Tese de mestrado integrado. Engenharia Civil (Especialização em Vias de Comunicação). Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

A análise do mtDNA vem sendo empregada, recentemente, em Ciência Forense, para identificação de indivíduos e resolução de casos criminais. Também vem sendo utilizada em estudos de genética de populações contribuindo com processos relacionados com o grau de miscigenação dos povos e com a ocupação dos diferentes continentes por populações humanas. O DNA mitocondrial está presente em inúmeras cópias por célula, é de origem materna e não sofre processos de recombinação, o que faz com que essa molécula seja uma poderosa ferramenta nesta área. A análise por mtDNA só é recomendada quando não existe mais fonte de DNA nuclear, ou quando este se encontra altamente degradado, como em amostras forenses. Um dos problemas encontrados é a interferência de artefatos durante as etapas pré e pós sequenciamento, na qual pode se obter uma seqüência de má qualidade. O presente estudo comparou e otimizou dez métodos de purificação de DNA mitocondrial, para amostras de restos mortais e in vivo, nas etapas pré e pós sequenciamento. A metodologia empregada consistiu em extrair o DNA da amostra biológica, amplificar por PCR, seqüenciar as referidas regiões do mtDNA das amostras selecionadas e analisar após eletroforese capilar. A enzima colagenase foi testada com o objetivo de avaliar sua eficiência na etapa de extração do DNA. Interligado a esta etapa, outro objetivo foi avaliar o grau de polimorfismo das regiões HVS-I e HVS-II do mtDNA em amostras da população do estado do Rio de Janeiro como forma de entender o fluxo gênico associado à formação da nossa população. Como conclusão, os melhores métodos de purificação utilizados foram o Centricon, seguido da purificação dos produtos amplificados pela resina da Amershan e dos produtos da reação de sequenciamento pela resina Sephadex. Houve baixa eficiência da enzima colagenase, indicando a presença de possíveis inibidores. Em relação ao banco de dados, foram encontrados 95 polimorfismos distintos na região HVS-I e 52 na região HVS-II. O polimorfismo mais freqüente na região HVS-I foi 16223 (74,5%), enquanto que na região HVS-II foi o 263 (60%). Foram encontrados 92 diferentes haplótipos na região HVS-I e 42 na região HVS-II. Podemos dizer que a população do Estado do Rio de Janeiro, via herança materna, é constituída, em maior parte, pelos africanos (50%), seguidos dos ameríndios (30%) com uma pequena participação dos europeus (21%), demonstrando a grande miscigenação do nosso estado. / Analysis of mtDNA has been employed, recently, in Forensic Science, for identification of peoples and solves criminal cases. So has been used in genetic populations studies and had contributed for understand of process related with degree of mixture people and with occupation of different continents by populations humans. Mitochondrial DNA is present in many copies by cell. It is maternal inheritance and not suffer recombination. So, this cell is powerful tool in this area. Analysis of mitochondrial DNA is recommend when not exist more nuclear DNA or it be degraded as in forensic samples. One of problems find are the artifact encountered during the phases before and after sequencing where can obtained the bad quality sequence. The present study compared and optimized methods of mitochondrial DNA purification to samples human remains and in vivo in phases before and after sequencing. The methodology of analysis by mitochondrial DNA consist in extract it of biological sample, amplify the regions HVS-I and HVS-II of control region, sequence the products amplified and analysis after electroforesis capilar. The colagenase was tested with objective of value its efficiency in phase DNA extraction. In relation that fase, other objective was value the degree polymorphisms in regions HVS-I and HVS-II of mtDNA in samples of population of Rio de Janeiro to contribute for understand of flow genetics associated to formation of our population. As conclusion, the best methods of purification used was Centricon, follow by purification of amplifications products by Amershan and purification od products sequencing by Sephadex. It had fall efficiency of colagenase indicate the presence of probable inhibitors. In relation of data base, was encountered 95 polymorfisms distincts in region HVS-I and 52 in region HVS-II. The polimorfism more often in region HVS-I was 16223 (74,5%), while in region HVS-II was 263 (60%). It was encountered 92 differents haplotypes in region HVS-I and 42 in region HVS-II. It had lower rates of heteroplasmy. We can said that the population of Rio de Janeiro state, by maternal inheritance, was determined, in more portion, by Africans (50%), follow by Amerindians (30%) with small portion of Europeans (21%), showing the bigger miscegenation of our state.

