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Two Methodologies in Pursuit of the Elucidation of Copper (II)—Centered Bioinorganic ChemistryWagner, William John 30 March 2009 (has links)
Copper is a widely distributed transition metal in the earth's crust and has been adopted in a variety of biological systems. In many ways the biochemical usefulness of copper stems from its positive redox potential. This positive redox potential allows copper to assist in the movement of electrons. Copper ions can be found in natural systems as either CuI, CuII or CuIII in part due to this redox potential. While CuII -centered biochemistry has been studied for years, mechanistic details in certain CuII -centered redox reactions remain unresolved. This study presents two methodologies for studying natural systems with known CuII -centered redox capabilities in order to better elucidate the mechanistic intricacies of Copper ion chemistry. The first method explored involves the promiscuous enzyme Streptomyces griseus aminopeptidase (SgAP) which although known primarily as a peptidase has been shown to oxidize catechol under near physiological conditions in vitro when its native ZnII ions are replaced by CuII ions. Protein engineering techniques were utilized toward expression a functional recombinant enzyme in wild type and mutant forms. The goal was to utilize Site directed mutagenesis of residues in the active site to determine which residues are involved in both the hydrolysis and the oxidative activities of SgAP. The second methodology explored was the use of the N-terminus of Histatin-5, a naturally occurring peptide that is known to form complexes with CuII, as a model system to study CuII -centered oxidation chemistry. Metal-Peptide complexes are much more simplified model systems which use the same building blocks as proteins, but reduce the structure to the minimal functional unit necessary for activity. This in turn, simplifies the study of their catalytic chemistry as influences outside of the active region are greatly reduced. Furthermore, chemical synthesis of short peptides is easily performed and inexpensive in comparison to protein engineering, thus enabling further exploration, if deemed necessary, to be a feasible and economically viable possibility.
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Funktion glykolytischer Enzyme von Mycoplasma pneumoniae in der Wirt-Erreger-InteraktionGründel, Anne 24 November 2016 (has links) (PDF)
Mycoplasma pneumoniae ist ein parasitär lebendes Bakterium, das eine atypische Pneumonie beim Menschen verursacht. Aufgrund seiner geringen Genomgröße besitzt dieser Organismus einen eingeschränkten Metabolismus sowie eine limitierte Zahl an Pathogenitätsfaktoren. Dennoch ist dieser Mikroorganismus perfekt an seinen Wirt angepasst und es war zu vermuten, dass neben dem komplexen Adhäsionsapparat von M. pneumoniae auch glykolytische Enzyme eine Rolle bei der Interaktion mit humanen Zellen spielen. Diese Enzyme sind maßgeblich bei intrazellulär ablaufenden Stoffwechselprozessen beteiligt. Es wurde jedoch bereits bei anderen Bakterien gezeigt, dass glykolytische Enzyme ebenfalls auf der Bakterienoberfläche zu finden sind und dort mit Komponenten der extrazellulären Matrix des Wirtes interagieren können. Dieser Vorgang trägt offensichtlich zur erfolgreichen Kolonisation des Wirtes bei. Ziel dieser Arbeit war es, alle glykolytischen Enzyme von M. pneumoniae hinsichtlich ihrer Lokalisierung zu beschreiben und Teilaspekte ihrer Funktion in der Interaktion mit Wirtskomponenten zu analysieren.
Die glykolytischen Enzyme wurden rekombinant produziert und für die Herstellung von monospezifischen polyklonalen Antikörpern verwendet. Die Lokalisation der Enzyme wurde durch Nachweis in der Membran- und Zytosolfraktion des M. pneumoniae Gesamtantigens untersucht. Mittels Immunfluoreszenz, Colony Blot und Protease-Verdau intakter Bakterienzellen wurde bestätigt, dass acht (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Transketolase, Pyruvatdehydrogenase, Phosphoglyceratmutase und Pyruvatdehydrogenase Untereinheiten A-C) der 19 glykolytischen Enzyme mit der Bakterienoberfläche assoziiert vorkommen.
