L’utilisation de modèles animaux a permis la découverte de mécanismes importants du développement en général, et du développement tumoral en particulier afin d’établir et mettre au point de nouveaux traitements. Le poisson zèbre (Danio rerio), est de plus en plus utilisé dans le cadre de ces recherches du fait de ses nombreux avantages comme par exemple la transparence de ses larves ou une forte homologie avec l’homme. Plusieurs approches ont été développées chez ce poisson comme l’invalidation transitoire d’un gène afin d’identifier le rôle d’une protéine dans le développement, ou alors la transplantation de cellules tumorales de mammifères et étudier les réponses aux traitements anti-tumoraux.C’est dans l’un de ces deux contextes que nous avons étudié le rôle du monoxyde d’azote dans le développement tumoral. Pour cela nous avons utilisé une sonde fluorescente et avons pu détecter in vivo une production de monoxyde d’azote associée aux cellules tumorales xénogreffées, dont l’utilisation d’un capteur du NO, le cPTIO s’est traduit par une perte de cellules tumorales et une baisse de l’expression d’un facteur angiogénique le VEGF, démontrant une utilisation potentielle dans du cPTIO comme molécule anti-tumorale.L’autre volet d’étude a été l’identification du rôle de HSF1 dans le développement et la différenciation des globules rouges chez le poisson zèbre comme modèle expérimental, dans des conditions de non stress thermique. Pour cela, nous avons inactivé transitoirement le gène hsf1 grâce aux morpholinos, et avons constaté des défauts dans le développement, mais aussi une altération de la différenciation des érythrocytes. / The use of animal models has led to the discovery of important mechanisms of biology development in general, and tumor development in particular, to establish and develop new treatments. The Zebrafish (Danio rerio) is increasingly used nowadays as part of this research because of its many advantages such as the transparency of the larvae, and the high homology with human. Several approaches have been developed in this fish, as the gene-knockdown in order to identify the role of a protein in the development, or the tumor transplantation of mammalian cells to study anti-tumor treatments response.It is in one of these two contexts that we studied the role of nitric oxide in tumor development in zebrafish. We used a fluorescent probe and were able to detect in vivo the production of nitric oxide associated with xenograft tumor cells. The use of an NO scanvenger, the cPTIO resulted in a loss of tumor cells and a decrease in the expression of an angiogenic factor VEGF, showing a potential in the use of cPTIO as antitumor molecule.We used also the transitory invalidation of hsf1 gene, in order to explore a potential new role in the development and red blood cells differentiation in zebrafish as an experimental model, in non heat-shocked conditions. We found that HSF1 was important for the differentiation of erythrocytes, and its inactivation also reflected defects in development.

Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule gazeuse synthétisée par les NO Synthases à partir de L-arginine. NO est une puissante molécule de signalisation dans de nombreux processus physiologiques comme la vasodilatation et la neurotransmission. Il module l’activité de multiples protéines (ex : guanylate cyclase soluble et ribonucléotide réductase) grâce à la nitrosylation de groupements thiol ou de métaux de transition. En tant que radical libre, NO peut réagir avec de nombreuses espèces comme l’oxygène moléculaire, et ainsi former des dérivés réactifs. Grâce à ces propriétés, NO est un acteur majeur de l’immunité innée et de l’inflammation. Les phagocytes produisent de grandes quantités de NO en réponse à des stimuli proinflammatoires, via l’activité NO Synthase inductible (iNOS). En raison des effets délétères des dérivés de NO, l’activité iNOS doit être finement régulée. Le suppresseur de tumeur p53 est capable de réprimer l’expression du gène Nos2 après avoir été lui-même activé en réponse à une accumulation de NO. La protéine p73 est un homologue de p53 encodé par un gène qui génère à la fois des isoformes actives (TAp73) et des isoformes qui sont dépourvues du domaine de transactivation N-terminal et exercent un effet dominant négatif (ΔNp73). Cette étude se focalise sur le rôle des isoformes TAp73 dans la régulation de l’expression de la iNOS. Nous démontrons que les isoformes TAp73 régulent négativement l’expression de la iNOS aux niveaux transcriptionnel et post-traductionnel en potentialisant l’effet répresseur du TGF-β, ce qui résulte en une forte surexpression de la iNOS dans les cellules TAp73-/-. Ces résultats confortent le rôle de la famille p53 comme un réseau essentiel de protéines régulatrices des fonctions du TGF-β. / Nitric oxide (NO) is a gaseous molecule synthesized from L-arginine by Nitric Oxide Synthases. NO acts as a potent signaling molecule in various physiological processes like vasorelaxation and neurotransmission. It modulates the activity of many proteins (e.g. soluble guanylate cyclase and ribonucleotide reductase) through nitrosylation of thiol moieties or transition metal ions. As a free radical, NO can also react with a number of cellular species, notably molecular oxygen, to form reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Thanks to these properties, NO appears as a major component of innate immune response and inflammation. Phagocytes produce large amounts of NO in response to proinflammatory through inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) activity. Because of the harmful effects of NO derivatives on cellular components, iNOS activity needs to be tightly regulated. The p53 tumor suppressor has been shown to repress Nos2 after being activated by NO itself. The p73 protein is an homologous encoded by the TP73 gene that generate transcriptionally active TAp73 isoforms and ΔNp73 isoforms that lack the transactivation domain and exert a dominant negative effect. This study focuses on the role of TAp73 isoforms in regulation of iNOS expression. We demonstrate that TAp73 isoforms potentiate the repressive effect of TGF-β on iNOS expression at transcriptional and post-traductional levels, resulting in a substantial iNOS overexpression in TAp73-/- cells. These results emphasize the emerging role of p53 family as a master regulator of TGF-β functions.

