotoxicidade, obteve-se para o composto mais ativo frente ao T. cruzi, 4g, IC50 J774 = 28,05 µM, DP = 1,05, e para o composto 5g, obteve-se IC50 J774 = > 400 µM, o que representa que a concentração máxima avaliada deste composto não afetou as células. Ambos apresentaram boa seletividade ao efetuar a relação entre o IC50 J774 e o IC50 T. cruzi. Adicionalmente, foram realizados cálculos de propriedades físico-químicas das estruturas tridimensionais dos compostos, seguido pela análise exploratória de dados por análise de agrupamentos hierárquicos (hierarchical clusters analysis - HCA) e análise de componentes principais (principal component analysis, PCA), possibilitando a identificação das propriedades que mais influenciam na atividade anti-T. cruzi nas séries dos compostos estudados. Os resultados indicaram uma forte influência das propriedades ClogP e momento dipolo, evidenciando a necessidade de um equilíbrio lipofílico/hidrofílico no planejamento de novas moléculas com ação anti-T. cruzi. / The search for alternative therapies for the treatment of Chagas disease presents great importance, since there are only two currently available drugs, nifurtimox and benznidazole. Both have considerable adverse effects and, in Brazil, is used only benznidazole. Nitro-heterocyclic compounds with activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, has shown promising results. Thus, this work includes the design, synthesis, identification, evaluation of anti-T. cruzi activity of 5-nitro-2- furfuriliden (IC50 T. cruzi) and cytotoxicity of these compounds against J774 macrophages cell line (IC50 J774). The nifuroxazide, as a lead compound, inspired the molecular modification leading to two series of furfuriliden compounds, a azometinic structure, series I, and other with oxadiazolinic structure, series II. The choice of substituents was based on the Craig\'s diagram, and ten substituents were selected for each series. We evaluated the activity of twenty compounds designed against T. cruzi, and the most active compounds were: 4-butyl-[N\'-(5-nitrofuran-2-yl) methylene] benzidrazide (4g - IC50 T. cruzi = 1.05 µM, SD = 0.07) and 3-acetyl-5-(4-butylphenyl)-2 -(5-nitrofuran-2-yl)- 2,3-dihydro, 1,3,4-oxadiazole (5g - IC50 T. cruzi = 8.27 µM, SD = 0.42). Compared to the reference drugs, benznidazole (IC50 T. cruzi = 22.69 µM, SD = 1.96) and nifurtimox (IC50 T. cruzi = 3.78 µM, SD = 0.10), the compound 4g demonstrated anti-T. cruzi activity superior to both drugs. All compounds showed better activity than nifuroxazide (IC50 T. cruzi = 120.46 µM, SD = 4.06). For cytotoxicity assays, was found for the most active compound against T. cruzi, 4g, IC50 J774 = 28.05 µM, SD = 1.05, and for compound 5g was obtained IC50 J774 = >400 µM, that represents the maximum concentration of the compound evaluated which did not affect the cells. Both showed good selectivity in the calculation of the ratio between the IC50 T. cruzi and IC50 J774. Additionally, we performed calculations of the physicochemical properties of three-dimensional structures of the compounds, followed by exploratory data analysis including hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA), which contributed to the identification of properties that influence the activity anti-T. cruzi in the series of compounds studied. The findings indicated a significant influence of ClogP and dipole moment properties, pointing out the need of a lipophilic/hydrophilic balance in the designing of novel anti-T. cruzi molecules.

Submitted by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-04-12T19:05:59Z No. of bitstreams: 1 tese_isabella_vfinal.pdf: 6145955 bytes, checksum: e3ed369e970ad7eb06b79a77ef921a9b (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-04-12T19:06:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese_isabella_vfinal.pdf: 6145955 bytes, checksum: e3ed369e970ad7eb06b79a77ef921a9b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T19:06:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_isabella_vfinal.pdf: 6145955 bytes, checksum: e3ed369e970ad7eb06b79a77ef921a9b (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) / Molecular docking is a methodology that aims to predict the binding modes and affinity of a small molecule within the binding site of the receptor target of interest. It is an approach widely used by the pharmaceutical industry and the academic community for identification and optimization of lead compounds, contributing to the reduction of cost, time and failures in the development of new drugs. Current docking methods and the associated scoring functions exhibit good performances in identifying experimental binding modes. However, the detection of active compounds among a decoy set of ligands and the accurate prediction of binding affinity remain challenging tasks. The DockThor program developed in our group has obtained promising results in comparative studies with other well established and widely used protein-ligand docking programs for predicting experimental binding modes. Despite useful for pose prediction, the current scoring function implemented in DockThor is not suitable for predicting binding affinities of protein-ligand complexes, obtaining no correlation with measured affinity data. In this work, we develop several scoring functions with physically-based features for predicting binding affinities of protein-ligand complexes trained with diverse machine learning techniques. The final scoring functions consist of force-field based terms related to the intermolecular