Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

Várias evidências indicam que os derivados da guanina (nucleotídeos GTP, GDP, GMP e o nucleosídeo guanosina) são capazes, além de atuarem intracelularmente, de atuarem do lado externo da membrana plasmática celular, exercendo efeitos neuromoduladores no sistema nervoso central. Funções tróficas, mitóticas e até antiapoptóticas nas diferentes células neurais já foram descritas para alguns dos derivados, mas são os efeitos relacionados ao antagonismo do sistema glutamatérgico que parecem indicar um grande potencial terapêutico para os derivados da guanina. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico em ratos e camundongos. Tanto o aumento provocado na captação de glutamato, como o efeito anticonvulsivante parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Nesta dissertação, demonstramos que o GMP administrado tanto sistemicamente, como centralmente é capaz de exercer um efeito amnésico em camundongos na tarefa da esquiva inibitória. Como na ação anticonvulsivante e, sobre a modulação da captação de glutamato, a guanosina parece ser a real efetora do efeito amnésico apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de um inibidor da conversão de GMP para guanosina leva à inibição do seu efeito. Ainda, essa conversão do GMP a guanosina parece ser realizada tanto sistemicamente como centralmente em camundongos. Desta forma, a administração de GMP parece ser uma efetiva estratégia para aumentar os níveis de GUO em futuros estudos sobre as possíveis ações terapêuticas da GUO. / Several evidences report that guanine based purines (nucleotides GTP, GDP, GMP and guanosine nucleoside) acts , besides intracellularly, at the outside of plasmatic membrana, exerting neuromodulatory roles in central nervous system. Trophic, mitotic and even antiapoptotic functions in different neural cells have been described to some of the guanine based purines, however the effects in relation to the glutamatergic system seem to indicate an important therapeutic potential for guanine based purines. The guanine based purines, mainly guanosine, are able to stimulate the glutamate uptake in astrocyte culture and brain tissue slices. They act as anticonvulsant by different vias of administration, and also display an amnesic effect in rats and mice. Both the stimulatory upon the glutamate uptake, and the anticonvulsant effects seem to be specifically to guanosine, given that the nucleotides has to be hydrolyzed to display these effects. In this study, we showed that both a systemic or a centrally administration of GMP is able to display an amnesic effect at the inhibitory avoidance task in mice. Like the anticonvulsant and stimulatory upon glutamate uptake effects, the guanosine seems to be the real agent for the amnesic effect displayed by GMP, since when an inhibitor of the conversion of GMP to guanosine is used before the centrally nucleotide administration, the amnesic effect is not observed. In addition, the conversion of GMP to guanosine seems to occur both systemically and centrally in mice. the action of ecto- 5V-nucleotidase. Therefore, administration of GMP may also be an effective strategy to increase GUO levels in future studies of possible therapeutic actions of GUO.