Die Untersuchung von Mutanten ergab, dass die Lokalisation der Enzyme nicht an das Vorkommen der für die Anheftung der Bakterien an Zielstrukturen wesentlichen Adhäsine wie die Proteine P1, P40 und P90 sowie das Oberflächenprotein P01, gekoppelt ist. Jedoch sind sowohl intakte Zellen von M. pneumoniae als auch die oberflächenlokalisierten glykolytischen Enzyme in der Lage, an verschiedene humane Zellen zu binden. Eine Analyse der nachweisbaren Proteine auf der Oberfläche der Zellen führte zur Auswahl von sechs humanen Proteinen für weiterführende Studien: Plasminogen, Vitronektin, Fibronektin, Fibrinogen, Laminin und Laktoferrin. Mittels ELISA wurde eine konzentrationsabhängige Bindung der oberflächenassoziierten Enzyme von M. pneumoniae mit Wirtsproteinen festgestellt, die hinsichtlich der Intensität jedoch Unterschiede aufwies. So konnten ausgeprägte Interaktionen aller Enzyme mit humanem Plasminogen und Vitronektin nachgewiesen werden. Die Bindung von Fibronektin und Laktoferrin ist dagegen nur für einen Teil der glykolytischen Enzyme zu bestätigen. Die Untersuchung verschiedener Einflussfaktoren ergab, dass alle Bindungen zwischen glykolytischen Enzymen und humanen Proteinen spezifisch durch die entsprechenden Antiseren gehemmt werden und dass der Großteil der Interaktionen ionischen Wechselwirkungen unterliegt. Die Bindung zu Plasminogen basiert überwiegend auf Lysin-Resten. Untersuchungen, ob sich die glykolytischen Enzyme gegenseitig in der Bindung zu Wirtsfaktoren beeinflussen, ergab ein komplexes Muster, das hinsichtlich Plasminogen, Fibronektin und Laminin für eine Überlagerung der für die Interaktion maßgeblichen Proteinbereiche spricht.
Die Untersuchung einer möglichen Aktivierung von inaktivem Plasminogen zu proteolytisch aktivem Plasmin ergab, dass in Gegenwart aller oberflächenlokalisierten glykolytischen Enzyme von M. pneumoniae Plasmin gebildet wird. Es wurden jedoch Unterschiede im Aktivierungspotenzial nachgewiesen. Die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B zeigte die höchste, die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C die geringste Plasminproduktion. Die Verwendung des gewebespezifischen Plasminogenaktivators führte zu einer höheren Aktivierung als der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator. Die Variabilität der Plasminproduktion kann mit der unterschiedlichen Bindungsaffinität der glykolytischen Enzyme zu Plasminogen begründet werden. So besitzt die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B im Vergleich mit der Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C ein höheres Bindepotenzial, das sich in der gemessenen Aktivierung widerspiegelt. Die Bildung von Plasmin kann zum Abbau verschiedener extrazellulärer Matrix-Proteine führen. Diese Prozesse sind physiologisch, z. B. in der Fibrinolyse, von Bedeutung. Während in Gegenwart der glykolytischen Enzyme die humanen Proteine Laktoferrin, Laminin und Fibronektin nicht abgebaut wurde, konnte Fibrinogen in Gegenwart der Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B bzw. der Phosphoglyceratmutase und Vitronektin durch alle glykolytischen Enzyme (bis auf die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C) degradiert werden.
Mit der erstmals durchgeführten Analyse aller glykolytischen Enzyme eines Mikroorganismus hinsichtlich ihrer Lokalisation und der Bindung zu Komponenten der humanen extrazellulären Matrix wurde ein komplexes Netzwerk an Wirt-Erreger-Interaktionen nachgewiesen.
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Funktion glykolytischer Enzyme von Mycoplasma pneumoniae in der Wirt-Erreger-InteraktionGründel, Anne 28 October 2016 (has links)
Mycoplasma pneumoniae ist ein parasitär lebendes Bakterium, das eine atypische Pneumonie beim Menschen verursacht. Aufgrund seiner geringen Genomgröße besitzt dieser Organismus einen eingeschränkten Metabolismus sowie eine limitierte Zahl an Pathogenitätsfaktoren. Dennoch ist dieser Mikroorganismus perfekt an seinen Wirt angepasst und es war zu vermuten, dass neben dem komplexen Adhäsionsapparat von M. pneumoniae auch glykolytische Enzyme eine Rolle bei der Interaktion mit humanen Zellen spielen. Diese Enzyme sind maßgeblich bei intrazellulär ablaufenden Stoffwechselprozessen beteiligt. Es wurde jedoch bereits bei anderen Bakterien gezeigt, dass glykolytische Enzyme ebenfalls auf der Bakterienoberfläche zu finden sind und dort mit Komponenten der extrazellulären Matrix des Wirtes interagieren können. Dieser Vorgang trägt offensichtlich zur erfolgreichen Kolonisation des Wirtes bei. Ziel dieser Arbeit war es, alle glykolytischen Enzyme von M. pneumoniae hinsichtlich ihrer Lokalisierung zu beschreiben und Teilaspekte ihrer Funktion in der Interaktion mit Wirtskomponenten zu analysieren.