A análise do mtDNA vem sendo empregada, recentemente, em Ciência Forense, para identificação de indivíduos e resolução de casos criminais. Também vem sendo utilizada em estudos de genética de populações contribuindo com processos relacionados com o grau de miscigenação dos povos e com a ocupação dos diferentes continentes por populações humanas. O DNA mitocondrial está presente em inúmeras cópias por célula, é de origem materna e não sofre processos de recombinação, o que faz com que essa molécula seja uma poderosa ferramenta nesta área. A análise por mtDNA só é recomendada quando não existe mais fonte de DNA nuclear, ou quando este se encontra altamente degradado, como em amostras forenses. Um dos problemas encontrados é a interferência de artefatos durante as etapas pré e pós sequenciamento, na qual pode se obter uma seqüência de má qualidade. O presente estudo comparou e otimizou dez métodos de purificação de DNA mitocondrial, para amostras de restos mortais e in vivo, nas etapas pré e pós sequenciamento. A metodologia empregada consistiu em extrair o DNA da amostra biológica, amplificar por PCR, seqüenciar as referidas regiões do mtDNA das amostras selecionadas e analisar após eletroforese capilar. A enzima colagenase foi testada com o objetivo de avaliar sua eficiência na etapa de extração do DNA. Interligado a esta etapa, outro objetivo foi avaliar o grau de polimorfismo das regiões HVS-I e HVS-II do mtDNA em amostras da população do estado do Rio de Janeiro como forma de entender o fluxo gênico associado à formação da nossa população. Como conclusão, os melhores métodos de purificação utilizados foram o Centricon, seguido da purificação dos produtos amplificados pela resina da Amershan e dos produtos da reação de sequenciamento pela resina Sephadex. Houve baixa eficiência da enzima colagenase, indicando a presença de possíveis inibidores. Em relação ao banco de dados, foram encontrados 95 polimorfismos distintos na região HVS-I e 52 na região HVS-II. O polimorfismo mais freqüente na região HVS-I foi 16223 (74,5%), enquanto que na região HVS-II foi o 263 (60%). Foram encontrados 92 diferentes haplótipos na região HVS-I e 42 na região HVS-II. Podemos dizer que a população do Estado do Rio de Janeiro, via herança materna, é constituída, em maior parte, pelos africanos (50%), seguidos dos ameríndios (30%) com uma pequena participação dos europeus (21%), demonstrando a grande miscigenação do nosso estado. / Analysis of mtDNA has been employed, recently, in Forensic Science, for identification of peoples and solves criminal cases. So has been used in genetic populations studies and had contributed for understand of process related with degree of mixture people and with occupation of different continents by populations humans. Mitochondrial DNA is present in many copies by cell. It is maternal inheritance and not suffer recombination. So, this cell is powerful tool in this area. Analysis of mitochondrial DNA is recommend when not exist more nuclear DNA or it be degraded as in forensic samples. One of problems find are the artifact encountered during the phases before and after sequencing where can obtained the bad quality sequence. The present study compared and optimized methods of mitochondrial DNA purification to samples human remains and in vivo in phases before and after sequencing. The methodology of analysis by mitochondrial DNA consist in extract it of biological sample, amplify the regions HVS-I and HVS-II of control region, sequence the products amplified and analysis after electroforesis capilar. The colagenase was tested with objective of value its efficiency in phase DNA extraction. In relation that fase, other objective was value the degree polymorphisms in regions HVS-I and HVS-II of mtDNA in samples of population of Rio de Janeiro to contribute for understand of flow genetics associated to formation of our population. As conclusion, the best methods of purification used was Centricon, follow by purification of amplifications products by Amershan and purification od products sequencing by Sephadex. It had fall efficiency of colagenase indicate the presence of probable inhibitors. In relation of data base, was encountered 95 polymorfisms distincts in region HVS-I and 52 in region HVS-II. The polimorfism more often in region HVS-I was 16223 (74,5%), while in region HVS-II was 263 (60%). It was encountered 92 differents haplotypes in region HVS-I and 42 in region HVS-II. It had lower rates of heteroplasmy. We can said that the population of Rio de Janeiro state, by maternal inheritance, was determined, in more portion, by Africans (50%), follow by Amerindians (30%) with small portion of Europeans (21%), showing the bigger miscegenation of our state.