Várias evidências indicam que os derivados da guanina (nucleotídeos GTP, GDP, GMP e o nucleosídeo guanosina) são capazes, além de atuarem intracelularmente, de atuarem do lado externo da membrana plasmática celular, exercendo efeitos neuromoduladores no sistema nervoso central. Funções tróficas, mitóticas e até antiapoptóticas nas diferentes células neurais já foram descritas para alguns dos derivados, mas são os efeitos relacionados ao antagonismo do sistema glutamatérgico que parecem indicar um grande potencial terapêutico para os derivados da guanina. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico em ratos e camundongos. Tanto o aumento provocado na captação de glutamato, como o efeito anticonvulsivante parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Nesta dissertação, demonstramos que o GMP administrado tanto sistemicamente, como centralmente é capaz de exercer um efeito amnésico em camundongos na tarefa da esquiva inibitória. Como na ação anticonvulsivante e, sobre a modulação da captação de glutamato, a guanosina parece ser a real efetora do efeito amnésico apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de um inibidor da conversão de GMP para guanosina leva à inibição do seu efeito. Ainda, essa conversão do GMP a guanosina parece ser realizada tanto sistemicamente como centralmente em camundongos. Desta forma, a administração de GMP parece ser uma efetiva estratégia para aumentar os níveis de GUO em futuros estudos sobre as possíveis ações terapêuticas da GUO. / Several evidences report that guanine based purines (nucleotides GTP, GDP, GMP and guanosine nucleoside) acts , besides intracellularly, at the outside of plasmatic membrana, exerting neuromodulatory roles in central nervous system. Trophic, mitotic and even antiapoptotic functions in different neural cells have been described to some of the guanine based purines, however the effects in relation to the glutamatergic system seem to indicate an important therapeutic potential for guanine based purines. The guanine based purines, mainly guanosine, are able to stimulate the glutamate uptake in astrocyte culture and brain tissue slices. They act as anticonvulsant by different vias of administration, and also display an amnesic effect in rats and mice. Both the stimulatory upon the glutamate uptake, and the anticonvulsant effects seem to be specifically to guanosine, given that the nucleotides has to be hydrolyzed to display these effects. In this study, we showed that both a systemic or a centrally administration of GMP is able to display an amnesic effect at the inhibitory avoidance task in mice. Like the anticonvulsant and stimulatory upon glutamate uptake effects, the guanosine seems to be the real agent for the amnesic effect displayed by GMP, since when an inhibitor of the conversion of GMP to guanosine is used before the centrally nucleotide administration, the amnesic effect is not observed. In addition, the conversion of GMP to guanosine seems to occur both systemically and centrally in mice. the action of ecto- 5V-nucleotidase. Therefore, administration of GMP may also be an effective strategy to increase GUO levels in future studies of possible therapeutic actions of GUO.

Várias evidências indicam que os derivados da guanina (nucleotídeos GTP, GDP, GMP e o nucleosídeo guanosina) são capazes, além de atuarem intracelularmente, de atuarem do lado externo da membrana plasmática celular, exercendo efeitos neuromoduladores no sistema nervoso central. Funções tróficas, mitóticas e até antiapoptóticas nas diferentes células neurais já foram descritas para alguns dos derivados, mas são os efeitos relacionados ao antagonismo do sistema glutamatérgico que parecem indicar um grande potencial terapêutico para os derivados da guanina. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico em ratos e camundongos. Tanto o aumento provocado na captação de glutamato, como o efeito anticonvulsivante parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Nesta dissertação, demonstramos que o GMP administrado tanto sistemicamente, como centralmente é capaz de exercer um efeito amnésico em camundongos na tarefa da esquiva inibitória. Como na ação anticonvulsivante e, sobre a modulação da captação de glutamato, a guanosina parece ser a real efetora do efeito amnésico apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de um inibidor da conversão de GMP para guanosina leva à inibição do seu efeito. Ainda, essa conversão do GMP a guanosina parece ser realizada tanto sistemicamente como centralmente em camundongos. Desta forma, a administração de GMP parece ser uma efetiva estratégia para aumentar os níveis de GUO em futuros estudos sobre as possíveis ações terapêuticas da GUO. / Several evidences report that guanine based purines (nucleotides GTP, GDP, GMP and guanosine nucleoside) acts , besides intracellularly, at the outside of plasmatic membrana, exerting neuromodulatory roles in central nervous system. Trophic, mitotic and even antiapoptotic functions in different neural cells have been described to some of the guanine based purines, however the effects in relation to the glutamatergic system seem to indicate an important therapeutic potential for guanine based purines. The guanine based purines, mainly guanosine, are able to stimulate the glutamate uptake in astrocyte culture and brain tissue slices. They act as anticonvulsant by different vias of administration, and also display an amnesic effect in rats and mice. Both the stimulatory upon the glutamate uptake, and the anticonvulsant effects seem to be specifically to guanosine, given that the nucleotides has to be hydrolyzed to display these effects. In this study, we showed that both a systemic or a centrally administration of GMP is able to display an amnesic effect at the inhibitory avoidance task in mice. Like the anticonvulsant and stimulatory upon glutamate uptake effects, the guanosine seems to be the real agent for the amnesic effect displayed by GMP, since when an inhibitor of the conversion of GMP to guanosine is used before the centrally nucleotide administration, the amnesic effect is not observed. In addition, the conversion of GMP to guanosine seems to occur both systemically and centrally in mice. the action of ecto- 5V-nucleotidase. Therefore, administration of GMP may also be an effective strategy to increase GUO levels in future studies of possible therapeutic actions of GUO.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:07:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bianca_franca_ioc_dout_2015.pdf: 11028145 bytes, checksum: e8f2a4ece5e213dd7f7e288656fd0f9d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A produção aumentada de eosinófilos pela medula óssea sustenta a inflamação crônica na asma, compensando a apoptose de eosinófilos maduros nos sítios inflamados. Outros trabalhos mostraram que a eosinopoiese poderia ser suprimida pela prostaglandina E2 (PgE2) por uma via iNOS-CD95L dependente. Sendo a PgE2 um ativador da produção de AMPc intracelular, testamos uma série de agentes capazes de mimetizar este aumento de AMPc. Foram realizadas culturas de medula óssea em meio líquido ou semi-sólido para a análise da eosinopoiese e neutropoiese a partir de camundongos mutantes e seus respectivos controles de tipo selvagem (WT), dos backgrounds BALB/c, C57BL/6. Todos os agentes testados, incluindo isoproterenol, mimetizaram os efeitos de PgE2, suprimindo a eosinopoiese pela mesma via utilizada para supressão pela PgE2. Outros agentes como a IL-17A, uma citocina pró-inflamatória, e a a- galactosilceramida (\03B1-GalCer), um glicolipídeo que ativa células iNKT de forma restrita por CD1d, também suprimiram a eosinopoiese pela via de iNOS-CD95L, mas cada agente utilizou um ponto de atuação e um mecanismo de ação próprio. Por outro lado, o ácido retinóico all-trans (ATRA) também suprimiu a eosinopoiese de forma dependente de CD95L, mas um papel para a iNOS só foi evidenciado, até o momento, para a supressão de formação de colônias pelo ATRA na presença de GM-CSF. Também evidenciamos uma interrelação entre a via da cicloxigenase (COX), a via da 5-lipoxigenase (5-LO) e a ação dos glicocorticóides (GC) na regulação da eosinopoiese Dados anteriores do laboratório mostram que: a) na ausência de 5-LO, a medula óssea estimulada por IL-5 não responde aos inibidores da COX, que potencializam a eosinopoiese em controles WT (Elsas et al., 2008)(Elsas et al., 2008)(Elsas et al., 2008)(Elsas et al., 2008)(Elsas et al., 2008)(Elsas et al., 2008)(Elsas et al., 2008)(Elsas et al., 2008); b) a ação supressiva da PgE2 é antagonizada pelos cisteinil-leucotrienos, produtos da 5-LO, e também pelos glicocorticóides (Gaspar-Elsas et al., 2009). Neste trabalho, mostramos que controles WT e mutantes WASP-KO (deficientes na proteína do Síndrome de Wiskott-Aldrich, que é um elemento importante