Grâce à un modèle expérimental de la trypanosomose humaine Africaine (THA ou maladie du sommeil), le rat infecté par Trypanosoma brucei brucei, nous avons examiné l’implication du monoxyde d’azote (NO) dans le développement de cette pathologie. Des variations opposées de la concentration de ce composé ont été observées chez les animaux infectés, au niveau des compartiments périphérique et central : le NO diminue au niveau du sang et augmente au niveau cérébral. Ces changements sont dépendants de la NO-synthase inductible (iNOS). Au niveau périphérique, la diminution du NO qui survient favorise l’installation du parasite car la pression trypanocide de ce composé est diminuée. Dans cette situation, la L-arginine, le substrat à la base de la synthèse du NO, est utilisée pour la synthèse de polyamines, des composés nécessaires à la croissance du parasite. Ces mécanismes sont très probablement déclenchés par le trypanosome via ses facteurs solubles. Au niveau cérébral, la synthèse du NO est aussi soumise à des régulations qui impliquent l’arginase et la NG, NG-diméthylarginine diméthylaminohydrolase (DDAH). Tandis que l’activité de l’arginase demeure constante, celle de la DDAH augmente au cours de l’infection en accord avec les données des western-blot et des amino-acides. Cette augmentation, qui dépend essentiellement de l’isoforme DDAH-2, conduit à une augmentation du NO cérébral dont les propriétés sont trypanocides. Ces changements, contraires à ceux observés en périphérie, sont défavorables à la survie du trypanosome au niveau du cerveau. Ils pourraient constituer une protection supplémentaire contre l’entrée des trypanosomes dans cet organe / By way of an experimental model of human African trypanosomiasis (HAT or sleeping sickness), the rat infected by Trypanosoma brucei brucei, we examined the involvement of nitric oxide (NO) in the development of this pathology. In the infected animals, opposite variations in NO concentration were observedeither at peripheral or brain compartments: NO decreases in blood but increases in brain. These changes are dependent on the activity of the inducible NO-synthase (iNOS). In periphery, the decrease observed in NO concentration favors the parasite entrance because the trypanocidal pressure exerted by NO is decreased. In such a situation, L-arginine, the substrate conducing to the synthesis of NO, is employed for the synthesis of polyamines, a category of compounds necessary for the parasite growth. It is likely that above mechanisms might be triggered by parasites. In brain, NO synthesis is submitted to additive complex regulatory processes implying arginase and NG, NG-dimethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH). While the arginase activity remains constant, that of DDAH increases throughout the infection process in keeping with western-blot and amino acids data. This increase, depending mainly on DDAH-2 isoform, lasts in a brain NO increase which enhance the trypanocidal pressure. Above changes, opposite to those observed in periphery, are not favorable to the parasite survival in brain. They might constitute an additive protection against the parasite entry in this organ

Les Iron Regulatory Proteins 1 (IRP1/2) sont des protéines cytosoliques qui contrôlent l’homéostasie du fer chez les mammifères. Elles régulent la concentration de fer intracellulaire au niveau post-transcriptionnel, en interagissant spécifiquement avec des motifs appelés iron responsive élément (IREs). Ces motifs sont localisés dans les régions non traduites des ARNm codant notamment pour la ferritine (Ft), la ferroportine (Fpn) et le récepteur de la transferrine (TfR1). L’IRP1 est une protéine bifonctionnelle, majoritairement exprimée sous une forme contenant un centre [4Fe-4S] qui présente une activité aconitase. Les deux activités de l’IRP1 (aconitase/trans-régulateur) s’excluent mutuellement par la présence ou non du centre Fe-S. L’IRP2 est exprimée constitutivement sous une forme liant les IREs. Le monoxyde d’azote (NO), une importante molécule de signalisation impliquée dans les défenses immunitaires, cible le centre Fe-S de l’IRP1 et permet la conversion de l’IRP1 de sa forme aconitase vers sa forme liant les séquences IREs. Il a également été rapporté que l’IRP2 détecterait NO, cependant la fonction intrinsèque de l’IRP1 et de l’IRP2 dans le contrôle du métabolisme du fer intracellulaire en réponse à NO reste à ce jour non élucidée. Dans cette étude, nous avons identifié le régulateur principal du métabolisme du fer intracellulaire en réponse à NO, en utilisant des modèles de souris déficients pour les gènes IRP1 et/ou IRP2 et testé la contribution de la tension en oxygène dans cette régulation. Ainsi, nous avons exposé des macrophages primaires issus de la moelle osseuse de souris Irp1-/-, Irp2-/- et de souris Irp1-/- Irp2-/- de la lignée macrophagique à une source de NO, sous différentes tensions en oxygène. Les activités IRPs, l’expression des gènes Ft, Fpn et TfR1 ainsi que l’activité d’une protéine à centre Fe-S (l’aconitase mitochondriale) ont été mesurées après fractionnement cellulaire. Nous avons montré qu’en normoxie, la conversion de l’aconitase cytosolique en apo-IRP1 par NO est entièrement responsable de la régulation post-transcriptionnelle des ferritines (L-Ft et H-Ft), de la Fpn et du TfR1. En augmentant le transport du fer intracellulaire et en diminuant le stockage et l’export, l’activation de l’IRP1 par NO servirait à maintenir des taux de fer intracellulaire suffisants pour alimenter la biogenèse des centres Fe-S après