L’oestradiol joue un rôle important dans la reproduction en général, particulièrement dans la croissance folliculaire chez la vache. La production de l’œstradiol nécessite l’expression du gène CYP19A1 suite à la stimulation des cellules de granulosa par l’hormone folliculostimulante (FSH) ou le facteur de croissance insulinique de type 1 (IGF-1). Chez la vache, il existe six promoteurs (1.1 ; 1.2 ; 1.3 ; 1.4 ; 1.5 et 2) qui dirigent la transcription du gène CYP19A1 dans les cellules de la granulosa. Le principal promoteur qui dirige la transcription au niveau de l’ovaire (cellules de granulosa) est le promoteur 2 (P2). Cependant, l’effet de la FSH et de l’IGF-1 sur l’activation de ces promoteurs d’aromatase demeure mal connu. De plus, la demi-vie du transcrit CYP19A1 est très courte avec une région 3’UTR relativement longue. L’analyse de la séquence 3’UTR montre la présence des motifs ARE (séquence riche en AU), des études antérieur montrent que ces séquences impliquent dans la régulation de la stabilité ou la dégradation de l’ARNm, ce qui est fort probable que la courte demi-vie de l’ARNm CYP19A1 est sous le contrôle post-transcriptionel. L’objectif de la thèse visait à étudier la régulation de l’expression du gène CYP19A1 chez la vache. Il y a deux thèmes soit étude de la régulation transcriptionnelle ciblant le promoteur et soit étude de la régulation post-transcriptionnelle impliquant la région 3’non traduite (3’UTR). Le premier objectif vise à étudier la régulation transcriptionnelle du gène CYP19A1. Nous avons étudié l'activité du promoteur ovarien bovin dans deux modèles de cellules de la granulosa, les cellules lutéinisées et nonlutéinisées in vitro, suite à une stimulation des cellules par la FSH ou IGF-1. Nous avons également évalué la voie de signalisation impliquée dans la régulation des différents promoteurs en utilisant un RT-PCR et un gène rapporteur (les différents promoteurs d’aromatase ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en amont du gène exprimant la luciférase). Les résultats de RT-PCR démontrent que la FSH et l’IGF-1 augmentent les concentrations d’ARNm provenant des deux promoteurs 2 et 1.1 dans les cellules de la granulosa non lutéinisées. Des expériences subséquentes ont montré que la FSH stimule le promoteur 2 via la voie PKA tandis que l'IGF-1 stimule le promoteur 2 via la voie PKC. La FSH et l’IGF-1 stimulent l’expression du promoteur 1.1 via la voie PI3K. L’analyse de l’activité luciférase démontre que dans les cellules de granulosa lutéinisées, la FSH stimule le promoteur 1.1 de façon dose dépendante et ne semble y avoir aucun effet significatif sur le promoteur 2. Nous avons donc comparé l’activité du promoteur PII/P2 humain, du rat, de la chèvre et de la vache dans les cellules de granulosa bovine lutéinisées. Le résultat le plus significatif est que le promoteur 2 bovine (et caprine) dépend de plusieurs facteurs de transcription (NR5A2, FOXL2) comparé au promoteur PII humain et celui du promoteur proximal du rat qui dépendent principalement de l'AMPc. En effet, nos résultats ont démontré une expression raisonnablement robuste du P2 bovine lorsque les cellules sont traitées à la forskoline, NR5A2 et FOXL2. Le facteur FOXL2 semble déterminer l'activité du promoteur 2 chez le ruminant. Le deuxième objectif vise à étudier la régulation post-transcriptionnelle du gène CYP19A1. Pour ce faire, nous avons déterminé la séquence minimale de l'ARNm CYP19A1 requise pour la régulation de sa demi-vie. Différents séquences de la région 3’UTR ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en aval du gène exprimant la luciférase ou soit dans le vecteur pGEMTeasy. Le vecteur pGL3promoter a été transfecté dans les cellules de granulosa lutéinisées pour évaluer l'impact de la séquence 3'UTR sur l'expression du gène rapporteur de la luciférase, alors que le vecteur pGEMTeasy a été utilisé pour la transcription in vitro afin de générer de l’ARNm. Ce dernier sera utilisé en réaction croisée au UV avec des extraits protéiques pour démontrer l’association du complexe ARNm/protéine. L’analyse de l’activité luciférase a permis d’identifier une séquence de 200 pb située entre 926 et 1134 pb de la région 3'UTR de l’ARNm CYP19A1 qui a réduit significativement l’activité de la luciférase. Selon les analyses de la réaction croisée au UV, une ou plusieurs protéines de 66 et 80 kDA se lient spécifiquement à la séquence de 200 pb qui réduit l’activité de luciférase. Cette protéine s'exprime dans les cellules de granulosa, mais n’a pas été