interactions (electrostatic and van der Waals potentials), an original term for the ligand entropy (number of frozen rotatable bonds), ligand and protein desolvation and the hydrophobic effect. Then, we developed general and target-classes scoring functions, the last to account for binding characteristics associated with a target class of interest, focusing on proteases, kinases and protein-protein interactions complexes (PPIs). The scoring functions were derived using linear regression (MLR) and seven more advanced machine learning techniques for nonlinear problems. The training and testing were carried out using high-quality datasets composed of experimental structures of diverse protein-ligand complexes with binding affinities data available (Kd or Ki). Additionally, we also derived general scoring functions trained with redocking results from the DockThor program. The scoring functions trained with docking results obtained promising performances when evaluated in both experimental and docking structures, indicating that they are reliable to be used in real virtual screening experiments. The scoring functions developed in this work have demonstrated to be competitive with the best-evaluated linear and nonlinear scoring functions in benchmarking studies described in the literature. The scoring functions derived for specific classes of targets also exhibited promising performances, achieving great improvements when using nonlinear approaches compared to the linear models. Moreover, the consensus scoring strategy investigated in this work exhibited impressive results, ranking among the top-three models with the best predictive performances on all cases. The development of the scoring functions implemented in this thesis is a crucial step to make the DockThor an even more competitive program, enabling the development of the high-throughput virtual screening program and portal DockThor-VS. / Atracamento molecular é uma metodologia que tem por objetivo prever a conformação e a afinidade de uma pequena molécula no sítio de ligação do receptor alvo de interesse. É uma abordagem amplamente utilizada pela indústria farmacêutica e pela comunidade acadêmica para identificação e otimização de compostos líderes, contribuindo para a redução de custo, tempo e falhas no desenvolvimento de novos fármacos. As metodologias atuais de atracamento molecular e as funções de avaliação associadas possuem bom desempenho em identificar modos de ligação. Entretanto, a detecção de compostos ativos dentre inativos e a predição acurada da afinidade de ligação ainda são grandes desafios. O programa DockThor, desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa, tem obtido resultados promissores em estudos comparativos com outros programas de atracamento molecular bem estabelecidos e amplamente utilizados pela comunidade científica para a predição de modos de ligação. Apesar de ser bastante útil para predição de poses, a função de avaliação atualmente implementada no DockThor não é adequada para prever afinidade de complexos proteína-ligante, não obtendo correlação com dados experimentais. Neste trabalho, nós desenvolvemos diversas funções de avaliação com características baseadas na física para prever afinidade de ligação de complexos proteína-ligante, treinadas com diversas técnicas de aprendizagem de máquina. As funções de avaliação finais consistem de termos baseados em campo de força relacionados com as interações intermoleculares (potenciais eletrostático e de van der Waals), um termo original para a entropia do ligante (número de ligações rotacionáveis congeladas), dessolvatação do ligante e da proteína e o efeito hidrofóbico. Desenvolvemos então funções de avaliação gerais e específicas para classes de alvos, esta para considerar características específicas associadas com a classe de alvo de interesse, focando em proteases, cinases e complexos de interações proteína-proteína (PPIs). As funções de avaliação foram derivadas utilizando regressão linear (MLR) e sete outras técnicas mais avançadas de aprendizagem de máquina para problemas não lineares. O processo de treinamento e teste foi realizado utilizando conjuntos de dados de alta qualidade compostos de estruturas experimentais de diversos complexos proteína-ligante com dados de afinidade de ligação disponíveis (Kd ou Ki). Adicionalmente, também derivamos funções de avaliação gerais treinadas com resultados do atracamento molecular com o programa DockThor. As funções treinadas com resultados de atracamento obtiveram desempenho promissor quando avaliadas tanto em estruturas experimentais quanto provenientes de atracamento molecular, indicando que elas são confiáveis para serem usadas em experimentos reais de triagem virtual. As funções desenvolvidas neste trabalho demonstraram ser competitivas com as melhores funções de avaliação lineares e não lineares em estudos comparativos descritas na literatura. As funções específicas para classes de alvos também exibiram desempenhos promissores, alcançando significativa melhoria quando utilizando abordagens não lineares comparadas com os modelos lineares. Além disso, a estratégia de avaliação consenso investigada neste trabalho exibiu resultados impressionantes, ficando entre os três melhores modelos com melhores desempenhos preditivos em todos os casos. O desenvolvimento das funções de avaliação implementadas nesta tese é um passo crucial para tornar o programa DockThor ainda mais competitivo, possibilitando o desenvolvimento do programa e do portal de triagem virtual em larga escala DockThor-VS.

