Les infections ostéo-articulaires (IOA) regroupent plusieurs entités cliniques hétérogènes ayant en commun l'invasion et la destruction progressive des tissus osseux et cartilagineux par un ou plusieurs micro-organismes. Le genre Staphylococcus, impliqué dans plus de 65% des IOA, représente la première étiologie dans ces infections particulièrement sévères et difficiles à traiter. Les Staphylococcus non-aureus (SNA) incluant des espèces tels que Staphylococcus epidermidis sont responsables de près de 40% de certaines formes cliniques notamment les IOA sur matériels. Contrairement à S. aureus, pour lequel les mécanismes physiopathologiques incluent : (i) la capacité d'internalisation dans les cellules de l'hôte et (ii) la formation de biofilm, peu de données sont disponibles concernant ceux impliqués dans les IOA dues aux SNA. Dans ce contexte, mon travail de doctorat s'est attaché à caractériser les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la genèse des IOA causées par différentes espèces de SNA. A l'aide d'une approche in silico puis in vitro conduite dans un modèle d'invasion d'ostéoblastes humains, nos travaux ont mis en évidence une capacité d'internalisation et de persistance dans les cellules osseuses pour seulement deux espèces (S. pseudintermedius et S. delphini) sur les 17 testées. De façon similaire à S. aureus, le processus d'invasion cellulaire pour ces espèces fait intervenir une liaison tripartite entre les adhésines bactériennes liant la fibronectine (FnBPs), la fibronectine de la matrice extracellulaire et l'intégrine cellulaire α5β1. Un autre point essentiel de ce travail est la mise en évidence du phénotype hautement cytotoxique de l'espèce S. pseudintermedius après internalisation dans les cellules hôtes. Nous démontrons ici que cette cytotoxicité est, au moins en partie, médiée par une action combinée de (i) la leucocidine Luk-I (toxine homologue de la leucocidine Panton-Valentine de S. aureus) qui cible spécifiquement les cellules immunitaires exprimant le récepteur CXCR2 (récepteur 2 à l'interleukine 8) et (ii) les phénol-soluble modulins (PSMs) qui perturbent les membranes des cellules immunes et non immunes. Sachant que les SNA sont les agents infectieux les plus incriminés dans les IOA sur matériel, une technique d'étude du biofilm sur biomatériaux orthopédiques (acier inoxydable, titane et polyéthylène) a été mise au point pour étudier le biofilm mature formé par les six espèces SNA les plus prévalentes dans les IOA (S. epidermidis, S. lugdunensis, S. heamolyticus, S. warneri, S. caprae, S. capitis). A l'exception de S. epidermidis qui forme plus de biofilm sur le polyéthylène, constituant placé à l'interface des pièces métalliques et/ou des os dans les prothèses orthopédiques, aucune différence significative n'a été observée entre les trois biomatériaux orthopédiques pour l'ensemble des espèces de SNA testées. Néanmoins, nos observations indiquent une forte hétérogénéité au sein des SNA en matière de capacité à former un biofilm mature. Les espèces telles que S. capitis et S. lugdunensis se distinguent significativement de S. haemolyticus et S. warneri par leurs aptitude à former plus de biofilm. La grande diversité des phénotypes observés vis-à-vis des mécanismes physiopathologiques impliqués lors des IOA par les différentes espèces de SNA testées démontre qu'il ne faut pas considérer les SNA comme une entité clinique unique. L'amélioration des connaissances apportées au cours de ce travail devraient contribuer à l'optimisation de la prise en charge chirurgicale, médicale, et thérapeutique des patients / Bone and joint infections (BJI) include several heterogeneous clinical entities that share the invasion and the progressive destruction of bone and cartilage tissue by one or more microorganisms. The genus Staphylococcus, involved in over 65% of the BJI, represents the first etiology in these particularly severe and difficult-to-treat infections. Staphylococcus non-aureus (SNA), including species such as Staphylococcus epidermidis, are responsible for nearly 40% of some clinical forms, including device-associated BJI. In contrast to S. aureus, for which pathophysiological mechanisms include (i) internalization capacity in host cells and (ii) biofilm formation, few data are available regarding those involved in BJIs due to SNA. In this context, my PhD work focused on characterizing the pathophysiological mechanisms involved in the genesis of BJI caused by different SNA species. Using an in silico together with an in vitro approach conducted in a human osteoblast invasion model, our work revealed an ability to internalize and persist in bone cells for only two species of SNA out of the 17 tested. Indeed, we have been able to demonstrate that only S. pseudintermedius and S. delphini have the ability to invade the cytoplasmic compartment of the host cells. Similar to S. aureus, the cellular invasion process for these species