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Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3. / G protein-coupled receptors form multimeric complexes comprising G protein and effectors. We want to characterize such complexes comprising delta opioid receptors (DOR) and Kir3 channels, which interest us due to their involvement in opioid analgesia. Immunopurification, BRET and GTPgS binding experiments were done in transfected HEK293 cells. Kir3 channels were co-immunopurified with DOR, implying a spontaneous interaction between the receptor and effector. BRET assays corroborated the presence of this interaction in living cells and allowed us to identify a spontaneous and specific interaction between DOR/Gg and Gg/Kir3, indicating their co-existence within the same complex. Since the activation of the receptor implies it undergoes conformational changes, we were interested in evaluating if the conformational information flows from the ligand-bound receptor until the downstream effector. Hence, we determined the effect of different ligands on the BRET signal that was generated by the following pairs: DOR/Gbg, DOR/Kir3 and Kir3/Gbg. We noticed a modulation of the DOR/Gbg and Gbg/Kir3 interactions that followed the order of efficacy of the ligands to activate the G protein, which we did not observe between DOR and Kir3. Therefore, we concluded that the conformational information flows from the receptor to the Kir3 channel via the Gbg protein. These results allowed us to develop a BRET biosensor (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc), which could be used in high throughput screening to detect new molecules that activate Kir3 channels with high efficacy.

Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3. / G protein-coupled receptors form multimeric complexes comprising G protein and effectors. We want to characterize such complexes comprising delta opioid receptors (DOR) and Kir3 channels, which interest us due to their involvement in opioid analgesia. Immunopurification, BRET and GTPgS binding experiments were done in transfected HEK293 cells. Kir3 channels were co-immunopurified with DOR, implying a spontaneous interaction between the receptor and effector. BRET assays corroborated the presence of this interaction in living cells and allowed us to identify a spontaneous and specific interaction between DOR/Gg and Gg/Kir3, indicating their co-existence within the same complex. Since the activation of the receptor implies it undergoes conformational changes, we were interested in evaluating if the conformational information flows from the ligand-bound receptor until the downstream effector. Hence, we determined the effect of different ligands on the BRET signal that was generated by the following pairs: DOR/Gbg, DOR/Kir3 and Kir3/Gbg. We noticed a modulation of the DOR/Gbg and Gbg/Kir3 interactions that followed the order of efficacy of the ligands to activate the G protein, which we did not observe between DOR and Kir3. Therefore, we concluded that the conformational information flows from the receptor to the Kir3 channel via the Gbg protein. These results allowed us to develop a BRET biosensor (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc), which could be used in high throughput screening to detect new molecules that activate Kir3 channels with high efficacy.