Submitted by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-05-04T13:17:54Z No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-05-04T13:18:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T13:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) Previous issue date: 2016-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) / The emergence of clinically important bacteria presenting a wide spectrum of antibiotic resistance represents a global concern. Although bacterial resistance was reported in the literature from the beggining of antibiotic use, early in the 20th century, we currently face the threat of pan-resistance, pathogens that can escape the action of all currently available antibiotic classes. A better understanding of virulence and resistance mechanisms, as well as new therapeutic options, are of paramount importance. This thesis proposal is based on the study of Klebsiella pneumoniae Kp13, a clinical isolate obtained in 2009 during a clonal outbreak in South Brazil which had its complete genome determined by our group. This strain is multidrug resistant and presents high-level resistance against polymyxin B (MIC 32 mg L􀀀1), a \last resort" drug for the treatment of Gram-negative multidrug-resistant bacteria. Using techniques from bioinformatics, transcriptomics (RNA-seq), systems biology and molecular modeling, we sought to better understand the gene expression response in K. pneumoniae in face of changes in abiotic characteristics and polymyxin B exposure. How these factors influence the metabolic repertoire of K. pneumoniae was also object of research. We also aimed to delineate a computational strategy for priorization of metabolic pathways that could serve as new targets for therapeuticals, by integrating expression, metabolic and structural reconstruction data. In parallel, this strategy was also applied to the study of Mycobacterium tubercluosis H37Rv (Mtb), the best characterized strain of this bacteria. E orts were made to study the metabolic complement of this pathogen, identifying important pathways related to its growth and correlating to molecular targets from a structural standview. The transcriptomic analyses allowed the identi cation of novel intracellular targets (such as ArcA-ArcB) that go beyond the \classic" e ect of polymyxin B mode of action, based in membrane interaction, besides drug-induced metabolic modulation which may lead to fermentative pathways of growth. The computational strategy for whole-genome target priorization led to the nding of pathways already known as druggable, such as S-methyl 5'-adenosin, as well as pathways not previously classi ed as druggable, but which could serve as candidates for future development of therapeutical compounds. / A emergência de isolados clínicos bacterianos apresentando resistência a uma ampla gama de medicamentos antibióticos representa uma preocupação global. Embora bactérias resistentes a alguns antibióticos já tenham sido relatadas na literatura médica desde o princípio do uso destas substâncias, no início do século XX, atualmente enfrentamos bactérias ditas panresistentes com capacidade de evadir à ação de todas as classes de drogas hoje disponíveis. O melhor entendimento dos mecanismos de resistência e virulência, bem como o delineamento de novas estratégias para o desenvolvimento de opções terapêuticas alternativas torna-se, portanto, imperativo. A presente proposta de tese de doutoramento tem como objeto de estudo central a bactéria Klebsiella pneumoniae Kp13, isolada no Sul do Brasil em 2009 na ocasião de um surto clonal e cujo genoma foi completamente determinado por nosso grupo. Esta cepa possui resistência multi-droga incluindo polimixina B (MIC > 32 mg L􀀀1), antibiótico considerado de último recurso no tratamento de patógenos Gram-negativos multi-resistentes. Utilizando técnicas de bioinformática, transcritômica (RNA-seq), biologia de sistemas e modelagem molecular, busca-se maior entendimento da resposta da ativação/desativação gênica de K. pneumonia frente a variações do meio e a exposição à polimixina B e como estes infuenciam no repertório metabólico exibido por esta bactéria. Ademais, objetiva-se delinear uma estratégia computacional para priorização de vias metabólicas servir como novos alvos terapêuticos para o controle deste importante patógeno, utilizando uma estratégia que integra os dados de expressão, metabólicos e da reconstrução estrutural. Em paralelo, esta estratégia foi também aplicada ao estudo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Mtb), a cepa mais bem caracterizada desta bactéria. Foi dado um foco no complemento metabólico de Mtb, realizando a reconstrução de vias metabólicas importantes ao seu crescimento, correlacionando-as com alvos proteicos do ponto de vista estrutural. A análise transcritômica permitiu identificar possíveis alvos intracelulares que vão além do efeito “clássico" de ação da polimixina, baseado em interação com a membrana externa, tais como o sistema ArcA-ArcB, al_em de modulação metabólica induzida pelo fármaco, levando ao crescimento fermentativo da bactéria. A priorização de alvos moleculares permitiu identificar vias reconhecidamente drogáveis, tais como o metabolismo de S-metil 5'-adenosina, além de vias anteriormente não identificadas como drogáveis, mas que poderiam servir como candidatos para o desenvolvimento de novos fármacos.

A situação da tuberculose (TB) foi alterada de forma significativa pela síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA ou AIDS) e pelo aparecimento de novas cepas do Mycobacterium tuberculosis resistentes ao tratamento quimioterápico, que justificariam a pesquisa de novos agentes antimicobacterianos. Alvos interessantes têm emergido para o planejamento racional de novos fármacos contra a TB, particularmente, considerando processos metabólicos específicos que ocorrem durante a biossíntese da parede celular micobacteriana e que envolvem a síntese de ácidos graxos (FAS-II, fatty acid synthase). O sistema FAS-II constitui diferença bioquímica importante entre mamíferos e micobatérias. A enzima enoil-acp (acyl carrier protein, proteína acil-carregadora) redutase (ENR) é alvo determinante no sistema FAS-II, responsável pela etapa de alongamento dos ácidos micólicos, que são os principais componentes da parede celular do M. tuberculosis. O presente projeto tem como objetivo a aplicação de metodologias do planejamento de fármacos auxiliado por computador, CADD (Computer-Aided Drug Design), em um conjunto de derivados pirrolidina carboxamidas descritos como inibidores potenciais da ENR do M. tuberculosis (InhA) com intuito de mapear o farmacóforo, investigar a orientação dos ligantes no sítio ativo e os tipos de interações que se estabelecem com os resíduos de aminoácidos do sítio de interação. Inicialmente, investigaram-se as relações quantitativas entre estrutura química e atividade biológica (QSAR, quantitative structure-activity relationships) com aplicação de abordagem multivariada. O melhor modelo QSAR indicou que propriedades estruturais, termodinâmicas e eletrônicas devem ser consideradas no processo de planejamento e proposição de novos protótipos potencialmente tuberculostáticos. / The incidence of tuberculosis (TB) disease has significantly changed considering the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) co-infection as well as the emergence of new Mycobacterium tuberculosis strains resistant to the currently chemotherapy. These facts support the search for novel antimycobacterial agents. Interesting targets have been elucidated and could be used for the rational design of new drugs against TB, primarily those related to specific biochemical metabolic pathways that occur during the cell wall biosynthesis, specially involved in the fatty acid synthase (FAS) system. The FAS-II system is an important biochemical difference between mammals and mycobacteria. The enoyl-ACP reductase (ENR) is the key enzyme in the FAS-II system, responsible for the elongation step of mycolic acids, which are the major components in the M. tuberculosis cell wall. This research project aims the application of computer-aided drug design (CADD) methodologies to a set of pyrrolidine carboxamide derivatives, which were previously reported as potential M. tuberculosis ENR (InhA) inhibitors, for mapping the pharmacophore, investigating the ligands\' orientation at the active site and also the interaction types regarding the amino acid residues in the active site. Initially, the quantitative structure-activity relationships (QSAR) were performed applying a multivariate approach. The best QSAR model indicated the structural, thermodynamic, and electronic properties must be taken into account in the design of novel leads as potential antituberculosis agents.