détectée dans d'autres tissus comme le foie et le cœur. Par ailleurs, l’utilisation du gène rapporteur sensible à la FSH a suscité l’intérêt d'une compagnie pharmaceutique qui vend de l’equine chorionic gonadotropin (eCG) pour lui permettre de distinguer facilement l’eCG ayant une forte activité FSH et donc, avoir un produit commercial plus efficace et de meilleure qualité. Dans cette étude, nous avons développé un système de bioessai à la FSH basé sur la transfection des cellules avec un récepteur à la FSH et un gène rapporteur colorimètrique qui permet d’estimer l’activité de la FSH dans le sérum de la jument et qui pourrait être applicable au niveau de la ferme/industrie. / Oestradiol plays an important role in reproduction in general, particularly during follicular growth. Production of estradiol requires the expression of CYP19A1 following stimulation of granulosa cells by follicle-stimulating hormone (FSH) and insulin like growth factor-1 (IGF-1). In cows, there are six promoters (1.1, 1.2, 1.3, 1.4 and 1.5 and 2) that direct transcription of CYP19A1, and promoter 2 (P2) is the major promoter used in granulosa cells. However the effect of FSH and IGF-1 on the activation of these promoters of aromatase remains unclear. Further, the CYP19A1 gene has a very short half-life and a long 3' non-translated region (3'UTR) that suggests post-transcriptional as well as transcriptional regulation. The aim of my PhD project is to study the regulation of the CYP19A1 gene in the cow. This summary is divided into two parts, the transcriptional regulation involving the promoter region and the post-transcriptional regulation involving the 3'UTR. The first part of my project was to study the transcriptional regulation of CYP19A1 gene; we measured the expression of the different promoters in luteinized or nonluteinized bovine granulosa cells following stimulation of cells with FSH or IGF-1. The results of RT-PCR showed that FSH and IGF-1 increases mRNA levels from both promoters 2 and 1.1 in non luteinized granulosa cells. Subsequent experiments showed that FSH stimulates the promoter 2 via the PKA pathway and IGF-1 stimulated promoter 2 via the PKC pathway. FSH and IGF-1 stimulate the expression of 1.1 via the PI3K pathway. In subsequent studies in luteinized cells with luciferase reporter genes driven by the specific CYP19A1 promoters, FSH stimulated promoter 1.1 in a dose dependent manner but that promoter 2 was weakly activated and not responsive to FSH. We then compared the activity of human, rat, goat and bovine promoters in luteinised bovine granulosa cells. The most significant result is that the bovine (and caprine) P2 depends on several transcription factors (NR5A2, FOXL2) whereas the human and rat promoters largely depend on cAMP. In fact, these data demonstrate a reasonably robust expression of the bovine P2 when treated with forskolin, NR5A2 and FOXL2. FOXL2 appears to be a determinant of promoter activity in ruminants. The second part of my project was to study the post-transcriptional regulation of the CYP19A1 gene. The objective was to identify the elements required for the regulation of the half-life of CYP19A1 mRNA. To do so, we generated and inserted different fragments of the 3'UTR region of CYP19A1 mRNA in the pGL3promoter vector downstream of the luciferase gene, which was then transfected into luteinized granulosa cells to assess the impact of the 3'UTR sequence on the expression of luciferase reporter gene. We identified a sequence of 200 bp between 926 and 1134 bp of the 3'UTR region of CYP19A1 mRNA that significantly reduced luciferase activity. The same fragments were inserted into the pGEMTeasy vector for in vitro transcription and the generation of mRNA for UV crosslinking with protein extracts to demonstrate the presence of mRNA/protein complexes. We detected protein complexes of 66 and 80KDA that specifically bound to the 200 pb probe. This protein is expressed in granulosa cells but not in other tissues such as the liver and heart. The use of reporter gene attracted the interest of a company producing equine chorionic gonadotropin (eCG), and an interest was expessed in developing this system to measure the FSH-like bioactivity in eCG, and therefore have a more effective commercial product. In this study, we developed a FSH bioassay system based on the transfection of cells with an the FSH receptor and a colorimetric reporter gene to estimate the activity of FSH in the serum of the mare ; these results may be applicable at the farm / industry.