l’arrêt des flux de NO. En effet, nous observons une restauration efficace de l’activité de l’aconitase mitochondriale dans les macrophages de souris sauvage alors qu’elle est bloquée dans les macrophages de souris Irp1-/-. De plus, l’IRP1 activée par NO, permet également de diminuer les taux de L- et H-Ft, anormalement élevée dans les macrophages de souris Irp2-/-. Nous montrons que le NO endogène active l’IRP1 sous sa forme trans-régulatrice alors qu’il tend à diminuer l’activité de l’IRP2. Néanmoins, l’IRP1 reste le régulateur principal des ferritines en conditions de normoxie. En condition hypoxique, les deux IRPs semble coopérer pour inhiber la traduction des ferritines car dans les macrophages Irp1-/-exposés à NO, l’IRP2 stabilisée est suffisante pour inhiber la traduction de la L- et H-Ft et ceci malgré l’activation transcriptionnelle des gènes de la L- et H-Ft. Concernant la régulation du TfR1 par NO et en hypoxie, TfR1 est principalement régulé par une voie transcriptionnelle dominant largement la voie post-transcriptionnelle impliquant l’IRP1. Le facteur de transcription HIF-1 alpha pourrait être le régulateur critique dans cette régulation. En conclusion, nous montrons dans cette étude, comment le regulon IRP participe à la régulation du métabolisme du fer intracellulaire en réponse à NO et son étroite connexion avec la concentration en oxygène. Nos résultats soulignent l’importance d’explorer davantage le rôle de l’IRP1 dans des situations inflammatoires in vivo, où les tissus peuvent être exposé à un microenvironnement non hypoxique. / Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) and 2 (IRP2) are two cytosolic regulators of mammalian cellular iron homeostasis. IRPs post-transcriptionally modulate expression of iron-related genes by binding to specific sequences, called Iron Regulatory Elements (IREs), located in the untranslated regions (UTR) of mRNAs. Either of the two IRPs inhibits translation when bound to the single 5’UTR IRE in the mRNA encoding proteins of iron export (ferroportin - Fpn) and storage (ferritin - Ft) or prevents mRNA degradationwhen bound to the multiple IREs within the 3’UTR of the mRNA encoding the transferrinreceptor 1 (TfR1) - iron uptake molecule. The IRE-binding activity of both IRPs respondsto cellular iron levels, albeit via distinct mechanisms. IRP1 is a bifunctional protein, whichmostly exists in its non IRE-binding, [4Fe-4S] aconitase form and can be regulated by apost-translational incorporation or removal of the Fe-S cluster. In contrast to IRP1, IRP2 isnot able to ligate an Fe-S cluster, and its IRE-binding activity is determined by the rate ofits proteasomal degradation. Although both IRP1 and IRP2 can regulate cellular ironhomeostasis, only mice lacking IRP2 were shown to display iron mismanagement in mosttissues. This could be explained by the fact that IRP1 exists mostly in its non IRE−binding,aconitase form under physiological oxygen conditions (3-6%). Interestingly, nitric oxide(NO), an important signalling molecule involved in immune defence, targets the Fe-Scluster of IRP1 in both normoxia and hypoxia, and converts IRP1 from aconitase to anIRE-binding form. It has also been reported that IRP2 could sense NO, but the intrinsicfunction of IRP1 and IRP2 in NO−mediated regulation of cellular iron metabolism hasremained a matter of controversy. In this study, we took advantage of mouse models ofIRP deficiency to define the respective role of IRP1 and IRP2 in the regulation of cellulariron metabolism by NO and assess the contribution of oxygen tension on the regulation.Therefore, we exposed bone marrow-derived macrophages (BMMs) from Irp1-/-, Irp2-/- andmacrophage specific double knockout mosaic mice (Irp1/2-/-) to exogenous andendogenous NO under different oxygen conditions (21% O2 for normoxia and 3-5% forhypoxia experiments) and measured IRPs activities, iron-related genes expression andactivity of Fe-S cluster protein – mitochondrial aconitase. We showed that in normoxia, thegenerated apo-form of IRP1 by NO was entirely responsible for the post-transcriptionalregulation of TfR1, H-Ft, L-Ft and Fpn. Moreover, by increasing iron uptake and reducingiron sequestration and export, NO−dependent IRP1 activation served to maintainadequate levels of intracellular iron in order to fuel the Fe−S biosynthetic pathway, asdemonstrated by the efficient restoration of the mitochondrial Fe−S aconitase, which wasprevented under IRP1 deficiency. Furthermore, activated IRP1 was potent enough todown-regulate the abnormally increased L-Ft and H-Ft protein levels in Irp2-/-macrophages. Endogenous NO activated IRP1 IRE-binding activity and tended todecrease IRP2 IRE-binding activity. Nevertheless, IRP1 was the predominant regulator offerritin in those conditions. In hypoxia, in Irp1+/+ and Irp2+/+ macrophages exposed to NO,both stabilized IRP2 and NO-activated IRP1 seemed to cooperate to inhibit ferritinsynthesis. However, in Irp1-/- cells, IRP2 stabilized in hypoxia was sufficient to inhibit LandH-Ft synthesis despite the concomitant increase of corresponding mRNAs.Interestingly, TfR1 was shown to be predominantly regulated at the transcriptional level byNO in hypoxia, in which HIF-1 alpha may be the critical regulator. In conclusion, we revealin this study how the IRP regulon participates in the regulation of cellular iron metabolismin response to NO and its intimate interplay with the oxygen pathway. The findingsunderlie the importance to further explore the role of IRP1 in inflammation in vivo, in nonhypoxictissue microenvironments.