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces dans le traitement des douleurs sévères. Ils produisent leurs effets en ciblant spécifiquement les récepteurs opioïdes localisés tout le long de la voie de perception de la douleur où ils modulent la transmission de l'information douloureuse. La plupart des études dans ce domaine essaient de caractériser les récepteurs opioïdes à l'état isolé de tout partenaire de signalisation. Cette thèse, par contre, montre que le récepteur opioïde delta (DOR) peut former un complexe avec sa protéine G et l'un de ses effecteurs impliqués dans la production de l'effet analgésique, le canal potassique à rectification entrante activée par les protéines G (Kir3 ou GIRK). Après avoir établi la présence de ce complexe constitutif, on a ensuite caractérisé sa stabilité, modulation et régulation suite à une stimulation avec des agonistes opioïdes. En premier lieu, on a caractérisé la transmission de l'information du récepteur DOR, suite à son activation par un agoniste, vers le canal Kir3. On a remarqué que cette transmission ne suit pas le modèle de collision, généralement accepté, mais nécessite plutôt un simple changement dans la conformation du complexe préformé. Ensuite, on a déterminé que même suite à l'activation prolongée du récepteur DOR par un agoniste complet, le complexe DOR/Kir3 maintenait son intégrité et a été reconnu par la βarrestine (βarr) comme une seule unité signalétique provoquant ainsi l'internalisation de DOR et Kir3 par un mécanisme clathrine et dynamine-dépendant. Ainsi, prises ensemble, ces données montrent que l'activation du récepteur DOR déclenche non seulement l'activation de l'effecteur Kir3 mais également un mécanisme de régulation qui élimine cet effecteur de la membrane plasmique. / Opioids are the most effective analgesics in the treatment of severe pain. They produce their effects by specifically targeting opioid receptors located all along the pain perception pathway where they modulate the transmission of pain information. Most studies in this area try to characterize the opioid receptor in isolation from any signaling partner. This thesis, on the other hand, shows that the delta opioid receptor (DOR) can form a complex with its G protein and one of its effectors involved in the production of the analgesic effect, the G protein coupled inward rectifying potassium channel (Kir3 or GIRK). Having established the presence of this constitutive complex, we then characterized its stability, modulation and regulation following stimulation with opioid agonists. First, we characterized the transmission of information from DOR, following its activation by an agonist, to the Kir3 channel. We have noticed that this transmission does not follow the collision model, generally accepted, but rather requires a simple change in the conformation within the preformed complex. Then, we have determined that even following prolonged DOR activation by a full agonist, the DOR/Kir3 complex maintained its integrity and was recognized by βarrestin (βarr) as a single signaling unit producing the internalization of DOR and Kir3 by a clathrin and dynamin-dependent mechanism. Thus, taken together, these data show that DOR activation triggers not only activation of the Kir3 effector but also a regulatory mechanism that removes this effector from the plasma membrane.

Aptamerer är nukleinsyra-baserade molekyler som binder specifikt till en målstruktur. Aptamerer har flera fördelar över antikroppar, så som snabb och billig framtagning och produktion. Multimera aptamer-baserade strukturer har visats ge bättre resultat än monomera aptamerer, men framtagningen av sådana strukturer är tidskrävande och icke-skalbar. Denna studie utforskar generering och selektion av multimera aptamer-baserade strukturer genom slumpmässig ligering och in vitro-evolution, med virusliknande partiklar av norovirus GII.2 och GII.4 som målstruktur. Optimering av ligeringsförhållanden visade att en större andel aptamerer, flerarmade fragment, och linjära fragment resulterade i störst diversitet i den ursprungliga strukturblandingen. Selektionsexperiment uppvisade kraftig positiv selektion för strukturer innehållande aptameren Buf-2, vilket indikerar att den har hög affinitet för båda genotyper. Aptameren SMV21 uppvisade också positiv selektion för båda genotyper. Studien finner också positiv selektion av multimera aptamer-baserade strukturer, vilket bekräftar att de binder starkare till sin målstruktur. Potentiella sekvenser med hög affinitet togs fram genom att generera konsensus-sekvenser från sekvenseringsdatan av de selekterade strukturerna. SPR användes för att mäta affiniteten av de selekterade strukturerna till norovirus, men på grund av ospecifik binding kunde inga slutsatser dras. / Aptamers are nucleic acid-based targeted binders that hold advantages over antibodies, such as cheap and fast development and production. Multimeric aptamer-based structures have shown improved performance compared to monomeric aptamers, but the development of such structures is time-consuming and unscalable. This study explores the generation and selection of multimeric aptamer-based structures through random ligation and in vitro evolution, targeting norovirus GII.2 and GII.4. Optimization of ligation conditions was performed, revealing that a bigger proportion of aptamers, multi-armed fragments, and linear fragments ensures a diverse initial structure pool. Selection experiments demonstrated a strong positive selection for structures containing the Buf-2 aptamer, indicating its high affinity for both norovirus genotypes. The SMV21 aptamer also showed positive selection for both genotypes. The study further found that multimeric aptamer-based structures experience positive selection, confirming their stronger binding to the desired target. Potential strong-binding sequences were obtained by generating consensus sequences from sequencing data of the selected strong binders. SPR was employed to determine the affinity of the selected binders to the norovirus, but the results were inconclusive due to unspecific binding.