Le facteur de transcription p53 joue un rôle crucial dans la suppression de tumeurs et dans la sénescence cellulaire. Selon la littérature, l’ARN messager de p53 contient deux sites d’entrée interne des ribosomes (IRES), un dans la région 5’ non-traduite et l’autre au début de la région codante. L’utilisation de ces IRES devrait activer la synthèse de p53 en conditions de stress, comme dans la sénescence. Notre but était d’identifier les éléments-clés qui contrôlent l’activité des IRES de p53 et d’étudier leur comportement dans la sénescence. Nous avons construit des vecteurs bicistroniques à deux luciférases contenant le gène de la Renilla (Rluc), traduit via le mécanisme classique coiffe-dépendant, une région intercistronique, contenant une des séquences IRES de p53, et le gène de la luciole (Fluc), dont la traduction dépend de cet IRES. L’activité IRES a été évaluée par le rapport des activités Fluc/Rluc dans des extraits cellulaires de HEK293T et de fibroblastes primaires humains. Nous avons inséré une structure précédant l’IRES évitant qu’une translecture ou une réinitiation de la traduction puisse conduire à la synthèse de Fluc. Nous avons vérifié l’absence de promoteur cryptique dans les IRES et nous avons construit des vecteurs contenant la séquence complémentaire inversée (SERI) des IRES. Nous avons observé que l’efficacité de traduction via les IRES de p53 ou les séquences SERI est semblable. De plus, la traduction de Fluc via les présumés IRES de p53 ne représente qu’environ 1% de la traduction de Fluc via une initiation coiffe-dépendante. L’activité des prétendus IRES ne semble pas augmenter en conditions de sénescence. Enfin, nous avons introduit une région structurée dans la région 5’UTR du messager bicistronique. Cette structure a bloqué la traduction coiffe-dépendante mais aussi la traduction IRES-dépendante. L’ensemble de nos résultats nous conduit à affirmer que l’ARN messager de p53 ne contient pas d’IRES et nous suggérons que la faible activité Fluc observée résulterait d’un épissage cryptique conduisant à l’apparition d’un messager dont la traduction génère une portion de Rluc fusionnée à Fluc. Nos résultats sont en accord avec des données rapportées dans la littérature démontrant que l’existence de la plupart des IRES cellulaires est contestée. Un ensemble de contrôles rigoureux doit être appliqué à l’étude de tout IRES présumé avant d’affirmer son existence. Le système à deux luciférases, considéré comme le modèle de choix pour l’étude des IRES, peut en fait révéler diverses anomalies de l’expression des gènes. / p53 is a transcription factor that plays a crucial role in tumor suppression and cellular senescence. According to the literature, the p53 mRNA contains two internal ribosome entry sites (IRES), one in the 5’ untranslated region and the other one at the beginning of the coding region. The two IRES should enable the synthesis of p53 to occur under stress conditions, such as senescence. The aim of our study was to identify the key elements that control the activity of the two p53 IRES and to study their behavior in senescence. We constructed two dicistronic vectors containing the Renilla luciferase gene (Rluc), which is translated in a classical cap-dependent manner, an intercistronic region containing one of the two IRESs sequences of p53, and the firefly luciferase gene (Fluc), whose translation depends on the IRES in the intercistronic region. The IRES activity was assessed by the ratio between the two luciferase activities (Fluc/Rluc) in cell extracts from HEK293T and primary human fibroblasts. We also inserted a structure preceding the IRES sequence that prevented readthrough or translation reinitiation, which could lead to Fluc synthesis. We verified the absence of cryptic promoter in the two IRES sequences. We also constructed vectors containing the reverse complement region of each of the two p53 IRES (called SERI). We found that the efficiency of translation of Fluc via IRES sequences or via SERI sequences is similar. In addition, the level of Fluc translated via the presumed p53 IRES represents only 1% of the level of Fluc translated in a cap-dependent manner. The activities of so-called IRES of the p53 messenger do not increase in senescent human fibroblasts. Finally, the introduction of a structured region in the 5'UTR of the dicistronic messenger repressed not only the cap-dependent translation of Rluc but also the IRES-dependent translation of Fluc. Our results lead us to conclude that the p53 messenger does not contain any IRES and suggest that the low Fluc activity observed results from a cryptic splicing producing a messenger whose translation generates a portion of Rluc fused to Fluc. Our results are consistent with data reported in the literature showing that the existence of most cellular IRES is disputed. A set of stringent controls must be applied to the study of any presumed IRES before asserting its existence. The two-luciferase reporter, considered as the model of choice for studying IRES-translation, can in fact reveal various abnormalities of gene expression.