Depuis quelques décennies, de nombreuses données suggèrent que l’effet protecteur cardiovasculaire des anthocyanes implique vraisemblablement une amélioration de la fonction endothéliale par une augmentation de la formation de monoxyde d’azote (NO). Cependant, les mécanismes protecteurs du transport intracellulaire des anthocyanes dans la cellule endothéliale demeurent mal compris. L’objectif de cette thèse est d’évaluer la contribution de SGLT1 et SGLT2, les co-transporteurs majeurs du sodium et du glucose, dans l’entrée des anthocyanes issues du cassis et de ses dérivés glucoside et rutinoside dans les cellules endothéliales. Cette entrée promeut l’activation de la voie de la monoxyde d’azote synthase endothéliale (eNOS) qui est ici étudiée par l’utilisation de vaisseaux isolés et de cellules endothéliales en culture. Un extrait de cassis riche en anthocyanes (BCE) induit la relaxation dépendante de l’endothélium par la voie du NO sur des anneaux d’artère coronaire de porc et active la voie de signalisation Akt-eNOS au sein des cellules endothéliales en culture. De plus, des expériences additionnelles suggèrent que l’effet protecteur des anthocyanes dépend à la fois du type de glucoside présent dans la structure des anthocyanes mais aussi de la contribution des transporteurs SGLTs dans l’influx cellulaire des anthocyanes. La capacité des anthocyanes à lutter contre la dysfonction endothéliale est hautement potentialisée dans un modèle cellulaire de sénescence réplicative par l’augmentation de l’influx des anthocyanes due à une forte expression des SGLTs. L’ensemble de ces données indique que les anthocyanes extraits du cassis sont de puissants activateurs de la voie du NO endothélial dans les cellules natives et en culture. Parmi les anthocyanes contenus dans le cassis, les dérivés glycosidiques comme la cyanidine et la delphinidine-3-O-glucoside, sont les anthocyanes les plus puissantes afin d’activer la voie du NO. En conclusion, les anthocyanes peuvent être particulièrement intéressantes afin de cibler précocement les sites à risque d’athérosclérose par leur effet de stimulation de l’expression des transporteurs SGLT1 et 2. / Since last few decades, considerable data have been suggested that the protective effect of anthocyanin on cardiovascular system is likely to involve an improvement of endothelial function by increase nitric oxide (NO) formation. However, comprehensive studies on the subsequent mechanisms of protective effect by anthocyanin intracellular transportation in vascular endothelial cell is poorly understood. The aim of this thesis is to evaluate the possibility that SGLT1 and 2, the two major sodium-glucose cotransporters (SGLT), contribute to blackcurrant anthocyanins and its major glucoside- and rutinoside-conjugated anthocyanins uptake into endothelial cells that promoting the subsequent activation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) pathway using isolated blood vessels and cultured endothelial cells. An anthocyanin rich blackcurrant extract (BCE) induced NO-mediated endothelium dependent relaxation in porcine coronary artery rings and activated Akt-eNOS signaling pathway in cultured endothelial cell. Furthermore, additional experiments suggested that such a protective effect of anthocyanin is based on the type of glucoside in anthocyanin structure and contribution of SGLTs for the intracellular transportation of anthocyanins. An ability of anthocyanin against endothelial dysfunction is highly potentiated in the endothelial cell replicative senescence model by the increase anthocyanin efflux according to the high expression of SGLTs. Altogether, the present findings indicate that blackcurrant anthocyanins are potent activator of the endothelial NO pathway in native and cultured endothelial cells. Among blackcurrant anthocyanins, glucose derivatives such as cyanidin and delphinidin -3-O-glucoside are the most potent anthocyanins for activation of NO pathway. In conclusion, anthocyanin can be more prominent by preferentially targeting an early stage of atherosclerotic site by their increase expression of SGLT1 and 2.