na motilidade e função de defesa de várias células hematopoiéticas, por sua função no controle do citoesqueleto) respondem normalmente aos inibidores da COX na presença de 5-LO. Mutantes WASP-KO apresentaram menor celularidade da medula óssea recém-coletada, com um déficit significativo na população granulocítica, e não apresentaram resposta eosinopoiética a GC, nem in vivo nem in vitro, com respostas normais à PgE2. Os bloqueadores da COX reconstituíram a eosinopoiese in vitro na medula óssea mutante de forma dependente de 5-LO e leucotrienos. Portanto, WASP mostrou-se relevante tanto para a celularidade da medula óssea in vivo quanto para a sinalização da resposta ao GC. Essas observações reforçam o interesse de estudar a influência dos GC sobre a produção de granulócitos in vivo, e permitem distinguir com base em critério bioquímico (WASPdependência), a via de atuação dos GC daquela via utilizada pelos produtos da 5-LO para bloquear a eosinopoiese iNOS/CD95L-dependente / Increased eosinophil production by bone-marrow sustains chronic inflammation in asthma, by replacing mature eosinophils which undergo apoptosis in inflammatory sites. Other studies have shown that eosinopoiesis could be suppressed by prostaglandin E2 (PgE2) in vitro. Because PgE2 increases intracellular cAMP levels, we tested a panel of agents capable of induction or mimesis of intracellular cAMP rises. We established bone-marrow cultures, in liquid or semisolid media, to examine eosinopoiesis and neutropoiesis, from mutant mice and their respective wild-type (WT) controls of the BALB/c and C57BL/6 backgrounds. All these agents, including isoproterenol, duplicated the effects of PgE2, suppressing eosinopoiesis by the same biochemical pathway previously characterized for PgE2. Other agents such as IL-17 A, a proinflammatory cytokine. and a-galactosilceramide (\03B1-GalCer), a CD1d-restricted glycolipid which activates iNKT cells, also supressed eosinopoiesis through the iNOS-CD95L pathway, but each agent entered the sequence at a distinctive point and used a distinctive mechanism of action. By contrast, all-trans Retinoic Acid (ATRA) also suppressed eosinopoiesis in a CD95L-dependent manner, but a role for iNOS was so far only demonstrated in suppression of colony-formation by ATRA in the presence of GM-CSF. We also demonstrated the three-way connectivity between the cyclooxygenase (COX) pathway, the 5-lipoxygenase (5-LO) pathway and glucocorticoid (GC) regulatory effects on eosinopoiesis. Our group previously reported that: a) in the absence of 5-LO, IL-5-stimulated bone-marrow did not respond to COX inhibitors, which enhance eosinopoiesis in WT bone-marrow; b) the supressive effects of PgE2 are antagonized by cysteinilleukotrienes, produced by 5-LO, and by GC (Elsas et al., 2008) Here we show that WT controls and WASP-KO mutants (lacking the Wiskott-Aldrich Syndrome Protein, a critical element in motility and immunological function of various hemopoietic cell types, due to its role in cytoskeleton regulation) respond normally to COX inhibitors in the presence of 5-LO. WASPKO mutants present lower cellularity in freshly harvested bone-marrow, with significantly decreased granulocyte numbers, and lack an eosinopoietic response to GC, in vitro and in vivo, but show normal responsivess to PgE2. COX inhibitors reconstituted eosinopoiesis in mutant bone-marrow in vitro in a 5-LO- and cysteinyl-leukotriene-dependent manner. Hence, WASP is relevant to bone-marrow cellularity in vivo, as well as to GC signaling. This highlights the interest of further studying the influence of GC on in vivo granulocyte production, and enables us to distinguish, based on a biochemical criterion (WASP-dependency), the targets of GC from the pathway used by cysteinyl-leukotrienes to prevent iNOS-CD95L-mediated suppression of eosinopoiesis / 2100-04-28