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro. / The period of endometrial receptivity in humans coincides with the differentiation of endometrial stromal cells into highly specialized decidual cells through a process known as decidualization. This transformation of endometrial cells is abnormal in recurrent pregnancy loss patients. Liver homolog receptor 1 (LHR-1, NR5A2) is an orphan nuclear receptor and a transcription factor that regulates many reproductive events. The activation of this receptor leads to transcriptional activation of its target genes. We have previously shown that it is essential for decidualization in the mouse uterus. LRH-1 is expressed in the human uterus in both proliferative and secretory phases of the menstrual cycle and its expression increases during in vitro decidualization. We hypothesize that LRH-1 is indispensable for proper decidualization of the endometrial stroma, acting through the transcriptional regulation of genes required for transformation of stromal cells into decidual cells. To explore the molecular mechanism of transcriptional regulation mediated by this receptor, we established an in vitro model of decidualization, using an immortal human endometrial stromal cell line (hESC). An overexpression model developed by transfecting the cells with a plasmid constitutively expressing Lrh-1, resulted in 5 fold increases in abundance of transcripts for the decidualization marker genes prolactin (PRL) and insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). Furthermore, the downregulation of the receptor using short hairpin RNA (shRNA) abrogates the decidual reaction, from both a morphological point of view and in terms of expression of the two marker genes. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis showed that LRH-1 binds to genomic regions upstream of genes important for decidualization such as PRL, wingless-type MMTV integration site family, member 4 (WNT4), wingless-type MMTV integration site family, member 5 (WNT5), cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, CDKN1A) and interleukin-24(IL-24). For each of these genes, the binding increased during in vitro decidualization. Structural studies have identified phospholipids as potential LRH-1 ligands. We therefore explored the effect of ligand treatment on LRH-1 with an agonist and an inverse agonist for the nuclear receptor. Analysis by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and Western blot demonstrated that the modulation of LRH-1 activity by its ligands also affects the decidual reaction. Recent studies have shown that decidualized human stromal cells are biosensors of embryo quality and that they have the capacity to migrate towards the embryo. Our time-lapse evaluation of hESC cells co-cultured with mouse embryos indicates directed migration of the cells toward the embryo. This effect is markedly diminished when LRH-1 is depleted by shRNA in hESC. Our data provide evidence that LRH-1 regulates not only the transcription of a set of genes involved in decidualization but also the directional motility of these cells in vitro.

Les cellules souches ont attiré l’attention du public ces dernières années, grâce non-seulement à leur utilisation comme thérapies visant à s’attaquer à certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la médecine regénérative. Il est établi que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est régulé de façon intensive par un groupe de facteur clés agissant sur leur pluripotence. Il est néanmoins envisageable que certains déterminants influençant l’auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré, en utilisant une méthode par infections virales, une collection de ESC contenant des délétions chromosomales chevauchantes que nous avons baptisée DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indépendants dont les régions délétées couvrent environ 25% du génome murin. À l’aide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryoïdes (EB), démontrant que plusieurs clones délétés avaient un phénotype de différenciation anormal. Nos études de complémentation sur un groupe de clones ont par la suite permis l’identification de Rps14 - un gène codant pour une protéine ribosomale (RP) comme étant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxième temps, l’analyse approfondie des résultats de notre crible a permis d’identifier un groupe de gènes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la différenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manière intéressante, les phénotypes anormaux de formation en EB les plus marqués sont associés à des délétions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. Étonnament, alors qu’un débalancement des RP conduit généralement à une réponse de type p53, l’haploinsuffisance de ces trois gènes ne peut être renversée par une simple réduction des niveaux d’expression de ce gène suppresseur de tumeurs. Finalement, nos études de profilage polysomal et de séquençage à haut-débit montrent une signature spécifique de gènes liés au mésoderme chez un clone hétérozygote pour Rps5, suggérant ainsi une explication au phénotype de différenciation p53-indépendant identifié chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la création d’une ressource intéressante de génomique fonctionnelle qui a permis de mettre à jour le rôle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos résultats permettent aussi de documenter une réponse p53-indépendante suite à un débalancement de RP dans un contexte opposant l’auto-renouvellement et la différenciation des ESC. / Stem cells have captured public’s attention in the last years, thanks to their involvement in cancer therapies and also their huge theoretical potential in the regenerative medicine field. In order to translate this new technology to the clinic, a better understanding of their regulatory mechanisms is still needed. It is well established that mouse embryonic stem cell (ESC) fate is highly regulated by core pluripotency factors. However, it is conceivable that novel self-renewal or differentiation regulators are not yet described. To investigate this possibility, we used a viral-based approach to generate a collection of ESC with nested chromosomal deletions called DelES (Deletion in ES cells). This library contains more than a thousand independent ESC clones highly enriched in chromosomal deletions which together cover ~25% of the mouse genome. Using this resource, we conducted an embryoid body (EB) differentiation screen and showed that several clones were having an abnormal EB formation phenotype. Complementation studies later identified Rps14-a ribosomal protein (RP) coding gene- as a novel haploinsufficient gene in EB formation from undifferentiated ESC. Further analyses of our screen results showed a strong bias for a subset of small subunit ribosomal protein genes which are critical for ESC differentiation but not for their self-renewal activity. Interestingly, the most severe differentiation phenotypes were found with ribosomal proteins associated to the ribosome’s mRNA exit site, namely Rps5, Rps14 and Rps28. While RP gene imbalance often leads to a p53 response that can be corrected by p53 suppression, ESC clones with decreased expression of mRNA exit site RP genes were surprisingly insensitive to p53 reduction, but were rescued by BAC or cDNA complementation, thus confirming the causative nature of these genes in the ESC phenotype. Finally, polysomal profiling and RNA-Seq studies showed that Rps5 deleted ESC exhibit an abnormal mesodermal gene signature. Together, our work presents a highly valuable resource for functional genomic studies in ESC and also highlights a novel p53-independent role linked to RP gene imbalance. Our results shed light on the relevance of these subunits for the developmental transition of ESC from a pluripotent to a differentiated state.