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os INDELs são polimorfismos de comprimento, gerados a partir de inserções e/ou deleções de um ou mais nucleotídeos. Os marcadores INDELs, que estão amplamente distribuídos pelo genoma e se caracterizam pela alta estabilidade devido à baixa taxa mutacional (10-9), podem ser analisados a partir da amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A facilidade de análise e a possibilidade de construção de sistemas multiplex capazes de gerar amplicons curtos (menores que 100 pb) tornam os INDELs uma importante ferramenta para identificação humana por DNA. Para avaliar a eficiência e validar a metodologia que emprega os polimorfismos de inserção/deleção na identificação humana, utilizamos o sistema Indel-plex ID, capaz de amplificar simultaneamente 38 loci INDELs bialélicos de cromossomos autossomos. Diferentes amostras biológicas (cabelo, saliva, sangue, sêmen e urina) foram genotipadas apresentando reprodutibilidade entre todas as tipagens. A concentração mínima de DNA necessária para amplificação dos 38 loci INDELs foi de 0,5 ng. Artefatos do tipo split peaks foram observados em algumas amostras. Os produtos da PCR foram purificados em resina Sephadex proporcionando melhores condições de análise, redução de artefatos e aumento na intensidade média de fluorescência dos alelos amplificados. A eficiência do sistema Indel-plex ID na amplificação de DNA degradado foi verificada durante as análises das amostras de DNA extraídas de restos mortais (ossos e dentes). Comparativamente ao sistema Identifiler, o Indel-plex ID, se mostrou mais eficiente em termos de número de loci genotipados e qualidade de amplificação. Nas investigações de vínculos genéticos realizadas com o sistema Indel-plex ID foi possível corroborar resultados anteriores obtidos pela análise de marcadores STR. Nas análises com amostras in vivo foram obtidos valores máximos de Probabilidades de Paternidade de 99,99998%. Para casos envolvendo supostos pais falecidos, o sistema Indel-plex ID reforçou resultados obtidos com o sistema Identifiler e Minifiler. A Probabilidade de Paternidade de 99,953%, obtida com o sistema Indel-plex ID, conjugada com a Probabilidade de Paternidade de 99,957%, obtida como o sistema Minifiler, possibilitou um índice final de 99,99998%. Os resultados evidenciaram que os loci INDELs do sistema Indel-plex ID são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco / INDELs are length polymorphisms, generated from insertions and/or deletions of one or more nucleotides. The INDEL markers, which are widely distributed throughout the genome and characterized by high stability due to their low mutational rate (10-9), can be analyzed based on amplification by PCR (Polimerase Chain Reaction). This ease in being analyzed and the possibility of building multiplex systems capable of generating short amplicons (smaller than 100 pb), render INDELs an important tool for DNA-based human identification. So as to evaluate the efficiency and validate the methodology which makes use of insertion/deletion polymorphisms in human identification, we have employed the Indel-plex ID system, capable of simultaneously amplifying 38 INDEL loci of biallelic autosome chromosomes. Different biological samples (hair, saliva, blood, semen and urine) were genotyped showing reproducibility of all typing. The minimum DNA concentration for the amplification of the 38 INDEL loci is 0,5 ng. Artifacts of the split peaks type were observed in some samples. The purification of the PCRs products in Sephadex resin provided better conditions for analysis, reduction of artifacts and increased the average intensity of allele fluorescence. The efficiency of the Indel-plex ID system in the amplification of degraded DNA was verified in analysis of DNA samples extracted from mortal remains (bones and teeth). In comparison with the Identifiler system, the Indel-plex ID has proven more efficient in terms of the number of genotyped loci and amplification quality. During the investigation of genetic relations, carried out with the Indel-plex ID system, it was possible to corroborate previous results obtained through the analysis of STR markers. In investigations based on in vitro samples, maximum values of 99,99998% in Paternity Probabilities were obtained. In genetic investigations related to deceased supposed parents, the Indel-plex ID system corroborated results obtained with the Identifiler and Minifiler systems. The Paternity Probability of 99,953% obtained with the Indel-plex ID system, allied with the Paternity Probability of 99,957% obtained with the Minifiler rendered possible the final indicator of 99,99998%. The results have made evident that the INDEL loci of the Indel-plex ID system are highly informative and constitute an important tool for studies in both human identification and parenthood relations identification