Die glykolytischen Enzyme wurden rekombinant produziert und für die Herstellung von monospezifischen polyklonalen Antikörpern verwendet. Die Lokalisation der Enzyme wurde durch Nachweis in der Membran- und Zytosolfraktion des M. pneumoniae Gesamtantigens untersucht. Mittels Immunfluoreszenz, Colony Blot und Protease-Verdau intakter Bakterienzellen wurde bestätigt, dass acht (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Transketolase, Pyruvatdehydrogenase, Phosphoglyceratmutase und Pyruvatdehydrogenase Untereinheiten A-C) der 19 glykolytischen Enzyme mit der Bakterienoberfläche assoziiert vorkommen.
Die Untersuchung von Mutanten ergab, dass die Lokalisation der Enzyme nicht an das Vorkommen der für die Anheftung der Bakterien an Zielstrukturen wesentlichen Adhäsine wie die Proteine P1, P40 und P90 sowie das Oberflächenprotein P01, gekoppelt ist. Jedoch sind sowohl intakte Zellen von M. pneumoniae als auch die oberflächenlokalisierten glykolytischen Enzyme in der Lage, an verschiedene humane Zellen zu binden. Eine Analyse der nachweisbaren Proteine auf der Oberfläche der Zellen führte zur Auswahl von sechs humanen Proteinen für weiterführende Studien: Plasminogen, Vitronektin, Fibronektin, Fibrinogen, Laminin und Laktoferrin. Mittels ELISA wurde eine konzentrationsabhängige Bindung der oberflächenassoziierten Enzyme von M. pneumoniae mit Wirtsproteinen festgestellt, die hinsichtlich der Intensität jedoch Unterschiede aufwies. So konnten ausgeprägte Interaktionen aller Enzyme mit humanem Plasminogen und Vitronektin nachgewiesen werden. Die Bindung von Fibronektin und Laktoferrin ist dagegen nur für einen Teil der glykolytischen Enzyme zu bestätigen. Die Untersuchung verschiedener Einflussfaktoren ergab, dass alle Bindungen zwischen glykolytischen Enzymen und humanen Proteinen spezifisch durch die entsprechenden Antiseren gehemmt werden und dass der Großteil der Interaktionen ionischen Wechselwirkungen unterliegt. Die Bindung zu Plasminogen basiert überwiegend auf Lysin-Resten. Untersuchungen, ob sich die glykolytischen Enzyme gegenseitig in der Bindung zu Wirtsfaktoren beeinflussen, ergab ein komplexes Muster, das hinsichtlich Plasminogen, Fibronektin und Laminin für eine Überlagerung der für die Interaktion maßgeblichen Proteinbereiche spricht.
Die Untersuchung einer möglichen Aktivierung von inaktivem Plasminogen zu proteolytisch aktivem Plasmin ergab, dass in Gegenwart aller oberflächenlokalisierten glykolytischen Enzyme von M. pneumoniae Plasmin gebildet wird. Es wurden jedoch Unterschiede im Aktivierungspotenzial nachgewiesen. Die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B zeigte die höchste, die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C die geringste Plasminproduktion. Die Verwendung des gewebespezifischen Plasminogenaktivators führte zu einer höheren Aktivierung als der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator. Die Variabilität der Plasminproduktion kann mit der unterschiedlichen Bindungsaffinität der glykolytischen Enzyme zu Plasminogen begründet werden. So besitzt die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B im Vergleich mit der Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C ein höheres Bindepotenzial, das sich in der gemessenen Aktivierung widerspiegelt. Die Bildung von Plasmin kann zum Abbau verschiedener extrazellulärer Matrix-Proteine führen. Diese Prozesse sind physiologisch, z. B. in der Fibrinolyse, von Bedeutung. Während in Gegenwart der glykolytischen Enzyme die humanen Proteine Laktoferrin, Laminin und Fibronektin nicht abgebaut wurde, konnte Fibrinogen in Gegenwart der Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B bzw. der Phosphoglyceratmutase und Vitronektin durch alle glykolytischen Enzyme (bis auf die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C) degradiert werden.