EIF4E, le facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes est un oncogène puissant et qui se trouve induit dans plusieurs types de cancers, parmi lesquels les sous-types M4 et M5 de la leucémie aiguë myéloblastique (LAM). EIF4E est régulé à plusieurs niveaux cependant, la régulation transcriptionnelle de ce gène est peu connue. Mes résultats montrent que EIF4E est une cible transcriptionnelle directe du facteur nucléaire « kappa-light- chain- enhancer of activated B cells » (NF-κB).Dans les cellules hématopoïétiques primaires et les lignées cellulaires, les niveaux de EIF4E sont induits par des inducteurs de NF-κB. En effet, l’inactivation pharmaceutique ou génétique de NF-κB réprime l’activation de EIF4E. En effet, suite à l’activation de NF-κB chez l’humain, le promoteur endogène de EIF4E recrute p65 (RelA) et c-Rel aux sites évolutionnaires conservés κB in vitro et in vivo en même temps que p300 ainsi que la forme phosphorylée de Pol II. De plus, p65 est sélectivement associé au promoteur de EIF4E dans les sous-types LAM M4/M5 mais non pas dans les autres sous-types LAM ou dans les cellules hématopoïétiques primaires normales. Ceci indique que ce processus représente un facteur essentiel qui détermine l’expression différentielle de EIF4E dans la LAM. Les analyses de données d’expressions par séquençage de l’ARN provenant du « Cancer Genome Atlas » (TCGA) suggèrent que les niveaux d’ARNm de EIF4E et RELA se trouvent augmentés dans les cas LAM à pronostic intermédiaire ou faible mais non pas dans les groupes cytogénétiquement favorables. De plus, des niveaux élevés d’ARNm de EIF4E et RELA sont significativement associés avec un taux de survie relativement bas chez les patients. En effet, les sites uniques κB se trouvant dans le promoteur de EIF4E recrutent le régulateur de transcription NF-κB p65 dans 47 nouvelles cibles prévues. Finalement, 6 nouveaux facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la régulation du gène EIF4E ont été prédits par des analyses de données ChIP-Seq provenant de l’encyclopédie des éléments d’ADN (ENCODE). Collectivement, ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur le control transcriptionnel de EIF4E et offrent une nouvelle base moléculaire pour sa dérégulation dans au moins un sous-groupe de spécimens de LAM. L’étude et la compréhension de ce niveau de régulation dans le contexte de spécimens de patients s’avère important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’expression du gène EIF4E moyennant des inhibiteurs de NF-κB en combinaison avec la ribavirine. / The eukaryotic translation initiation factor EIF4E is a powerful oncogene that is overexpressed in cancers, including the M4 and M5 subtypes of acute myeloid leukemia (AML). EIF4E is regulated at multiple levels; however not much is known about the transcriptional regulation of this gene. My findings show that the nuclear factor kappa-light- chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) is a direct transcriptional regulator of EIF4E. EIF4E levels are induced in primary hematopoietic cells and in cell lines in response to NF-κB activating stimuli. Pharmacological and genetic inhibition of NF-κB suppresses EIF4E levels. NF-κB factors RelA (p65) and c-Rel are recruited to evolutionarily conserved κB sites in the EIF4E promoter in vitro and in vivo following NF-κB activation concurrent with the recruitment of p300 and phosphorylated Pol II. Furthermore, p65 is selectively associated with the EIF4E promoter in M4/M5 AML subtypes but not in other AML subtypes or normal primary hematopoietic cells and thus represents an underlying factor in determining the differential expression of EIF4E in AML. Analysis of gene expression RNA-Seq data from The Cancer Genome Atlas (TCGA) suggests that EIF4E and RELA mRNA levels are upregulated in intermediate and poor prognosis AML but not in the cytogenetically favorable group. Additionally, elevated EIF4E and RELA mRNA levels are significantly associated with worst patient survival outcome. Furthermore, 8 new putative NF-κB target genes that may be regulated with a pattern similar to EIF4E in poor prognosis AML were in silico predicted from Chip-Seq data. Finally, 6 new transcription factors that may be implicated in EIF4E gene regulation were predicted from the analysis of ChIP-Seq data from the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). Collectively, these findings could offer novel insights into the transcriptional regulation of EIF4E and a novel molecular basis for its dysregulation in AML. Understanding this level of regulation within the context of patient specimens is important for the development of novel therapeutic strategies to target EIF4E gene expression with specific NF-κB inhibitors combined with ribavirin.