A conhecida regra do acoplamento em W, que estabelece que núcleos na conformação em W planar exibem valores significativos de constantes de acoplamento através de quatro ligações, tem sido uma ferramenta útil para a determinação estrutural desde o início do uso da RMN para essa finalidade. Muitas configurações e conformações foram decididas com base nessa regra. A contínua evolução do equipamento de RMN, porém, resulta em modificações na qualidade e no número dos dados experimentais obtidos, obrigando os químicos a freqüentes revisões de seus pontos de vista sobre a importância relativa dos dados que podem ser obtidos dos espectros de RMN. O equipamento mais recente tem uma resolução maior e várias características adicionais que obscurecem um pouco os conceitos mais antigos: por um lado, o alto valor informativo de algumas técnicas modernas tais como NOE DIFF e outros métodos multi-dimensionais reduzem a importância das constantes de acoplamento; por outro lado, agora é possível determinar um número muito maior de constantes de acoplamento, devido principalmente à maior resolução. Uma conseqüência natural é que o químico agora pode explorar o uso de desdobramentos sutis em análise conformacional. Como parte de nosso trabalho de pesquisa na síntese de produtos naturais, preparamos há algum tempo um número apreciável de derivados de ciclopentanos. Nossa atenção foi fortemente atraída para certas constantes de acoplamento a longa distância (4JHH) que ocorriam em alguns destes compostos, já que uma conformação W planar não parece ser possível em ciclopentanos. Decidimos então iniciar um estudo mais detalhado dos espectros de RMN desses compostos, com vistas a uma interpretação mais clara dos dados. Inicialmente fizemos as atribuições para todos os hidrogênios, incluindo a estéreo-química de cada um, e medimos todos os valores de J para os compostos; para tanto fizemos extenso uso dos espectros de RMN tanto de 1H (300 MHz)como de 13C (75 MHz), medidas de efeito NOE, etc. Os ângulos entre as ligações e os ângulos diedros (de torção) foram calculados com programas de modelagem molecular; vários programas e métodos diferentes foram usados, para aumentar a confiabilidade. O primeiro resultado obtido é a confirmação de que 4JHH 'diferente' 0 pode ocorrer mesmo em casos em que uma conformação W planar não é possível. Mais importante, porém, é a conclusão de que há uma relação entre os valores de 4JHH e os ângulos diedros envolvidos. O acoplamento entre H1 e H2 ocorre através das quatro ligações 'sigma' definidas pelo caminho H1-C1-C2-C3-H2 e envolve dois ângulos diedros 'teta'1 e 'teta'2. Os valores de 4JHH foram plotados contra (cos2'teta'1 x cos2'teta'2) (uma simples extensão da equação de Karplus); os pontos resultantes não se alinham com perfeição sobre uma curva contínua, mas mostram clara tendência de aumento do valor de 4JHH conforme os ângulos 'teta'1 e 'teta'2 se afastam de 90º e se aproximam de 180º. / The well known W rule, which establishes that nuclei in a planar W arrangement exhibit significant four bond coupling constants, has been a useful tool in molecular structure determination since early times of the use of nmr spectra for this purpose. Many configurations and conformations have been decided based on this rule. The continuous evolution of the nmr equipment, however, produces modifications in quality and number of available experimental data, thus forcing the chemists to frequent revisions of their points of view about the relative importance of the data that can be obtained from nmr spectra. The more recent equipment has a higher resolution and several additional features that throw some shadow over early concepts: on one hand, the high power of modern techniques such as NOE DIFF and other multi-dimensional methods reduce the importance of coupling constants; on the other hand, it is now possible to determine many more coupling constants, due mainly to the higher resolution. A natural consequence is that the chemist can now exploit the use of subtle splittings in conformational analysis. As part of our research work on the synthesis of natural products, we have prepared a number of cyclopentane derivatives. Our attention was strongly attracted to the long-range (4JHH) coupling constants that occurred in some of these compounds, as no planar W conformation seems to be possible in cyclopentanes. We have thus decided to start a more detailed study of the nmr spectra of these compounds, seeking for more clear interpretation of the data. We have first assigned all hydrogens, including the stereochemistry of each hydrogen, and measured all J values for the compounds; for this task we have used nmr spectra both of 1H (300 MHz) and 13C (75 MHz), NOE measurements, etc. Bond angles and dihedral (torsion) angles were calculated with molecular modeling programs; several different programs and methods were used to improve reliability. The first result obtained is a confirmation that a 4JHH 'different' 0 occurs even in cases where a planar W conformation is not possible. More important, however, is the conclusion that there is a correlation between the 4JHH values and the involved dihedral angles. There are two dihedral angles in the path through the bonds between two hydrogens which show 4JHH coupling. When 4JHH values are plotted against(cos2'teta'1 x cos2'teta'2) (a simple extension of Karplus equation) the points are not aligned over a continuous curve, but they show a clear tendency: 4JHH values become higher as the angles 'teta'1 and 'teta'2 vary from 90 to 180º.

A melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos e farmacológicos aliados a métodos modernos de investigação tornaram possível a descoberta e o desenvolvimento de fármacos para diversas doenças e disfunções orgânicas em humanos. Os fármacos desenvolvidos atualmente são resultados de intensos esforços em pesquisa por equipes multidisciplinares, impactando diretamente na qualidade de vida das diversas populações no mundo. Nesse cenário, os grupos de pesquisas estabelecidos em Universidades com foco no planejamento de fármacos para doenças tropicais têm crescido. A Malária e a Doença de Chagas figuram com especial importância, a primeira pela expressiva mortalidade mundial, enquanto a segunda pela morbidade e seus impactos na população brasileira. O tratamento de ambas possui limitações que se agravam, seja pelo baixo número de opções terapêuticas, ou pelo desenvolvimento de cepas resistentes. As enzimas investigadas nesse doutoramento, enolase (PfEnolase) de Plasmodium falciparum e gliceraldeído3fosfato desidrogenase de Trypanosoma cruzi (TcGAPDH), são componentes da via glicolítica destes parasitas e são considerados alvos moleculares atrativos para o desenvolvimento de inibidores enzimáticos, dada a importância destas enzimas no processo de obtenção de energia do parasita. Os estudos fundamentamse na busca por modulação seletiva da atividade biológica dos alvos selecionados através do desenvolvimento de novas moléculas bioativas. O estabelecimento de protocolo de expressão e purificação para enzima Pfenolase permitiu sua obtenção em quantidade e pureza suficiente para condução de estudos cinéticos e de triagem biológica, com a identificação de cinco novas classes químicas bastante promissoras; além de ensaios de cristalização, que culminaram na determinação da enzima em diversos complexos cristalográficos. Os dados estruturais produzidos foram fundamentais para condução da abordagem computacional de triagem virtual, que permitiu a identificação de 31 moléculas candidatas a inibidoras de Pfenolase. Avanços significativos foram obtidos também com a enzima TcGAPDH, destacando-se as adaptações nos processos de obtenção da proteína recombinante e ensaio cinético, condução de ensaio de bioprospecção orientada com a identificação e caracterização da molécula isolada (tilirosídeo). Novas condições de cristalização foram identificadas e poderão ser empregadas no processo de obtenção de complexos cristalográficos futuros. Adicionalmente, desenvolveu-se uma ferramenta computacional, Kinecteasy, para processamento automatizado dos dados produzidos das etapas de triagem biológica. Os trabalhos integrados de biologia estrutural e química medicinal desenvolvidos contribuem significativamente para o avanço no processo de planejamento de novos inibidores para as enzimas selecionadas. / A better understanding of the pathophysiological and pharmacological mechanisms together with the modern research methods made possible the discovery and development of drugs for several humans´ diseases. The drugs currently developed are the result of intense efforts in research of multidisciplinary teams having as a direct consequence a remarkable impact on life quality of populations all over the world. In this scenario, research groups established at universities, with their focus on drug development for tropical diseases, are increasing. Malaria and Chagas disease deserve special attention, the former by the expressive world mortality, while the second by the morbidity and its impact on Brazilian population. Treatment for both has limitations, whether by the low number of therapeutic options, or by development of resistance. The target enzymes for this PhD project, enolase (PfEnolase) of Plasmodium falciparum and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi (TcGAPDH), are essential components of glycolytic pathway and therefore related to the parasite energy production, thus, are considered attractive molecular targets for enzyme inhibitors development. Essentially, the proposed studies seek selective modulation of the target´s biological activity through the development of new bioactive molecules. The expression and purification protocols developed for Pfenolase have allowed us to obtain recombinant protein at suitable yield and purity for conducting screening assays, which has revealed five new chemical classes as Pfenolase inhibitors. Crystallization experiments were successfully conducted and 3D structure were determined for different complexes. Structural data was essential for performing the computational approach of virtual screening, which has allowed us to identify 31 inhibitor candidates for Pfenolase. Significant advances were obtained with TcGAPDH, highlighting the adaptations on recombinant protein protocol and kinetic assay. Assay-guided bioprospecting experiments were successfully performed with identification and characterization of isolated inhibitor (tiliroside). New crystallization conditions were identified and will be employed in future co-crystallization and soaking studies. Additionally, Kinecteasy, a computational tool, were developed for automated data processing of biological screening assays. The structure and medicinal chemistry studies presented here contribute significantly in the process of drug development for the selected enzymes.