Mit der erstmals durchgeführten Analyse aller glykolytischen Enzyme eines Mikroorganismus hinsichtlich ihrer Lokalisation und der Bindung zu Komponenten der humanen extrazellulären Matrix wurde ein komplexes Netzwerk an Wirt-Erreger-Interaktionen nachgewiesen.
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The Participation Of Occupational Therapy Faculty In Clinical PracticeDecker, Bonnie Rae 01 January 2005 (has links)
The purpose of this research study was to examine the current use of clinical practice by full-time occupational therapy faculty members. Clinical practice, including faculty clinical practice and moonlighting were addressed. The seven research questions addressed were: (a) the perceived benefits of clinical practice as identified by occupational therapy faculty members; (b) the perceived barriers to clinical practice as identified by occupational therapy faculty; (c) if perceived benefits and barriers of clinical practice as identified by occupational therapy faculty differ as a function of their academic institution's Carnegie Classification (The Carnegie Foundation, 2000); (d) if perceived benefits and barriers of clinical practice differ among respondents according to tenure at the institution, tenure status, doctoral degree, rank, administrative duties, and gender; (e) the incidence of clinical practice in occupational therapy faculty members; (f) the relationship between participation in clinical practice and the Carnegie classification of the occupational therapy member's academic institution; (g) the characteristics (tenure status, doctoral degree, rank, administrative duties, and gender) of faculty members that participate in clinical practice either within or outside the faculty role; and (h) the characteristics of clinical practice as described by faculty members and how these differed if the clinical practice is conducted as part of the faculty role or outside the faculty role. Data were collected using an on-line survey that contained 43 questions designed to elicit information that addressed the research questions. The surveys were electronically mailed to the population of full-time occupational therapy faculty members obtained from a search of each academic program's website. A total of 224 responses were obtained. Descriptive statistics, ANOVAs, and Chi Square Test of Associations were used to analyze the data for the independent variables. The results showed that 60 respondents indicated that they participated in some type of faculty clinical practice as part of their faculty role. Most of this work was in a facility that was associated with the academic institution. Most of these respondents were not tenured, did not have a doctoral degree, and did not participate in administrative tasks. Most of these respondents worked in Doctoral-Extensive universities and held the Assistant Professor rank. Most worked two to four hours per week and did not receive release time or financial benefits. There were 99 respondents that indicated that they participated in moonlighting in a wide variety of settings. Most worked in their area of clinical expertise. Most of these respondents were not tenured and did not participate in administrative tasks. Only 37% had a doctoral degree. Over half had the rank of Assistant Professor. Almost 42% worked in Masters I academic institutions. Most worked less than 2 hours per week outside the faculty role and they received full financial benefits. The top three benefits for participating in clinical practice were to maintain clinical skills, enhance teaching, and improve credibility with students. The top three barriers for participating in clinical practice were teaching responsibilities, not a component in tenure decisions, and the additional responsibilities of practice. There were no statistically significant differences between the benefits or barriers to clinical practice and the Carnegie Classification of the respondent's academic institution. One ANOVA was significant between the barriers to clinical practice and if the respondent had a doctoral degree. There were no statistically significant differences between the benefits or barriers and tenure at the institution, the respondent's tenure status, the respondent's degree status, faculty rank, administrative duties, and gender except the respondents that had a doctoral degree had significantly higher barrier scores than those that did not have a doctoral degree. In general, less than five percent of the variance was explained by any of the independent variables. None of the Chi Square analyses revealed any significant differences between the academic institution's Carnegie Classification and if clinical practice was required, if a faculty participated in faculty clinical practice, or if a faculty member participated in moonlighting. In conclusion, although many faculty members recognize the benefits to participation in clinical practice, the barriers to clinical practice may be too great to outweigh the benefits for some faculty members. Most reported that clinical practice carried little weight in promotion or tenure decisions. In order for the scholarship of practice to flourish, active support from all academic institution administration is critical.