Les kinases constituent une famille majeure de protéines qui régulent divers processus par la phosphorylation de leurs substrats, mais aussi par leur activité non- catalytique. Ce rôle indépendant de l’activité kinase a été observé chez quelques protéines dont des membres de la famille Sterile-20. La kinase Ste20 Slik de Drosophila aide au maintien de l’intégrité des tissus épithéliaux en phosphorylant l’ERM Moesin et peut aussi induire une prolifération cellulaire non-autonome indépendamment de son activité catalytique. La méthode de régulation de ces deux rôles était jusqu’ici inconnue. Nous avons identifié 19 sites de phosphorylation chez Slik par spectrométrie de masse. À l’aide de mutants, nous démontrons que les deux fonctions de Slik sont régulées par la phosphorylation d’au moins 2 résidus conservés de son segment d’activation par un mécanisme d’auto- et/ou trans-phosphorylation. Cette étude amène une meilleure compréhension de la régulation de l’intégrité épithéliale et de la croissance, deux processus clés qui sont souvent déréglés dans le cancer et certaines maladies génétiques. / Kinases constitute a major protein family which regulate diverse pathways through the phosphorylation of their substrates, but also through their non-catalytic activity. This kinase-independent role has been observed in a few proteins such as certain members of the Sterile-20 family. The Drosophila Ste20 kinase Slik helps to maintain epithelial integrity by phosphorylating the ERM Moesin and it can also drive non- autonomous cellular proliferation in a kinase-independent fashion. The mechanism of regulation of these two roles was unknown up until now. We have identified 19 phosphorylation sites in Slik by mass spectrometry. Using Slik mutants, we show that its two functions are regulated by the phosphorylation of at least 2 conserved residues of its activation segment by an auto- and/or trans-phosphorylation mechanism. This research brings a better understanding of the regulation of epithelial maintenance and growth, two key processes which are deregulated in cancer and certain genetic diseases.

Les centrosomes sont de petits organites qui régulent divers processus cellulaires comme la polarité ou la mitose dans les cellules de mammifères. Ils sont composés de deux centrioles entourés par une matrice péricentriolaire. Ces centrosomes sont les principaux centres organisateurs de microtubules. De plus, ils favorisent la formation de cils, des protubérances sur la surface des cellules quiescentes qui sont critiques pour la transduction du signal. Une grande variété de maladies humaines telles que les cancers ou les ciliopathies sont liées à un mauvais fonctionnement des centrosomes et des cils. C’est pourquoi le but de mes projets de recherche est de comprendre les mécanismes nécessaires à la biogénèse et au fonctionnement des centrosomes et des cils. Tout d'abord, j’ai caractérisé une nouvelle protéine centrosomale nommée nephrocystine - 5 (NPHP5). Cette protéine est localisée dans les cellules en interphase au niveau de la région distale des centrioles. Sa déplétion inhibe la migration des centrosomes à la surface cellulaire lors de l’étape précoce de la formation des cils. NPHP5 interagit avec la protéine CEP290 via sa région C-terminale qui est essentielle pour la ciliogenèse. Elle interagit également avec la calmoduline ce qui empêche son auto-agrégation. J’ai démontré que les domaines de liaison de NHPH5 à CEP290 et à la calmoduline, ainsi que son domaine de localisation centrosomale sont séparables. De plus, j’ai démontré que les protéines NPHP5 présentant des mutations pathogènes ne peuvent plus interagir avec CEP290 et ne sont plus localisées aux centrosomes, rendant ainsi ces protéines non fonctionnelles. Enfin, en utilisant une approche pharmacologique pour moduler les événements en aval dans la voie ciliogénique, j’ai montré que la formation des cils peut être restaurée même en absence de NPHP5. D’autre part, j’ai étudié le rôle de NPHP5 dans l'assemblage et le trafic du complexe BBSome dans le cil. Le BBSome est composé de huit sous-unités différentes qui s’assemblent en un complexe fonctionnel dont on sait peu de chose sur la régulation spatiotemporelle de son processus d'assemblage. J’ai précédemment montré que NPHP5 favorisait la formation des cils et que son dysfonctionnement contribuait au développement de néphronophtise (NPHP). Bien que la NPHP et le syndrome de Bardet-Biedl (BBS) soient des ciliopathies qui partagent des caractéristiques cliniques communes, la base moléculaire de ces ressemblances phénotypiques n’est pas comprise. J’ai constaté que NPHP5, localisé à la base du cil, contient deux sites de liaison distincts pour le BBSome. De plus, j’ai démontré que NPHP5 et son partenaire CEP290 interagissent de façon dynamique avec le BBSome pendant la transition de la