O Mal de Alzheimer (MA) foi caracterizado pela primeira vez em 1907 pelo neuropatologista alemão Alois Alzheimer, tendo como sintomas clínicos disfunções cognitivas, fisiológicas, comportamentais, perda de memória, e eventualmente incontinência, demência, acamação e morte. É uma doença neurodegenerativa do sistema nervoso central que costuma afetar, principalmente, indivíduos em faixa etária mais avançada. Este mal é caracterizado microscopicamente pela presença de placas amilóides, que são acúmulos da proteína betaamilóide inter-neurônios, e emaranhados neurofibrilares, formados predominantemente por formas altamente fosforiladas de uma proteína associada aos microtúbulos, Tau, as quais formam massas emaranhadas que consomem o corpo celular neuronal, possivelmente levando à disfunção neuronal e finalmente à morte. MAPK p38? tem sido implicada em dois eventos associados ao MA, fosforilação da Tau e inflamação. MAPK p38? é ativada por uma via de fosforilação dupla em Thr180 e Tyr182. O planejamento de fármacos inibidores de p38? é principalmente focado em pequenas moléculas que competem pelo sítio catalítico do ATP. Aqui, nós utilizamos diferentes técnicas de modelagem molecular e planejamento racional baseado em estrutura e ligantes, tendo como base os inibidores da MAPK p38? descritos na literatura, além das estruturas depositadas no PDB. Como resultado das diferentes abordagens de triagens virtuais utilizadas neste trabalho, tais como \"docking\", farmacóforo, dinâmica molecular, campos de interação molecular, predição de atividade e toxicidade, cálculo de propriedades farmacocinéticas e físico-químicas, foi selecionado um total de 14 compostos que atendem aos critérios adotados de baixa ou nenhuma toxicidade potencial, bom perfil farmacoterapêutico predito, atividades calculadas em valores comparáveis aos obtidos para os compostos de referência, além da manutenção das principais interações observadas para os inibidores mais potentes. Estes compostos podem ser adquiridos para estudos de inibição in vitro frente à enzima MAPK p38?, contribuindo assim na busca de um potencial candidato à fármaco no tratamento do Mal de Alzheimer. / Alzheimer\'s disease (AD) was first characterized in 1907 by the German neuropathologist Alois Alzheimer, whose clinical symptoms includes cognitive, physiological and behavioral dysfunctions, memory loss, eventually incontinence, dementia, and death. It is a neurodegenerative disease of the central nervous system that usually affects individuals group in older age. This is characterized microscopically by the presence of amyloid plaques, which are accumulations of beta-amyloid protein inter-neurons, and neurofibrillary tangles formed predominantly by highly phosphorylated forms of the microtubule-associated protein, tau, which form tangled masses that consume neuronal cell body, possibly leading to neuronal dysfunction and ultimately death. p38? MAPK has been implicated in both events associated with AD, tau phosphorylation and inflammation. p38? MAPK pathway is activated by a dual phosphorylation at Thr180 and Tyr182 residues. The drug design of p38? MAPK inhibitors is mainly focused on small molecules that compete for ATP in the catalytic site. Here, we used different techniques of molecular modeling based on p38? MAPK structure deposited in the PDB and its inhibitors described in the literature. As a result of different virtual screening approaches used in this work, such as \"docking\", pharmacophore, molecular dynamics, molecular interaction fields, activity and toxicity predictions assays, pharmacokinetic properties and physicochemical, was selected a total of 14 compounds that meet these criteria of low or no toxicity potential, good pharmacotherapeutic profile, predicted activities calculated values comparable to those obtained for the reference compounds, while maintaining the main interactions observed for the most potent inhibitors. These compounds should be acquired for in vitro inhibition studies against the enzyme p38? MAPK, thereby helping in the search of a potential drug candidate for the treatment of Alzheimer\'s disease.