Las manifestaciones pulmonares de la colitis ulcerosa son una de las manifestaciones extraintestinales menos frecuentes. La afectación pulmonar subclínica es mas frecuente que la enfermedad pulmonar activa. En una revisión publicada en el año 2003, los autores destacan como un 62,5% de los casos registrados presentan afectación pulmonar subclinica (alteraciones en la espirometría, volúmenes pulmonares, difusión pulmonar, permeabilidad pulmonar o hallazgos en el lavado broncoalveolar). La determinación de óxido nítrico en aire exhalado (ENO) y la provocación bronquial con adenosina 5´-monofosfato (AMP) y metacolina han permitido estudiar la inflamación y las alteraciones estructurales bronquiales mediante métodos no invasivos. Los objetivos del estudio fueron identificar diferencias en la prevalencia y grado de hiperrespuesta bronquial (HRB) a AMP y en la concentración de ENO entre individuos con colitis ulcerosa y controles sanos. Se incluyeron 24 pacientes con colitis ulcerosa activa o inactiva (índice de Truelove-Witts modificado) y 24 sujetos sanos. Los participantes no tenían enfermedades pulmonares concomitantes, su función pulmonar basal era normal, no eran fumadores y no sufrían enfermedades alérgicas. No habían recibido glucocorticoides o sufrido infecciones respiratorias en las cuatro semanas previas. La radiografía de tórax de los pacientes con colitis ulcerosa debía ser normal. Ambos grupos no tuvieron otras enfermedades concomitantes graves o mal controladas. El estudio fue transversal y abierto, constando de 3 visitas. En la visita 1 se recabó la historia clínica de los participantes y se les efectuó una exploración física. En la visita 2 se efectuaron pruebas cutáneas con método prick test a los alergenos respiratorios relevantes de nuestro medio, espirometría, determinación de ENO y provocación bronquial con AMP o metacolina (el orden de las exploraciones se aleatorizó). En la visita 3 se realizó determinación de ENO, espirometría y la provocación bronquial con el broncoconstrictor no empleado en la visita 2. Los resultados demuestran que aunque la prevalencia de HRB a AMP (PC20 ≤400mg/ml) en los pacientes con colitis ulcerosa fue similar a la identificada en sujetos sanos, estos presentaron una significativamente mayor respuesta bronquial a AMP (valorada mediante el índice de reactividad (IR) propuesto por Burrows y cols) que los individuos sanos (IR 4,2% / log mg/ml 95% IC 3,4-5,0 en colitis ulcerosa e IR 3,2% / log mg/ml (95% IC 2,8-3,7) en los controles sanos, p = 0,034. No hubo diferencias significativas en la prevalencia y grado de respuesta bronquial a metacolina ni en las concentraciones de ENO entre ambas poblaciones. La respuesta bronquial a AMP y a metacolina, así como los valores de ENO, no mostraron ninguna relación con la actividad, extensión o tiempo de evolución de la colitis ulcerosa. La correlación entre el IR a metacolina y AMP fue significativa (r = 0,56, p = 0,004) en los pacientes con colitis ulcerosa. En este grupo también se detectó una correlación significativa entre el FEV1% (en % del teórico) y la relación FEV1/FVC y el IR a metacolina (r = −0,44, p = 0,03 y r = −0,49, p = 0,01, respectivamente). En conclusión: la respuesta a AMP inhalado puede usarse para identificar cambios inflamatorios subclínicos en las vías aéreas de pacientes con colitis ulcerosa. Estos cambios sin embargo, no pudieron ser identificados con la determinación de la respuesta bronquial a metacolina ni mediante la determinación de la concentración de óxido nítrico en aire exhalado. Por otra parte la disociación entre la respuesta a AMP y la concentración de ENO, sugieren que los mecanismos que inducen ambos procesos son independientes. / Previous studies have demonstrated that airway responsiveness to direct bronchoconstrictor agents (histamine or methacholine) is increased in a significant proportion of subjects with ulcerative colitis. However, the airway responsiveness of these patients to adenosine 5´-monophosphate (AMP), an indirect bronchoconstrictor agent, has never been investigated. The aim of the present doctoral thesis was to determine differences in exhaled nitric oxide (ENO) and airway responsiveness to AMP between subjects with ulcerative colitis and healthy controls. Forty-eight nonsmoking adults (24 with ulcerative colitis and 24 healthy subjects) were challenged with increasing concentrations of AMP and methacholine. ENO levels were also measured before spirometry and challenge testing. All patients with ulcerative colitis had normal chest x- ray studies and none had current o previos respiratory syptoms. The response to each bronchoconstrictor agent was expressed by the bronchial responsiveness index (BRI), whereas ENO was measured with the single exhalation method. The mean (95% CI) BRI values for AMP were significantly higher in subjects with ulcerative colitis than in healthy controls: 4,2 %/log mg/ml (3,4-5,0) vs 3,2 %/log mg/ml (2,8-3,7, P= 0,03). By contrast, methacholine BRI and ENO values were