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Microcompartmentation of aldolase in ArabidopsisGaragounis, Constantine January 2014 (has links)
Understanding the internal organization of cells from the molecular up to organelle level is a current challenge for biology if we are to better comprehend the mechanisms by which cellular processes occur. A prevailing view of the cell interior is that biochemical reactions and molecular movements are dominated by random diffusion. However, in addition to being compartmented into organelles, cells may well be organized at a finer level. Proteins may localise to specific areas within sub-cellular compartments, by associating with each other, the cytoskeleton and organelle membranes. Thus giving rise to distinct microcompartments. Considerable in vitro evidence exists for such interactions between enzymes and larger cellular components. This strengthens the idea that cells may be microcompartmented. However, little in vivo evidence supports this hypothesis, especially in plants. As a test-case for the concept of microcompartmentation this project investigated the sub-cellular distribution of the glycolytic enzyme fructose-bisphosphate aldolase in Arabidopsis thaliana; the ultimate aim being to establish whether it is microcompartmented in vivo and, further, to test the potential function(s) of such microcompartmentation.
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Essays in the Economics of Corruption: Experimental and empirical evidenceLeszczynska, Nastassia 20 February 2018 (has links)
The advent of experimental methodologies have led to decisive progress in the study of corrupt behaviour in the last two decades. Since they can complement survey data and perception indexes with controlled experimental data, scholars and policy makers have reached a better understanding of decision-making in bribery situations and are able to design innovative anticorruption policies.In this thesis, I use experimental and empirical data to contribute to the field of the economics of corruption. The first two chapters of this PhD dissertation use experimental methodologies to study decision-making in a bribery scenario. The first chapter tests an anti-corruption strategy with a lab in the field experiment in Burundi. The second chapter studies the fairness concerns that might arise when dealing with redistribution in a bribery situation. The third chapter uses an empirical analysis to explore the controversial issue of political moonlighting, i.e. having outside activities while holding public office. It investigates "double-hat politicians", who combine mayor and parliamentary positions in Wallonia.In a first chapter, written with Jean-Benoit Falisse, we explore the effect of anti- corruption messages on corrupt behavior and public service delivery. In a novel lab-in-the-field experiment, 527 public servants from Burundi were asked to allocate rationed vouchers between anonymous citizens; some of these citizens attempted to bribe the public servants to obtain more vouchers than they were entitled to. Two groups of public servants were randomly exposed to short messages about good governance or professional identity reminders. Participants in these two groups behaved in a fairer manner than those of a third group who were not exposed to any message. The result is more robust in the case of the group exposed to the professional identity reminder. The underlying mechanisms seem to be that when a public servant reflects upon governance values and her professional identity, the moral cost increases, prompting more equal service delivery. Bribe-taking was not impacted by the messages. The experiment provides new insights into the design of anti-corruption strategies.The second chapter, written with Lena Epp, investigates the impact of a public officials’ fairness considerations towards citizens in a petty corruption situation. Other-regarding preferences, and, more particularly, fairness concerns are widely acknowledged as crucial elements of individual economic decision-making. In petty corruption contexts, public officials are to a large extent aware of differences between citizens. Here, we experimentally investigate how fairness considerations may impact on corrupt behaviour. Our novel bribery game reveals that bribes are less frequently accepted when bribers are unequal in terms of endowments. These results suggest that fairness considerations can influence corrupt behaviour.In the last chapter, I focus on political moonlighting in Wallonia. Activities outside of public office or combining specific public offices simultaneously is a topic of ongoing heated debates. An element crucial to these discussions is whether moonlighting is detrimental for politicians’ performance. In Belgium, the combination of local executive and regional legislative offices, i.e. double hat politicians, is a frequent habit for a majority of politicians. This accumulation of activities might lead to (un-)desirable outcomes in terms of political achievements. This chapter investigates the impact of holding several remunerated and honorary positions on regional MPs parliamentary activities and mayor’s municipality performance in Wallonia. I use a database of all public and private positions held by Belgian politicians in Wallonia since the disclosure of positions became compulsory for those holding at least one public position, i.e. from 2004 to 2016. For members of Parliament, wearing a double hat reduces global parliamentary activity. For mayors, it seems that holding more remunerated positions is associated with less efficient municipality management. / Doctorat en Sciences économiques et de gestion / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Structural and biochemical characterization of c-di-AMP synthesizing enzymesHeidemann, Jana Laura 26 May 2021 (has links)
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