involves a tripartite association between bacterial adhesins fibronectin-binding proteins (FnBPs), fibronectin of the extracellular matrix, and α5β1 cell integrin. Another key point of this work is the demonstration of the highly cytotoxic phenotype of the S. pseudintermedius species after internalization in the host cells. We demonstrate here that this cytotoxicity is, at least in part, mediated by a combined action of (i) the Leukocidin Luk-I (homologous to S. aureus Panton-Valentine Leukocidin) that specifically targets immune cells expressing the CXC chemokine receptor 2 (CXCR2) with (ii) phenol-soluble modulins (PSMs) that disrupt the membranes of immune and non-immune cells. Knowing that SNA are the most incriminated infectious agents in device-associated BJI, a technique for studying biofilm on orthopedic biomaterials (stainless steel, titanium and polyethylene) has been developed to study the mature biofilm formed by the six SNA species with the highest prevalence in BJI (S. epidermidis, S. lugdunensis, S. heamolyticus, S. warneri, S. caprae, S. capitis). With the exception of S. epidermidis, which forms more biofilm on polyethylene (constituting at the interface of metal parts and / or bone in orthopedic prostheses), no significant difference was observed between the three orthopedic biomaterials for all the SNA species tested. The great diversity of phenotypes observed with respect to the pathophysiological mechanisms involved in BJI by the different SNA species tested demonstrates that SNA should not be considered as a single clinical entity. Improved knowledge provided during this work should contribute to the optimization of the surgical management, medical and therapeutic patient

Staphylococcus aureus est capable d’être internalisé par les cellules eucaryotes, notamment au cours des infections osseuses, puis d’induire la mort de la cellule. Deux principaux mécanismes ont été décrits comme associés à la cytotoxicité de S. aureus : l’échappement phagosomal et le détournement de l’autophagie. Nous avons exploré ces deux mécanismes et le rôle de plusieurs toxines staphylococciques majeures (alpha-toxine (Hla), phenol-soluble modulins (PSM), bêta-toxine (Hlb)) dans la mort cellulaire, grâce à un modèle in vitro d’infection intracellulaire et des mutants isogéniques. L’échappement phagosomal nécessitant l’expression d’Hlb, inactivée par l’insertion d’un phage chez la majorité des souches cliniques, nous avons testé l’hypothèse d’une excision de ce phage induite par le stress intracellulaire. Nous avons montré que la restauration de l’expression d’Hlb par excision du phage existe de manière spontanée mais n’est pas induite par le passage intracellulaire et n’est pas associée à une hausse de la cytotoxicité. Dans un second temps, nous avons exploré la cytotoxicité d’une souche de S. aureus hypervirulente et avons montré qu’elle est associée à un détournement de l’autophagie via l’inhibition de la fusion autophagosome-lysosome, ceci étant associé à l’expressions des PSMa. Au contraire, Hla, les PSMß et la d-toxine ne semblent jouer aucun rôle intracellulaire chez les S. aureus hypervirulents. Enfin, nous avons mis en évidence que, dans un autre fond génétique de S. aureus, associé au pied diabétique, la cytotoxicité est principalement liée à la capacité de multiplication intracellulaire de la souche, modulée par la présence d’un phage / Staphylococcus aureus is able to invade eukaryotic cells, in particular during bone infections, and induce cell death. Two mechanisms have been described as associated with S. aureus cytotoxicity: phagosomal escape and autophagy subversion. We investigated these two mechanisms and the respective roles of several staphylococcal toxins, alpha-toxin (Hla), phenol-soluble modulins (PSMs) and beta-toxin (Hlb), in cell death, using an in vitro intracellular infection model and isogenic mutants of S. aureus. Because Hlb is required for phagosomal escape but this toxin is inactivated by a prophage inserted into the hlb gene in most of clinical isolates of S. aureus, we tested the hypothesis of an excision of this phage induced by intracellular stress. We showed that restoration of Hlb expression due to the excision of hlb-converting phage exists spontaneously but is not induced by intracellular environment and does not increase the cytotoxicity of the strain. In a second part, we explored the cytotoxicity of an hypervirulent strain of S. aureus and demonstrated that it is associated with a subversion of host cell autophagy via an inhibition of autophagosome-lysosome fusion, in a PSMa-dependent manner. Conversely, Hla, PSMß and d-toxin appear to have no intracellular role in the cytotoxicity of hypervirulent S. aureus strains. Finally, we showed that, in another genetic background of S. aureus associated with diabetic foot ulcer, cytotoxicity was linked to the ability of intracellular replication of the strain, which was modulated by the presence of a phage