similar in the two groups. In subjects with ulcerative colitis, BRI values for methacholine and AMP were significantly related (r = 0,56, P = 0,004). However, not significant correlation was found between ENO values and methacholine or AMP BRI. In addition, ENO values were not related with the activity or duration of the disease. We conclude that the response to inhaled AMP can be used to identify subclinical inflammatory changes in the airways of subjects with ulcerative colitis. These changes, however, cannot be identified with the determination of airway responsiveness to methacholine. Furthemore the dissociation between the response to AMP and ENO levels suggests that the mechanisms that induce these two changes are indepent.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-27 / A cafeína tem sido considerada um fator de risco para o crescimento dos cistos na Doença Renal Policística Autossômica Dominante (DRPAD) devido ao aumento de secreção de fluido e proliferação celular induzidos pelo acúmulo de adenosina monofosfato cíclico (AMPc’), resultante da inibição da fosfodiesterase. O presente estudo teve como objetivos quantificar a ingestão de cafeína discriminando entre suas fontes dietéticas, avaliar o conhecimento sobre a necessidade de restrição de cafeína pelos pacientes com DRPAD e determinar a associação entre o consumo de cafeína e os dados clínicos e laboratoriais destes pacientes. A avaliação dos hábitos alimentares e do consumo de cafeína foi realizada através de três recordatórios de 24 horas, em dias não consecutivos e o conhecimento sobre a restrição de cafeína, considerado como orientação prévia, foi avaliado ao término da última entrevista com o paciente. Foram incluídos no estudo 102 pacientes com DRPAD (68F/34M, 38±14 anos), acompanhados no Ambulatório de Rins Policísticos da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e 102 indivíduos saudáveis (74F/28M, 39±12 anos). Os dados clínicos, laboratoriais e parâmetros ultrassonográficos renais foram obtidos do prontuário destes pacientes. A ingestão de cafeína foi significantemente menor no grupo de pacientes DRPAD quando comparados aos controles (85,7 versus 134 mg/dia) e o volume renal não se correlacionou com a ingestão de cafeína. De acordo com as respostas, detectou-se que 63% dos pacientes DRPAD foram previamente orientados quanto à restrição de cafeína. Os pacientes nãoorientados, que consumiam significantemente mais cafeína do que os orientados, eram significantemente mais velhos, e apresentavam níveis significantemente maiores de creatinina sérica e menores de Taxa de Filtração Glomerular (TFG) estimada. A porcentagem de pacientes hipertensos e com Doença Renal Crônica (DRC) estágio 3 era maior neste grupo, porém sem atingir significância estatística. O volume renal tendeu a ser maior no grupo de pacientes não-orientados, mas sem significância estatística. A análise de regressão linear multivariada revelou que a idade, presença de hipertensão e DRC estágio 3 se associaram com o volume renal na amostra total. Em conclusão, o consumo de cafeína encontrou-se reduzido na presente amostra de pacientes com DRPAD, provavelmente, devido à orientação prévia quanto à necessidade de restrição. A cafeína não se associou de maneira independente com o volume renal, o qual sofreu maiores influências da idade, presença de hipertensão e DRC. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A persistência bacteriana correlacionada à formação de biofilmes bacterianos é, há algum tempo, fonte de grande preocupação médica em virtude de sua ampla associação com a dificuldade de tratamento de infecções crônicas. Por outro lado, as perspectivas de utilização de biofilmes bacterianos em novas aplicações biotecnológicas e até mesmo para fins terapêuticos são promissoras. Há, portanto, grande interesse em compreender os mecanismos que levam as células bacterianas a deixar o estado planctônico, de vida livre, e associarem-se nesses conglomerados celulares altamente complexos. Ao longo das últimas décadas, o segundo mensageiro c-di-GMP – em conjunto com as moléculas que catalisam sua síntese (diguanilato ciclases) e sua degradação (fosfodiesterases) e seus receptores – estabeleceu-se como um elemento central de regulação de uma série de respostas celulares que determinam a formação ou a dispersão de biofilmes. Curiosamente, as proteínas que participam do metabolismo deste segundo mensageiro