prolifération à la quiescence. La déplétion de NPHP5 ou CEP290 conduit à la dissociation d’au moins deux sous-unités du BBSome formant alors un sous-complexe dont la capacité de migration dans le cil n’est pas compromise. J’ai montré que le transport des cargos vers le compartiment ciliaire par ce sous-complexe n’est que partiellement altéré. Enfin, j’ai également concentré mes recherches sur une autre protéine centrosomale peu caractérisée. La protéine centrosomale de 76 kDa (Cep76) a été précédemment impliquée dans le maintien d’une duplication unique des centrioles par cycle cellulaire, et dans une interaction avec la kinase cycline-dépendante 2 (CDK2). Cep76 est préférentiellement phosphorylée par le complexe cycline A/CDK2 sur le site unique S83. Cet événement est essentiel pour supprimer l'amplification des centrioles en phase S. J’ai démontré que Cep76 inhibe cette amplification en bloquant la phosphorylation de Plk1 au niveau des centrosomes. D’autre part, Cep76 peut être acétylée au site K279 en phase G2, ce qui régule négativement son activité et sa phosphorylation sur le site S83. Ces études permettent d'améliorer notre compréhension de la biologie des centrosomes et des cils et pourraient conduire au développement de nouvelles applications diagnostiques et thérapeutiques. / Centrosomes are small organelles that regulate diverse cellular processes such as polarity or mitosis in mammalian cells. They are composed of two centrioles surrounded by a pericentriolar matrix. These centrosomes are the major microtubule organizing centers. Moreover, they promote the formation of cilia, protrusions on the surface of quiescent cells that are critical for signal transduction. A wide variety of human diseases such as cancers or ciliopathies are linked to a malfunction of centrosomes and cilia. Therefore the aim of my research is to understand the mechanisms necessary for the biogenesis and function of centrosomes and cilia. First, I have characterized a novel centrosomal protein called nephrocystin - 5 (NPHP5). This protein is localized, in interphase cells, in the distal region of centrioles. Its depletion inhibits the migration of centrosomes to the cell surface during the early stage of cilia formation. NPHP5 interacts with CEP290 via its C-terminal region that is essential for ciliogenesis. It also interacts with calmodulin, which prevents its self-aggregation. I have demonstrated that the Cep290- and CaM-binding domains as well as the centrosomal localization domain of NPHP5 are separable. Moreover, I have shown that NPHP5 proteins with pathogenic mutations can no longer interact with CEP290 and are not localized to centrosomes, rendering these proteins non-functional. Finally, using a pharmacological approach to modulate the downstream events in the ciliogenic pathway, I showed that cilia formation can be restored even without NPHP5. On the other hand, I studied the role of NPHP5 in the assembly and trafficking of the BBSome into the cilium. The BBSome consists of eight different subunits that assemble into a functional complex of which little is known about the spatiotemporal regulation of its assembly process. I have previously shown that NPHP5 favored the formation of cilia and its dysfunction contributes to the development of nephronophthisis (NPHP). Although the NPHP and BBS syndrome (BBS) are ciliopathies that share common clinical features, molecular basis of these phenotypic similarities is not understood. I found that NPHP5, located at the base of the cilium, contains two separate binding sites for BBSome. Furthermore, I demonstrated that NPHP5 and his partner CEP290 interact dynamically with the BBSome during the transition from quiescence to proliferation. Depletion NPHP5 or CEP290 leads to the dissociation of at least two subunits of BBSome forming a sub-complex that can still traffic into the cilium. I have shown that the transport of cargo to the ciliary compartment through this sub-complex is only partially altered. Finally, I have also focused my research on another centrosomal protein poorly characterized. The centrosomal protein of 76 kDa (Cep76) was previously involved in the maintenance of a single duplication of centrioles per cell cycle, and interacts with the cyclindependent kinase 2 (CDK2). Cep76 is preferentially phosphorylated by cyclin A/CDK2 on the single site S83. This event is essential to suppress centrioles amplification in S phase. I have demonstrated that Cep76 inhibits amplification by blocking the phosphorylation of Plk1 at the centrosome. Moreover, Cep76 can be acetylated at the K279 site in G2 phase, which negatively regulates its activity and phosphorylation on the site S83. These studies will improve our understanding of the biology of centrosomes and cilia and could lead to development of new diagnostic and therapeutic applications.