Staphylococcus aureus est une bactérie Gram positive qui colonise la peau des animaux et des humains sains. Dans certaines conditions, telles que la perturbation du microbiote, S. aureus peut induire différentes maladies en déjouant les fonctions de défenses de la cellule hôte. Récemment, notre équipe a montré que les S. aureus méthiciline-résistant (MRSA) souche MW2 (USA400) étaient capables d’induire un retard de la transition de phase G2/M des cellules HeLa. Dans ce travail, nous avons démontré que cette action est initiée par des composants du surnagent de culture de S. aureus.Différentes fractions de surnagents de culture de MW2 ont été obtenues par la chromatographie d’exclusion et analysées par la spectrométrie de masse. Ces techniques nous ont permis d’identifier les peptides phenol-soluble modulins alpha (PSMa) comme responsables du retard du cycle cellulaire des cellules hôtes. Confirmant l’implication de ces modulines, la souche LAC¿psma déficiente en PSMa 1 – 4, n’a pas affecté la progression normale du cyle cellulaire de cellules epitheliales HeLa. De plus, le traitement de ces cellules avec des PSMa1 et PSMa3 synthétiques a induit un retard de la transition de phase G2/M qui a été associé à la diminution de l’expression de gènes codant des défensines ß. Enfin, nous avons démontré que la souche MW2 diminue le niveau d’optineurine et d’optineurine phosphorylée sur la sérine-177, une protéine hôte qui est impliquée dans la transition de phase G2/M. Ce travail représente une étape importante de la compréhension du mécanisme d’interférence de S. aureus / Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium that colonizes the skin of healthy animals and humans. In certain conditions, including the disruption of the commensal microbiota, S aureus can cause different diseases by deviating the host defense functions. Recently, our group has shown that the methicillin-resistant S. aureus (MRSA) MW2 (USA400) strain causes delay in the transition of the G2/M phase of HeLa cells. In the present work, we demonstrated that this action is initiated by components of the supernatant of the S. aureus culture. Different supernatant fractions were obtained by size exclusion chromatography and were analyzed by mass spectrometry, which allowed to identify phenol-soluble modulins alpha (PSMa) as responsible for the host cell cycle delay.Confirming the involvement of these modulins in the delay, the MRSA LAC¿psma strain, which is deficient in PSMa1–4, did not affect the normal progression of the cycle in HeLa cells. In addition, the treatment of these cells with synthetic PSMa1 and PSMa3 caused delay in the transition of the G2/M phase associated with the decreased production of host ß-defensins. Lastly, we demonstrated that the MW2 strain, which produce PSMa, decreases the level of optineurin and optineurin phosphorylated at serine 177, a host protein that is involved in the G2/M phase transition. The work conducted in this thesis represents an important achievement in the understanding of how S. aureus interferes with the host cell cycle, revealing a new role for PSMa produced by this bacterium.

L’invasion des ostéoblastes par Staphylococcus aureus (SA) est considérée comme responsable, au moins partiellement, de l’évolution chronique ou récurrente des infections osseuses (IO). Nous avons émis l’hypothèse que des différences d’interactions SA-ostéoblastes pouvaient être associées aux différences de présentation clinique des IO. Nous avons d’abord développé un modèle ex vivo d’infection intracellulaire d’ostéoblastes humains permettant de quantifier l’adhésion, l’invasion, la survie intracellulaire de SA et les dommages subis par les cellules infectées. Grâce ce modèle, nous avons montré que les SA communautaires résistants à la méticilline (CA-MRSA), un groupe polyphylétique de souches hypervirulentes associées à des formes aiguës et sévères d’IO, induisent une cytotoxicité supérieure à celle des MRSA hospitaliers (HA-MRSA) associés à des IO plus souvent chroniques. A l’aide de mutants isogéniques, nous avons pu démontrer que cette cytotoxicité était indépendante de la toxine de Panton-Valentine et l’alphahémolysine mais associée à la surexpression des phenol-soluble modulins (PSM) par les CA-MRSA. Ces résultats ont permis d’identifier un nouveau mécanisme de virulence des CA-MRSA basé sur l’invasion des ostéoblastes et l’activité intracellulaire des PSM. Parallèlement, nous avons montré que certains antibiotiques modifient le niveau de transcription et d’expression des protéines staphylococciques impliquées dans l’invasion des ostéoblastes, sans que nous ne puissions montrer une modification de la capacité d’invasion de S. aureus dans ce même modèle ex vivo. Nos travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension et la prise en charge des IO due à SA / Osteoblast invasion by Staphylococcus aureus (SA) is currently considered a putative