De nombreuses études ont indiqué que la consommation régulière d’aliments riches en polyphénols comme le vin rouge, le thé, ou les fruits est associée à une réduction du risque de pathologies cardiovasculaires chez l’homme et les animaux. L’effet bénéfique des polyphénols sur le système cardiovasculaire est dû, au moins en partie, à leur action directe sur les vaisseaux sanguins en améliorant la fonction endothéliale. En effet, de nombreuses études indiquent que les polyphénols induisent des relaxations dépendantes de l’endothélium dans les artères isolées en stimulant la formation endothéliale de monoxyde d’azote (NO). La comparaison des relaxations induites par 13 jus et purées de fruits différents dans les artères coronaires de porc a permis de sélectionner l’Aronia melanocarpa en raison de sa grande activité et de sa forte teneur en polyphénols. L’Aronia melanocarpa est un puissant inducteur de relaxations dépendantes de l’endothélium en stimulant la formation endothéliale de NO. Cette formation accrue de NO implique l’activation rédox-sensible de la voie Src/PI3-kinase/Akt qui va phosphoryler la NO synthase sur son site activateur entraînant une formation rapide de NO. A plus long terme, l’Aronia melanocarpa stimule l’expression de la NO synthase via un mécanisme rédox-sensible impliquant les voies PI3-kinase/Akt, JNK, et p38 MAPK, et entraînant la phosphorylation inactivatrice des facteurs de transcription FoxO1 et Fox3a; cet effet prévient la régulation négative de l’expression de la NO synthase endothéliale. En conclusion,nos études révèlent le potentiel d’Aronia melanocarpa à améliorer la protection vasculaire par la stimulation soutenue de la formation de NO. / Many studies indicated that the regular consumption of drink or food rich in polyphenols like red wine, green tea, fruits, vegetables and chocolate is associated with a reduction of the risk of cardiovascular pathologies in human and animals. The beneficial effect of polyphenols, well known as antioxidants, on the cardiovascular system is due at least partly to their direct action on the blood-vessels by improving the endothelial function. Indeed, many studies indicate that the polyphenols induce the endothelium-dependent vasorelaxation in the isolated arteries by stimulating the formation of endothelial nitric oxide (NO). Comparing the endothelium-dependent relaxations induced by 13 different fruit juices and purees in the isolated porcine coronary arteries, Aronia melanocarpa was selected due to its high activity and the highest polyphenol content. Aronia melanocarpa is a potent inducer of endothelium-dependent relaxation in coronary artery by stimulating the formation of endothelial NO. This increased formation of NO involves the redox-sensitive activation of the Src/PI3-kinase/Akt pathway leading to the phosphorylation of eNOS at the activation site, Ser1177, during the rapid formation. Further for the long-term, Aronia melanocarpa stimulates the expression of eNOS via a redox-sensitive mechanism involving PI3-kinase/Akt, JNK, p38 MAPK pathways and the subsequent inactivation of transcription factors FoxO1 and FoxO3a by phosphorylation; this effect prevents their negative regulation of eNOS expression. In conclusion, our studies reveal the potential of Aronia melanocarpa to improve vascular protection by stimulating in a constant way the formation of endothelial NO.

Les études entreprises depuis une douzaine d'années indiquent que le monoxyde d'azote (NO) est un médiateur physiologique impliqué dans de nombreux processus chez les plantes, incluant la germination, le développement des racines, la fermeture des stomates ou encore la réponse adaptative aux stress biotiques et abiotiques. Malgré cet important panel de fonctions, les mécanismes sous-jacents aux effets du NO ont été peu appréhendés et restent pour l'essentiel énigmatiques. Le travail présenté dans ce manuscrit s'inscrit dans cette problématique et a consisté en l’identification et la caractérisation de protéines cibles du NO chez le tabac dans le contexte de stress biotiques et abiotiques. Nous avons démontré que la cryptogéine, un éliciteur des réactions de défense, induit la S-nitrosylation rapide et transitoire de plusieurs protéines dans des suspensions cellulaires de tabac. Après purification, une douzaine de ces protéines ont été identifiées via une analyse par spectrométrie de masse. Celles-ci incluent notamment une protéine chaperonne de la famille des AAA-ATPase nommée CDC48 (Cell Division Cycle 48). Cette dernière a fait l'objet d'une étude structure/fonction approfondie afin d'appréhender l'impact de sa S-nitrosylation. Après avoir vérifié que la protéine recombinante était S-nitrosylable in vitro, nous avons démontré que ce processus n'affecte pas la structure secondaire de la protéine mais induit des modifications locales de sa structure tertiaire et une inhibition de son activité ATPasique. Le résidu cystéine 526, localisé dans le second domaine ATPasique de la protéine, a été identifié comme site probable de S-nitrosylation. Cette localisation stratégique pourrait expliquer l'effet inhibiteur du NO sur l'activité enzymatique de CDC48. La dernière partie de ce travail a été centrée sur l'analyse des mécanismes par lesquels le NO active la protéine kinase NtOSAK (Nicotiana tabacum stress activated protein kinase) chez le tabac. Nous avons démontré que NtOSAK forme un complexe constitutif avec la glycéraldéhyde 3 phosphate deshydrogénase (GAPDH). En réponse à un stress salin, le NO promeut l'activation de NtOSAK via la phosphorylation de deux résidus serine localisés dans la boucle d'activation de l'enzyme. De plus, il induit une S-nitrosylation rapide de la GAPDH, ce processus n'affectant pas la formation du complexe. Notre hypothèse est que ce complexe constituerait une plateforme de signalisation régulée par le NO et pouvant recruter les protéines cibles de NtOSAK lors de la réponse au stress salin. / Studies conducted over the past ten years indicate that nitric oxide (NO) is a physiological mediator involved in many physiological processes in plants, including germination, root development, stomatal closure or responses against biotic or abiotic stresses. Despite this important range of functions, the mechanisms underlying the effects of NO in plants remain largely unknown. The present work aims at identifying and functionally characterizing NO target proteins in tobacco in the context of biotic and abiotic stresses. We demonstrated that cryptogein, an elicitor of defense responses, induces a rapid and transient S-nitrosylation of several proteins in tobacco cell suspensions. After purification, a dozen of these proteins have been identified through mass spectrometry analysis. These proteins include CDC48 (Cell Division Cycle 48), a chaperone-like protein belonging to the AAA-ATPase family. The regulation of CDC48 by NO was deeply investigated using a combination of structural and biochemical analyses. Once the in vitro S-nitrosylation of CDC48 was confirmed, we next demonstrated that this process does not affect the secondary structure of the protein but induces local changes in its tertiary structure together with an inhibition of its ATPase activity. The cysteine residue 526, located in the second ATPase domain of the protein, was identified as a probable S-nitrosylation site. This crucial localization may explain the inhibitory effect of NO on CDC48 enzymatic activity. The last part of this work was focused on the analysis of the mechanisms underlying the NO-dependent activation of the protein kinase NtOSAK (Nicotiana tabacum stress activated protein kinase) in tobacco. We demonstrated that NtOSAK forms a constitutive complex with glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). In response to salt stress, NO promotes the activation of NtOSAK via the phosphorylation of two serine residues located in the activation loop of the enzyme. Moreover, it induces a rapid S-nitrosylation of GAPDH. Interestingly, this latter process does not affect the complex formation. Our hypothesis is that once S-nitrosylated, GAPDH might act as a phosphorelay recruiting protein substrates for NtOSAK.