Papilomavírus (PVs) são vírus amplamente estudados, sendo enfatizada sua capacidade de infectar os tecidos epitelial e mucoso em diversos animais, incluindo humanos, causando lesões benignas que podem, ocasionalmente, resultar em câncer. Dentre os gêneros que infectam animais, os Deltapapillomavirus têm uma importância veterinária, ecológica e histórica, pois são capazes de infectar seu hospedeiro natural e outros animais. Por isso, esse trabalho contempla todos os tipos virais pertencentes aos Delta-PVs, incluindo sua história. Dentre as proteínas traduzidas pelos PVs, três são consideradas proteínas oncogênicas: E5, E6 e E7. Determinar a estrutura de uma proteína é crucial para a elucidação da sua função, possibilitando aplicações nas áreas de engenharia de proteínas, anotação genômica e desenho racional de fármacos. A estrutura tridimensional da proteína E6 de cada tipo viral pertencente ao gênero Deltapapillomavirus foi determinada por modelagem molecular por homologia. A história evolutiva dessas proteínas foi avaliada com base na geração de árvores filogenéticas e suas propriedades físico-químicas foram analisadas. Além disso, devido ao seu alto grau de conservação, a E6 demonstrou ser útil como um marcador molecular. Apesar de serem consideradas raras, foram observadas lesões papilomatosas em carneiros em uma fazenda do estado de São Paulo. Foi realizado o diagnóstico molecular dessas lesões. Os resultados mostraram pela primeira vez no mundo que, apesar de serem ovinos, o agente causador da papilomatose era um papilomavírus bovino, o BPV2, um Delta-PV. Logo, além de discutir os Delta-PVs, esta tese demonstra na prática a habilidade desse gênero em romper a barreira espécie-específica. / Papillomaviruses (PVs) are widely studied viruses, emphasizing their ability to infect the epithelial and mucosal tissues in several animals, including humans, causing benign lesions that may occasionally result in cancer. Among the genera that infect animals, Deltapapillomaviruses have a veterinary, ecological and historical importance because they are capable of infecting their natural host and other animals. Therefore, this work contemplates all viral types belonging to the Delta-PVs, including their history. Among the proteins translated by the PVs, three of them are considered oncogenic proteins: E5, E6 and E7. Determining the structure of a protein is crucial to the elucidation of its function, allowing applications in the areas of protein engineering, genomic annotation and rational design of drugs. The three-dimensional structure of the E6 protein of each viral type belonging to the genus Deltapapillomavirus was determined by molecular modeling by homology. The evolutionary history of these proteins was evaluated based on the generation of phylogenetic trees and their physicochemical properties were analyzed. In addition, due to its high degree of conservation, E6 has been shown to be useful as a molecular marker. Despite being considered rare, papillomas lesions were observed in sheep on a farm in the state of São Paulo. The molecular diagnosis of these lesions was performed. The results showed for the first time in the world that, despite being ovines, the causative agent of papillomatosis was a bovine papillomavirus, BPV2, a Delta-PV. Thus, in addition to discussing Delta-PVs, this thesis demonstrates in practice the ability of this genre to break the species-specific barrier.

Doenças negligenciadas acometem milhares de pessoas em todo o mundo, principalmente em países subdesenvolvidos. A exemplo destas encontram-se doenças como a leishmaniose e a doença de Chagas que representam relevantes problemas de saúde pública. As terapias disponíveis para estas doenças tropicais, contudo, estão longe de serem satisfatórias e eficazes, considerando-se que os quimioterápicos existentes apresentam reconhecida toxicidade, alto custo e eficácia moderada. Com o propósito de obter alternativas terapêuticas otimizadas, este projeto de pesquisa teve como objetivo a obtenção de pró-fármacos de compostos nitroderivados com comprovada atividade leishmanicida e antichagásica para serem utilizados em sistemas ADEPT visando maior eficácia e menor toxicidade no tratamento destas parasitoses. A princípio, duas frentes de trabalho em paralelo foram adotadas: uma teórica, para determinação do mecanismo catalítico da carboxipeptidase G2 (CPG2) e obtenção de informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos, e a outra sintética, para obtenção dos compostos propriamente ditos. Estudos teóricos de ancoramento e dinâmica molecular da CPG2 com um de seus reconhecidos substratos, o metotrexato, indicaram que o mecanismo de ação proposto para metaloproteases em geral também pode ser aplicado a esta enzima. Informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos também foram obtidas. A rota sintética inicialmente proposta para a obtenção dos pró-fármacos partia da ligação dos nitroderivados ao ácido glutâmico por intermédio de um agente espaçante, o ácido succínico. Com base nas informações obtidas nos estudos teóricos, entretanto, o projeto foi reformulado focando-se na síntese dos pró-fármacos sem agente espaçante, pois estes se mostraram mais favoráveis ao reconhecimento pela enzima. Com relação à síntese, a obtenção dos compostos planejados não foi alcançada a despeito dos esforços empreendidos. Estudos teóricos e experimentais de reatividade parecem comprovar a tese de que o grupo nitro desativa as funções nucleofílicas das estruturas dos nitrocompostos que seriam fundamentais para as reações de acoplamento ao transportador ácido glutâmico. Este achado, contudo, constitui um importante problema a ser solucionado, visto que nitroderivados parecem exercer suas atividades principalmente mediante redução do grupo nitro e produção de espécies reativas de oxigênio nas redondezas dos parasitas. / Neglected diseases affect millions of people around the world for the most part in underdeveloped countries. Leishmaniasis and Chagas disease are example of important public health problems spread through Africa, Asia and Latin America. Unfortunately, currently available chemotherapy to treat these diseases remains ineffective, being the most frequently applied drugs toxic, expensive and of moderate potency. By considering this actual picture and envisioning new therapeutic alternatives, the aim of this work was to design and synthesize potential antichagasic and antileishmanial prodrugs of nitroderivatives to be used in Antybody-Directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT), a drug design approach which results in targeted delivery of the active compounds, increasing their potencies in addition to lowering their toxicity. Theoretical studies to determine the catalytic mechanism of the carboxypeptidase G2 (CPG2) and to obtain information about the cleavage mechanism of proposed prodrugs were performed whereas different synthetic approaches were made to obtain the compounds. Docking and molecular studies of the CPG2 considering theoretical interactions with its known substrate, methotrexate, indicated that the proposed general mechanism for metalloproteases could be indeed applied to this enzyme. Information about the cleavage mechanism of prodrugs was also obtained. Initially prodrugs proposed were composed by nitroderivatives structures attached to glutamic acid, the chosen transporter agent, by a spacer group, the succinic acid. Theoretical studies, however, had showed that prodrugs constructed without a spacer agent could be better recognized by the enzyme. These results re-directed the synthetic approach to new prodrug structure without spacer. Despite all efforts spent, it was impossible to obtain the proposed prodrug structures. Experimental reactivity studies were then accomplished, since it was possible that the nitro group, from nitroderivatives structure, was able to reduce the nucleophilic power of particular functional groups chosen to accomplish the coupling between the active compound and the transporter. The results corroborate this hypothesis and the absence of nitro group facilitates the prodrug synthesis. This, however, constitute an important problem to be solved since the nitroderivative seams to exert their function mainly by nitro group reduction and production of free radical species in the surrounding of the parasites.