Un dérèglement du cycle cellulaire peut causer le cancer. Lors de la cytocinèse un anneau contractile d’actine et de myosine se forme, se contracte, et donne un anneau du midbody qui mène à l’abscision. Le processus de cytocinèse est sous le contrôle de protéines telles que la GTPase Rho qui active la cytocinèse et les cyclines-Cdks qui l'inhibent. La Drosophile possède 3 cyclines mitotiques CycA/ CycB/ CycB3 qui sont successivement dégradées en fin de mitose et permettent l'initiation de la cytocinèse. La dernière étape d’abscission est un phénomène qui reste encore peu connu. Les protéines Vps4 et CHMP4C liées à ANCHR vont, sous la dépendance de la kinase Aurora B, promouvoir l’abscision mais, suite à quelques études récentes, il semble y avoir une implication de la cycline B. Ici, le but était de tester l’implication de cette cycline dans les processus de cytocinèse et d’abscision, elle a été menée par microscopie à haute résolution en temps réel avec des cellules S2 de l’organisme Drosophila melanogaster par le suivi de protéines recombinantes fluorescentes. L’étude a été divisée en deux axes : gain et perte de fonction par l’intermédiaire respectivement de la protéine Cycline B recombinante stable, non dégradable (CycBstable-GFP) et l’inhibition par l’utilisation d’ARN double brin (ARNdb) sur l’endogène. La CycBstable-GFP a perturbé la cytocinèse en induisant plusieurs anneaux contractiles et midbodies. En revanche la réduction de l’expression de CycB n'a pas eu d’effet observable, et elle ne semble pas avoir d’action sur l’abscission malgré le recrutement de CycB-GFP au midbody tardif. En revanche la protéine Cdk1 semble avoir un rôle dans l'abscision puisque sa réduction d’expression a induit un délai. Elle a donc une implication potentielle sur la cytocinèse. / Dysregulation of the cell cycle can cause cancer. During cytokinesis a contractile ring of actin and myosin forms, contracts and gives rise to a midbody ring which controls abscission. The process of cytokinesis is controlled by proteins such as the Rho GTPase, which activates cytokinesis and cyclin-Cdks that inhibit cytokinesis. Drosophila has 3 mitotic cyclins CycA, CycB and CycB3, which are successively degraded at the end of mitosis to allow the initiation of cytokinesis. The last step of abscission is a phenomenon that is still obscure. The ESCRTIII components VPS4 and CHMP4C protein linked to ANCHR will, in an Aurora B kinasedependent manner, promote abscission with recent studies implicating Cyclin B at this stage. Here, the aim was to test the role of cyclin B in cytokinesis and abscission, using real-time, high resolution microscopy of Drosophila melanogaster S2 cells expressing recombinant fluorescent proteins. This study was divided into two parts: gain and loss of function studies respectively using stable non-degradable cyclin B (CycBstable-GFP) and inhibition by using CycB double-stranded RNA (dsRNA). The CycBstable-GFP perturbed cytokinesis by inducing multiple contractile rings and midbodies. However CycB depletion had no detectable effect on the progression of cytokinesis nor on abscission despite the recruitment of CycB-GFP to the late midbody. In contrast, the protein Cdk1 seemed to play a role in abscission, since its depletion induced a delay. It therefore has potential implications for cytokinesis.

Ce projet de recherche explore un nouveau mécanisme de régulation de l’activité du domaine HECT de la ligase Itch. Ce domaine est responsable de la polyubiquitylation des protéines impliquant le plus souvent leur dégradation par le protéasome. Itch est une ligase de l’ubiquitine de la famille CWH contenant un domaine HECT catalytique en C-terminal, quatre domaines WW, et un domaine C2 N-terminal qui est important pour sa localisation cellulaire. Les ligases CWH interagissent par leur domaine WW avec leurs ligands. Un mécanisme proposé pour ces ligases est que la première molécule d’ubiquitine liée au substrat active le domaine HECT de manière à former une chaine d’ubiquitine sur le substrat. Itch a une particularité dans la famille CWH, car elle possède un domaine riche en proline qui lui permet d’interagir avec plusieurs protéines à domaine SH3. Dans cette étude, nous avons déterminé l’effet de l’ubiquitylation initiale des protéines SH3 sur l’activité du domaine HECT de la ligase Itch, et sur la régulation de ces substrats. / The subject of this research is to reveal a new mechanism of regulation of the Itch ubiquitin ligase through its catalytic HECT domain. The HECT domain is in charge of polyubiquitylating proteins, which is often responsible for their degradation by the proteasome. Itch belongs to the CWH subfamily of ubiquitin ligases, characterized by the presence of C-terminal catalytic HECT domain, four WW domains for ligand binding and a N-terminal C2 domain important for the subcellular localization of the ligase. Attachment of a first ubiquitin moïties to the substrates is proposed to stimulate the ligase activity, promoting the creation of a polyubiquitin chain. Itch is the only member of its subfamily that has been shown to interact and promote the ubiquitylation of SH3 domain-containing proteins through a conserved proline-rich region located upstream of the four WW domains. In this work, we have determined the impact of the addition of a single ubiquitin to SH3 domain-containing proteins on the processivity of the ubiquitylation reaction catalysed by Itch and on the regulation of this class of substrates.

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