La grossesse est un état physiologique particulier où de nombreux changements fonctionnels et structuraux surviennent. Chez la rate, pour répondre aux besoins grandissants du fœtus, l’artère utérine se développe pour atteindre le double de son diamètre original avant parturition. Par conséquent, le débit sanguin utérin augmente d’environ vingt fois. Pour ce faire, les vaisseaux utérins sont l’objet d’un remodelage caractérisé par une hypertrophie et une hyperplasie des différentes composantes de la paroi. De plus, ce remodelage est complètement réversible après la parturition, par opposition au remodelage vasculaire « pathologique » qui affecte les artères systémiques, dans l’hypertension chronique, par exemple. La grossesse s’accompagne aussi de modifications hormonales importantes, comme les œstrogènes dont la concentration s’accroît progressivement au cours de cette période. Elle atteindra une concentration trois cents fois plus élevée avant terme que chez une femme non gravide. Cette hormone possède de multiples fonctions, ainsi qu’un mode d’action à la fois génomique et non génomique. Considérant l’ensemble de ces éléments, nous avons formulé l’hypothèse que l’œstradiol serait responsable de modifier la circulation utérine durant la grossesse, par son action vasorelaxante, mais aussi en influençant le remodelage de la vasculature utérine. Nous avons montré que le 17β-Estradiol (17β-E2) produit une relaxation due à un effet non génomique des artères utérines en agissant directement sur le muscle lisse par un mécanisme indépendant du monoxyde d’azote et des récepteurs classiques aux œstrogènes (ERα, ERβ). De plus, la relaxation induite par le 17β-E2 dans l’artère utérine durant la gestation est réduite par rapport à celle des artères des rates non gestantes. Ceci serait attribuable à une diminution de monoxyde d’azote provenant de la synthase de NO neuronale dans les muscles lisses des artères utérines. Nos résultats démontrent que le récepteur à l’œstrogène couplé aux protéines G (GPER), la protéine kinase A (PKA) et la protéine kinase G (PKG) ne sont pas impliqués dans la signalisation intracellulaire associée à l’effet vasorelaxant induit par le 17β-E2. Cependant, nous avons montré une implication probable des canaux potassiques sensibles au voltage, ainsi qu’un rôle possible des canaux potassiques de grande conductance activés par le potentiel et le calcium (BKCa). En effet, le penitrem A, un antagoniste présumé des canaux potassiques à grande conductance, réduit la réponse vasoralaxante du 17β-E2. Toutefois, une autre action du penitrem A n’est pas exclue, car l’ibériotoxine, reconnue pour inhiber les mêmes canaux, n’a pas d’effet sur cette relaxation. Quoi qu’il en soit, d’autres études sont nécessaires pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la relaxation non génomique sur le muscle lisse des artères utérines. Quant à l’implication de l’œstrogène sur le remodelage des artères utérines durant la gestation, nous avons tenté d’inhiber la synthèse d’œstrogènes durant la gestation en utilisant un inhibiteur de l’aromatase. Plusieurs paramètres ont été évalués (paramètres sanguins, réactivité vasculaire, pression artérielle) sans changements significatifs entre le groupe contrôle et celui traité avec l’inhibiteur. Le même constat a été fait pour le dosage plasmatique de l’œstradiol, ce qui suggère l’inefficacité du blocage de l’aromatase dans ces expériences. Ainsi, notre protocole expérimental n’a pas réussi à inhiber la synthèse d’œstrogène durant la grossesse chez le rat et, ce faisant, nous n’avons pas pu vérifier notre hypothèse. En conclusion, nous avons démontré que le 17β-E2 agit de façon non génomique sur les muscles lisses des artères utérines qui implique une action sur les canaux potassiques de la membrane cellulaire. Toutefois, notre protocole expérimental n’a pas été en mesure d’évaluer les effets génomiques associés au remodelage vasculaire utérin durant la gestation et d’autres études devront être effectuées. / Pregnancy is a peculiar physiological state in which many structural and functional changes occur. In rats, to meet the growing needs of the fetus, uterine artery expands to reach twice its original diameter before parturition. Therefore, uterine blood flow increases by about twenty times. To do this, the uterine vessels undergo substantial remodelling characterized by hypertrophy and hyperplasia of the various components of the wall. Furthermore, this remodelling is completely reversible after parturition, as opposed to “pathological vascular remodelling” that affects systemic arteries in chronic hypertension, for instance. Pregnancy is also accompanied by significant hormonal changes, such as estrogens whose concentration in the blood increases progressively during this period. It reaches concentrations three hundred times higher before term than in non-pregnant women. This hormone has multiple functions and mediates its effects by genomic and non-genomic pathways. Considering these elements, we hypothesized that estradiol would be responsible for remodeling the uterine circulation during pregnancy, by its vasorelaxant action, but also by influencing the remodeling of the uterine vasculature. We have shown that 17β-Estradiol (17β-E2) produced non-genomic relaxation of uterine arteries by acting directly on smooth muscle using a mechanism independent of nitric oxide and classical estrogen receptors (ERα, ERβ). Moreover, the relaxation induced by 17β-E2 in the uterine artery during pregnancy is reduced compared to that of arteries from non-pregnant animals. This is the result of decrease of nitric oxide derived from neuronal NO synthase