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os INDELs são polimorfismos de comprimento, gerados a partir de inserções e/ou deleções de um ou mais nucleotídeos. Os marcadores INDELs, que estão amplamente distribuídos pelo genoma e se caracterizam pela alta estabilidade devido à baixa taxa mutacional (10-9), podem ser analisados a partir da amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A facilidade de análise e a possibilidade de construção de sistemas multiplex capazes de gerar amplicons curtos (menores que 100 pb) tornam os INDELs uma importante ferramenta para identificação humana por DNA. Para avaliar a eficiência e validar a metodologia que emprega os polimorfismos de inserção/deleção na identificação humana, utilizamos o sistema Indel-plex ID, capaz de amplificar simultaneamente 38 loci INDELs bialélicos de cromossomos autossomos. Diferentes amostras biológicas (cabelo, saliva, sangue, sêmen e urina) foram genotipadas apresentando reprodutibilidade entre todas as tipagens. A concentração mínima de DNA necessária para amplificação dos 38 loci INDELs foi de 0,5 ng. Artefatos do tipo split peaks foram observados em algumas amostras. Os produtos da PCR foram purificados em resina Sephadex proporcionando melhores condições de análise, redução de artefatos e aumento na intensidade média de fluorescência dos alelos amplificados. A eficiência do sistema Indel-plex ID na amplificação de DNA degradado foi verificada durante as análises das amostras de DNA extraídas de restos mortais (ossos e dentes). Comparativamente ao sistema Identifiler, o Indel-plex ID, se mostrou mais eficiente em termos de número de loci genotipados e qualidade de amplificação. Nas investigações de vínculos genéticos realizadas com o sistema Indel-plex ID foi possível corroborar resultados anteriores obtidos pela análise de marcadores STR. Nas análises com amostras in vivo foram obtidos valores máximos de Probabilidades de Paternidade de 99,99998%. Para casos envolvendo supostos pais falecidos, o sistema Indel-plex ID reforçou resultados obtidos com o sistema Identifiler e Minifiler. A Probabilidade de Paternidade de 99,953%, obtida com o sistema Indel-plex ID, conjugada com a Probabilidade de Paternidade de 99,957%, obtida como o sistema Minifiler, possibilitou um índice final de 99,99998%. Os resultados evidenciaram que os loci INDELs do sistema Indel-plex ID são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco / INDELs are length polymorphisms, generated from insertions and/or deletions of one or more nucleotides. The INDEL markers, which are widely distributed throughout the genome and characterized by high stability due to their low mutational rate (10-9), can be analyzed based on amplification by PCR (Polimerase Chain Reaction). This ease in being analyzed and the possibility of building multiplex systems capable of generating short amplicons (smaller than 100 pb), render INDELs an important tool for DNA-based human identification. So as to evaluate the efficiency and validate the methodology which makes use of insertion/deletion polymorphisms in human identification, we have employed the Indel-plex ID system, capable of simultaneously amplifying 38 INDEL loci of biallelic autosome chromosomes. Different biological samples (hair, saliva, blood, semen and urine) were genotyped showing reproducibility of all typing. The minimum DNA concentration for the amplification of the 38 INDEL loci is 0,5 ng. Artifacts of the split peaks type were observed in some samples. The purification of the PCRs products in Sephadex resin provided better conditions for analysis, reduction of artifacts and increased the average intensity of allele fluorescence. The efficiency of the Indel-plex ID system in the amplification of degraded DNA was verified in analysis of DNA samples extracted from mortal remains (bones and teeth). In comparison with the Identifiler system, the Indel-plex ID has proven more efficient in terms of the number of genotyped loci and amplification quality. During the investigation of genetic relations, carried out with the Indel-plex ID system, it was possible to corroborate previous results obtained through the analysis of STR markers. In investigations based on in vitro samples, maximum values of 99,99998% in Paternity Probabilities were obtained. In genetic investigations related to deceased supposed parents, the Indel-plex ID system corroborated results obtained with the Identifiler and Minifiler systems. The Paternity Probability of 99,953% obtained with the Indel-plex ID system, allied with the Paternity Probability of 99,957% obtained with the Minifiler rendered possible the final indicator of 99,99998%. The results have made evident that the INDEL loci of the Indel-plex ID system are highly informative and constitute an important tool for studies in both human identification and parenthood relations identification