Domínio proteico é uma sequência de aminoácidos evolutivamente conservada e funcionalmente independente. Um dos aspectos mais importantes do estudo de uma proteína que contem múltiplos domínios é o entendimento da comunicação, entre os diferentes domínios, e seu papel biológico. Essa comunicação em maior parte é feita pela interação direta entre domínios. A interação poderia ser tratada como uma clássica interação proteína-proteína. Entretanto, proteínas multidomínio possuem restrições determinadas por suas regiões conectoras. Os conectores interdomínio impõem restrições e limitam espaço conformacional dos domínios. Apresentamos aqui o MAD, uma rotina capaz de obter modelos tridimensionais de alta resolução para proteínas, contendo qualquer número de domínios, a partir de sua sequencia primária. Os domínios conservados são identificados utilizando a base de domínios conservados (CDD) e seus limites são utilizados para definir as regiões conectoras. É criado um ensamble de possíveis dobramentos dos conectores e sua distribuição de distâncias C/N-terminais são utilizadas como restrição espacial na busca pela interação entre os domínios.Os modelos dos domínios são obtidos por uma modelagem comparativa. Foi implementada uma heurística, capaz de lidar com a natureza combinatorial dos múltiplos domínios e com a necessidade imposta pela limitação computacional de realizar o docking dos domínios em forma de pares. Todas combinações de domínios são submetidas as rotinas de docking. Aplica-se filtro de distância e energético, excluindo as conformações que apresentam distância C/N-terminal entre domínios maior do que o valor máximo observado no ensamble de conectores e seleciona as conformações energeticamente mais favoráveis. As conformações são submetidas a uma rotina de agrupamento hierárquico baseada em sua similaridade estrutural. Para a segunda fase as conformações selecionadas são pareadas com seu domínio complementar e ressubmetidas a rotina de docking até que todas as fases tenham sido completadas. Foi criado um conjunto de testes a partir do Protein Data Bank contendo 54 proteínas multidomínio para que a rotina de docking do MAD fosse comparada com outros softwares utilizados pela comunidade cientifica, mostrou-se superior ou equivalente aos métodos testados. A capacidade de utilizar dados experimentais foi demostrada através da proposição de um modelo da forma ativa da enzima tirosina fosfatase 2, nunca observado experimentalmente. A rotina de docking foi expandida paralelamente em uma aplicação standalone e utilizada na resolução de diversos problemas biológicos. Concluímos que a inovação metodológica proposta pelo MAD é de grande valia para a modelagem molecular e tem potencial de gerar uma nova perspectiva a respeito da interação de proteína multidomínio, visto que é possível analisar essas proteínas em sua plenitude e não como domínios separados. / Protein domain is an evolutionary conserved and functionally independent amino acid sequence. One of the most important aspects of the study of a protein that contains multiple domains is the understanding of communication between the different areas, and their biological role. This communication is made mostly by direct interaction between domains. The interaction could be treated as a classical protein-protein interaction. However, multidomain proteins have certain restrictions for its connector regions. The intra connectors impose restrictions and limit conformational space of the domains. We present the MAD, a routine able to get three-dimensional models of high-resolution protein, containing any number of domains, from its primary sequence. The conserved domains are identified using the basic conserved domains database (CDD) and its boundaries are used to define the connector regions. This creates a ensemble of possible folding of the connectors and distribution of distances C/N-terminals are used as spatial restriction in the search for interaction between domains.Os models of the domains are obtained by comparative modelling. A heuristic able to handle the combinatorial nature of the multiple areas and the need imposed by the computer to perform the limitation of the docking areas as pairs was implemented. All combinations of domains are referred to the docking routines. Distance and energy filters are applied, excluding conformations that have C/N-terminal domains distances larger than the maximum value observed in the connectors ensemble and selects the most favourable energy conformations. Conformations are subjected to hierarchical clustering routine based on their structural similarity. For the second phase, the selected conformations are paired with its complementary domain and resubmitted to the docking routine until all phases have been completed. A test set has been created from the Protein Data Bank containing 54 multidomain proteins so that the docking routine of MAD could be compared with other software used by the scientific community, it has been shown to be superior or equivalent to the tested methods. The ability to use experimental data was demonstrated by proposing a model of the active form of tyrosine phosphatase enzyme 2, never observed experimentally. The docking routine was expanded in a standalone application and used in solving various biological problems. We conclude that the methodological innovation proposed by the MAD is very useful for molecular modelling and has the potential to generate a new perspective on multidomain protein interaction as you can analyse these proteins in its entirety and not as separate domains.