in smooth muscle of uterine arteries. Our results also show that the estrogen receptor coupled to G proteins (GPER), protein kinase A (PKA) and protein kinase G (PKG) are NOT involved in intracellular signaling associated with the vasorelaxant effect induced by the 17β-E2. Moreover, we have shown a possible involvement of potassium channels sensitive to voltage and a possible involvement of large conductance calcium-activated potassium channels (BKCa). Indeed, the penitrem A, a suspected antagonist of BKCa, reduced the vasoralaxant responses of 17β-E2. However, some other actions of penitrem A are not excluded because iberiotoxin, known to inhibit the same channels, had no effect on this relaxation. However, further studies are needed to obtain a better understanding of the mechanisms involved in the relaxation non-genomics on the smooth muscle of uterine arteries. As for the involvement of estrogen on the remodeling of uterine arteries during pregnancy, we attempted to inhibit the synthesis of estrogen during pregnancy using an aromatase inhibitor. Several parameters were evaluated (plasma values, vascular reactivity, blood pressure) without significant changes between the control group and those treated with the inhibitor. The same observation was made for the determination of plasma estradiol, suggesting the uneffectiveness of aromatase blocking in these experiments. Thus, our experimental protocol failed to inhibit the synthesis of estrogen in rats during pregnancy and, in so doing, we cannot confirm or refute our hypothesis. In conclusion, we demonstrated that 17β-E2 acts on smooth muscle of the uterine arteries by a non-genomic pathway by apparently acting on potassium channels. However, our experimental protocol was not able to assess the genomic effects associated with uterine vascular remodeling during pregnancy and further studies are required to ascertain this aspect of our work.

L’inhalation de monoxyde d’azote (NO) est l’une des thérapies les plus utilisées en réanimation néonatale. Cependant, peu de données sont disponibles sur l’impact de l’inhalation de NO sur le développement cérébral et le devenir des enfants prématurés. Nous avons étudié l’impact du monoxyde d’azote inhalé (iNO) sur le cerveau en développement chez le rongeur. Des portées et leur mère sont placés sous 5 à 20 ppm de NO de la naissance (P0) jusqu’au 7ème jour de vie postnatal (P7). Les animaux exposés au NO présentent une augmentation transitoire de l’angiogenèse et de la myélinisation, sans incidence sur les fonctions cognitives à l’âge adulte. L’exposition au NO est associée à une prolifération d’oligodendrocytes immatures et à une maturation anticipée des formes myélinisantes. Les rôles du NO endogène et du couple VEGF/VEGFR2 dans ces effets ont été évalués via l’injection d’antagonistes : LNAME pour inhiber les NOS, SU-5416 comme antagoniste du VEGFR2. Dans les deux cas, l’inhalation de NO corrige les anomalies de myélinisation et d’angiogenèse induites par ces inhibiteurs. Nous avons soumis des ratons à une agression excitotoxique par injection intracérébrale d’agonistes du glutamate. A P10 les rats exposés au iNO avant l’injection présentent des lésions moins importantes ; ainsi qu’un diminution de densité des microglies activées et des astrocytes. Cet effet neuroprotecteur est associé à une régulation de sous-unités des récepteurs au glutamate dès P5. Cet effet transcriptionnel semble lié à la modulation de la signalisation pCREB/Akt. Les effets à distance du iNO sont liés à un transport réversible endovasculaire du NO. In fine, du NO est delivré à la cellule et les concentrations intracellaires de cGMP augmentent d’un facteur 5. Plusieurs facteurs de transcription sont régulés : PDGFR-α, Sema3F, les sous-unités des récepteurs au glutamate, Thrombospondine-1. Cette dernière est un antagoniste naturel de la signalisation NO-cGMP. L’injection de ABT-510, agoniste de TSP-1, abolit les effets du iNO, confirmant l’hypothèse que les effets à distance reposent sur la signalisation NO-Guanylate Cyclase soluble-cGMP. Au total, nous avons démontré que le iNO est transporté de manière réversible et delivré au cerveau en développement. Il y exerce un effet pro-angiogénique et pro-myélinisant, via une signalisation cGMP, régulée par la thrombospondine-1. Plus encore, l’exposition prophylactique au iNO diminue l’impact d’une agression excitotoxique. Ce qui augure de propriétés neuroprotectrices prometteuses en néonatalogie, et au delà. / Inhaled nitric oxide (iNO) is one of the most promising therapies used in neonates, but littlei known about its effect on the developing brain. We explored the effects of iNO on developing brain in rodent pups, and pathway involved in iNO remote effects. Rat pups and their mothers were placed in a chamber containing 5 to 20 ppm of NO for 7 days after birth. Extensive serum analysis, immunochemistry, RT-PCR analysis, were performed Neonatal exposure to iNO was associated with a transient increase in central nervous system myelination and angiogenesis in rats, without any behavioral consequences in adulthood. Exposure to iNO was associated with a proliferative effect on immature oligodendrocytes and a subsequent promaturational effect. The role of endogenous NO in myelination was investigated in animals treated with the nitric oxides synthase inhibitor N-nitro-L- arginine methyl ester (L-NAME) in the neonatal period ; this led to protracted myelination defects and subsequent behavioral deficits in adulthood. These effects were reversed by rescuing L-NAME-treated animals with iNO. We challenged animals with intracranial injection of glutamate agonists. At P10, rat