estão, frequentemente, codificadas múltiplas vezes em um mesmo genoma bacteriano. Em vista dessa observação, estudos mais recentes apontam que, para reger paralelamente uma variedade tão ampla de fenótipos, este sistema opera em modo de alta especificidade de sinalização e que, portanto, o sinal metabolizado por determinados conjuntos de diguanilato ciclases e fosfodiesterases tem alvos celulares específicos. Evidências robustas, porém isoladas até o momento, apontaram que um dos meios pelo qual ocorre a segregação entre sinal produzido e alvo específico é a interação direta entre as proteínas componentes das vias de sinalização. Mais, demonstrou-se que, em algumas vias, a transmissão de sinal ocorre exclusivamente via interação proteica, dispensando a intermediação do sinalizador em si. Para avaliar a validade e relevância global deste mecanismo, propôs-se, neste estudo, a investigação da rede total de interações entre as proteínas tipicamente associadas às vias de sinalização por c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, utilizando ensaios de duplo-hibrido bacteriano. Para tanto, foram construídas duas bibliotecas de DNA direcionadas e foram feitos testes de interação de forma estratégica para possibilitar o esgotamento e averiguação de todas as possíveis interações entre as proteínas alvo identificadas. O resultado obtido, um mapa inicial, porém abrangente, da rede de interações proteicas em P. aeruginosa, indica uma grande probabilidade de que os mecanismos previamente descritos sejam realmente recorrentes e relevantes para o intermédio da sinalização nesse organismo. Algumas das interações mais robustas encontradas são bastante interessantes e serão, em estudos futuros, mais extensivamente estudadas. / Persister bacteria are correlated to biofilm formation and have been a source of great medical concern due to its close association with the impairment of traditional treatment in combating chronic infections. On the other hand, using bacterial biofilms to create original biotechnological applications or even as a means of therapeutic treatment in medical settings constitutes a promising prospect. There is, therefore, a great interest in understanding the mechanisms that allow bacteria to leave the free-living planktonic lifestyle and associate in these highly complex cellular aggregates. Over the last decades, the second messenger c-di-GMP – and also the molecules involved in its synthesis (diguanylate ciclases) and degradation (phosphodiesterases) along with its receptors – has been established as a key element implicated in regulation of a series of cellular responses that determine biofilm formation or dispersion. Curiously, the proteins that play a part in the metabolism of this second messenger are frequently coded multiple times in single bacterial genomes. Taking this into account, recent studies indicate that, in order to control such a wide range of phenotypes, this system operates via high specificity of signaling – which means that the signal metabolized by a certain set of diguanylate ciclases and phosphodiesterases has specific cellular targets. Robust but yet isolated evidence indicate that a means by which a signal is segregated with its correlated phenotypic response is through direct protein-protein interaction involving the components of these signaling pathways. Even more, there has been strikingly evidence that, in some of these pathways, signal transduction occurs exclusively through protein-protein interaction, entirely dismissing any mediation by the signal molecule. In order to validate and evaluate the global relevance of this type of mechanism, this study proposed the investigation of the entire network of interactions between proteins typically associated with c-di-GMP signaling pathways of Pseudomonas aeruginosa by employing bacterial two-hybrid system assays. To make that possible, two DNA libraries were constructed and interaction essays were performed in a strategic way so that all possibilities of interaction between target proteins were explored. The results obtained from these experiments allowed the construction of a broad map of interactions that, although still primitive, indicates that, chances are, the mechanisms previously described are both recurrent and relevant to signaling regulation in this organism. Some of the interaction partners found are particularly interesting and will be further investigated in future studies.