Made available in DSpace on 2016-04-27T17:27:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amir Abdala.pdf: 1390110 bytes, checksum: 60646d1505a6d3918197c2cda25dffe4 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / The thesis deals with the death theme in Martin Heidegger s philosophical thought, examining it in the different phases that constitute Heidegger s philosophical itinerary. At Being and time (Sein und Zeit), study published in 1927 and with which this philosofer inscribes his name among the classics of the contemporary thought, the notion of being toward death (Sein zum Tode) is delineated in the center of its existential analysis, projeced from the concern in investigating the meaning of the being. In Heidegger s writings prior to the mid thirty decade, belonging to the titled turning (Kehre), the existential analysis is replaced by the speculations about the history of the being in its veiling e unveiling. In the turning texts, the human being is thought in its correspondence to the destinations of the being, and the death is considered under a new philosophical point of view, revealing itself, under this prism, the mortals who are the men (die Sterblichen sind die Menschen). In concise terms, therefore, it can be claimed that the research renders problematic the relations between being toward death and the mortals who are the men, properly contextualized in the guidelines of Heidegger s thought. In this perspective, it is achieved through an investigative and expository plan whose starting point, expressed in its first chapter, is the reflection about the Dasein as being toward death, trying to understand it in the range of the fundamental ontology. The second chapter intends to identify the tendencies of Heidegger s philosophy under the influx of the turning, featuring its interpretation metaphysics history as forgetfulness of the being and its explicit pretension of transcending the metaphysics, with the restitution of the human essence in its belonging to the being. The third chapter starts from Heidegger s declaration that the essence of the modern technic expresses the conclusion of the metaphysics as a complete hiding of the being, to identify the condition of the human being in the interior of this process and confront it with the notion of being toward death. Chapter four talks about Heidegger s conception of the human essence in its correspondence to the reciprocity originated between being and nothing, the abyss to which belong the mortals who are the men. Lastly, prior to the work s conclusion, the fifth chapter makes the direct comparison between being toward death and the mortals who are the men, with the intention of demarcating their distinctions and articulations / A tese versa sobre a temática da morte no pensamento filosófico de Martin Heidegger, examinando-a nas diferentes fases que constituem o itinerário da filosofia heideggeriana. Em Ser e tempo (Sein und Zeit), estudo publicado em 1927 e com o qual esse filósofo inscreve seu nome entre os clássicos do pensamento contemporâneo, delineia-se a noção de ser para a morte (Sein zum Tode) no centro de sua analítica existencial, projetada a partir da preocupação em investigar o sentido do ser. Nos escritos de Heidegger posteriores a meados da década de trinta, pertencentes à denominada viragem (Kehre), a analítica existencial é substituída pelas especulações acerca da história do ser em seu velamento e desvelamento. Nos textos da viragem, o ser humano é pensado em sua correspondência às destinações do ser, e a morte é considerada sob um novo ponto de vista filosófico, revelando-se, sob esse prisma, os mortais que são os homens (die Sterblichen sind die Menschen). Em termos concisos, portanto, pode-se afirmar que a pesquisa problematiza as relações entre o ser para a morte e os mortais que são os homens, devidamente contextualizados nas diretrizes do pensamento de Heidegger. Nessa perspectiva, realiza-se mediante um plano investigativo e expositivo cujo ponto de partida, expresso em seu primeiro capítulo, é a reflexão sobre o ser-aí (Dasein) como ser para a morte, procurando compreendê-lo no âmbito da ontologia fundamental. O segundo capítulo pretende identificar as tendências da filosofia heideggeriana sob o influxo da viragem, destacando-se sua interpretação da história da metafísica como esquecimento do ser e sua explícita pretensão de ultrapassagem da metafísica, com a restituição da essência humana em seu pertencimento ao ser. O terceiro capítulo parte da declaração heideggeriana de que a essência da técnica moderna exprime a conclusão da metafísica como completo ocultamento do ser, para identificar a condição do ente humano no interior desse processo e confrontá-la com a noção de ser para a morte. O capítulo quatro discorre sobre a concepção heideggeriana de essência humana em sua correspondência à reciprocidade originária entre ser e nada, a abissalidade à qual pertencem os mortais que são os homens. Por fim, antecedendo a conclusão do trabalho, o quinto capítulo efetua a comparação direta entre ser para a morte e os mortais que são os homens, com a intenção de demarcar suas distinções e articulações