pups exposed to iNO exhibited a significant decrease of lesion size in both the white matter and cortical plate compared to controls. Microglia activation and astrogliosis were found significantly decreased in NO-exposed animals. This neuroprotective effect was associated with a significantdecrease of several glutamate receptor subunits expression at P5. iNO was associated with an early(P1) downregulation of pCREB/pAkt expression and induced an increase in pAkt proteinconcentration in response to excitotoxic challenge (P7) Those effects were related to a release of NOto the cells, and a rise of cGMP intracellular concentration. Several transcription factor wereregulated, namely PDGFR-α, Sema3F, TSP-1, glutamate receptors subunits, Thrombospondin-1. Thelatter was responsible for NO pathway regulation, and injection of TSP-1 agonist (AbT-510) abolishediNO remote effects. iNO remote effects are not associated VEGF concentration increase nor VEGFRstimulation, as VEGF-R antagonist SU54-16 failed to abolish iNO effects on angiogenesis andmyelination. Moreover iNO reverses severe myelination and angiogenesis defects induced by this SU-5416. Thus, we demonstrate transport and considerable remote effect of iNO on angiogenesis andmyelination in rodents. Those effects are related to an enhancement of cGMP pathway, regulated byTSP-1, and transcriptional effects. Moreover we described and investigated the neuroprotectiveeffect of iNO in neonatal excitotoxic-induced brain damage. These data point to potential newavenues for neuroprotection in human perinatal brain damage.

L'objectif principal de cette thèse est de déterminer le rôle des communautés microbiennes dans les émissions de N2O du sol, et plus précisément de définir dans quelle mesure les champignons sont impliqués. Par conséquent, leur structure communautaire à l'échelle micro, leur comportement dans la réduction de l'azote et la production de N2O, et leur interaction avec les communautés microbiennes impliquées dans le cycle de l'azote en tant que décomposeurs de matière organique dans le sol ont été étudiés. L'analyse des fractions de sol du parc Rothamsted a montré que les communautés fongiques changent au sein de fractions isolées, contrairement aux communautés bactériennes. De plus, des potentiels de nitrification, de dénitrification et de réduction de N2O ont été détectés dans toutes les fractions et se sont révélés liés à la chimie du carbone et de l'azote. Des expériences quantifiant la production de NO et N2O à partir de nitrite sur 24 souches de champignons de culture pure ont montré que les espèces de Fusarium sont de véritables producteurs de N2O parmi les champignons. Le suivit de NO a révélé que le milieu de nitrite est instable dans des conditions anoxiques et produit du NO abiotiquement, ce qui implique que des souches produisant du N2O à de faibles taux détoxifient ce NO plutôt que de le respirer, comme précédemment supposé. L’absence d’un nirK - p450nor dans la plupart des champignons a étayé cette hypothèse. Les relations interspécifiques entre champignons et bactéries ont été étudiées après l'addition de matière organique. Différentes modifications organiques ont déclenché des réponses distinctes en termes d’activité bactérienne et fongique sein d'une même communauté de sol. Les signatures fonctionnelles identifiées dans cette étude corroborent notre hypothèse selon laquelle les champignons sont impliqués dans la production de N2O en influençant les bactéries impliquées dans le cycle N par des processus de dégradation de glucides. Les résultats de cette thèse fournissent une base pour explorer les relations interspécifiques dans le cycle biogéochimique de l’azote dans le sol et marque une étape vers l'intégration de tous les membres de la communauté dans la recherche sur les écosystèmes du sol. / The main objective of this thesis is to determine the role of microbial communities in N2O emissions from soil, and more specifically to define to what extent fungi are involved. Therefore, their community structure at the micro scale, their behavior in reducing nitrogen and producing N2O, and their impact on nitrogen cycling communities as decomposers in soil were investigated. Analysis of soil fractions of unmanaged, pristine Rothamsted Park Grass soil showed that fungal communities change within isolated fractions in contrast to bacterial communities. Also, nitrifying, denitrifying and N2O reducing potentials were detected in all fractions and found to be linked to carbon and nitrogen chemistry. Pure culture experiments on 24 fungal strains quantifying NO and N2O production from nitrite showed that Fusarium species are true N2O producers among fungi. Monitoring NO revealed that nitrite medium is unstable under anoxic conditions and produces NO abiotically, which implies that low N2O producing strains are actually detoxifying this NO rather than respiring it, as previously assumed. The lack of a nirK - p450nor in most fungi supported this hypothesis. Interspecies relationships between fungi and bacteria were studied following community development after organic matter addition. Different organic amendments triggered distinct responses of a soil community with respect to bacterial and fungal activity. Functional signatures identified in this study corroborated our hypothesis that fungi are involved in N2O production by influencing a N-cycling bacterial community via carbohydrate degradation processes. The results from this thesis provide a basis for exploring interspecies relationships in nitrogen cycling processes in soil and mark a step towards integrating all members of the community in soil ecosystem research.