explanatory mechanism for the chronic or recurrent nature of osteomyelitis. We raised the hypothesis that inter-strain differences in the interactions between S. aureus and osteoblasts at the cellular level could correlate with differences in the clinical presentation of osteomyelitis. We first developed an ex vivo model of intracellular bacterial challenge of human osteoblasts to quantify SA adhesion, invasion and intracellular survival as well as SA-induced damage to infected cells. By means of this model, we have demonstrated that community-acquired methicillinresistant SA (CA-MRSA) strains, which belong to a polyphyletic group endowed with high virulence and are associated with severe and acute forms of osteomyelitis, induce more cytotoxicity in osteoblasts as compared to hospital MRSA strains, which in turn are more frequently involved in chronic forms of osteomyelitis. Using isogenic CA-MRSA mutants, we determined that SA-induced osteoblast damage was independent of the production of Panton-Valentin leukocidin and alpha-toxin, but was associated with the overexpression of phenol-soluble modulins (PSMs) by CAMRSA. These findings elucidate a novel virulence strategy of CA-MRSA based on the invasion and PSM-related killing of osteoblasts. In parallel to this research, we demonstrated that several antibiotics alter the transcription and expression levels of SA adhesins involved in osteoblast invasion. However, antibiotics did not induce changes in SA invasiveness in our ex vivo infection model. Collectively, our findings provide new insights into the pathogenesis of SA osteomyelitis

S. aureus est un pathogène majeur de l’Homme capable de produire une grande variété de facteurs de virulence tels que les phénol-solubles modulines alpha (PSM) et l’hémolysine delta (Hld). La transmission de S. aureus est essentiellement manu-portée mais les éléments favorisant sa dissémination dans la population restent inconnus. Les mastocytes étant connus pour libérer des médiateurs pruritogènes, nous avons suspecté leur implication dans la physiopathologie et la transmission des infections cutanées staphylococciques. Sur une lignée de mastocytes humains, l’Hld et les PSM1, montrés pour être produits in vivo, déclenchaient la libération de tels médiateurs. Chez S. aureus, la production des toxines est sous la dépendance du système de régulation globale Agr. Les souches de S. aureus appartenant au type Agr1, produisant significativement plus d’Hld et de PSM que les autres souches, ont été les plus fréquemment retrouvées au cours de l’année 2017 dans les infections cutanées staphylococciques. Ceci corrobore l’hypothèse selon laquelle une souche de S. aureus produisant des toxines capables d’interagir avec les mastocytes et induisant un prurit, diffuse plus facilement dans la population. Nous avons ensuite étudié la modulation de l’expression des PSM et d’Hld par des concentrations sub-inhibitrices d’antibiotiques. L’oxacilline induisait une inhibition de l’expression des PSM et d’Hld alors que la clindamycine entraînait plus fréquemment une induction de leur expression. Ces observations nous ont interrogé sur l’utilisation de la clindamycine considérée habituellement comme anti-toxinique et sur l’effet bénéfique ou délétère de l’effet inhibiteur de l’oxacilline / S. aureus is a major human pathogen able to produce several virulence factors such as phenol-solublemodulins alpha (PSMalpha) and delta hemolysin (Hld). S. aureus is essentially spread through hand butthe elements promoting its spreading stay unsolved. Mast cells release several soluble mediatorstriggering itching behavior. We suspect the mast cell involvement in spreading of S. aureus strains andin physiopathology of staphylococcal skin infections. Upon human mast cell line, we showed thatPSMalpha1 and Hld induced the release of mediators triggering itching behavior. Moreover, these toxinswere produced in vivo during staphylococcal skin infections. Expression of staphylococcal virulencefactors is regulated by global regulatory system Agr. Interestingly, we observed that S. aureus strainsbelonging in Agr1 produced higher quantity of PSMalpha and Hld than those belonging to Agr2 and Agr3,and were more frequently responsible to skin infections during the last year. This observation supportsour hypothesis whereby a strain producing toxins able to trigger mast cell mediator inducingscratching behavior, spreads electively in the community. Thereafter, we studied modulation of PSMalphaand Hld expression by sub-inhibitory concentration of antibiotics. We reported that oxacillin inducedan inhibitory effect on PSMalpha and Hld expression, while clindamycin resulted in more frequently aninducer effect. These results are discordant with these observed with Panton-Valentine leucocidin andalpha hemolysin and interrogate on clindamycin use for its anti-toxin activity and on benefic ordeleterious effect of oxacillin inhibitory effect