Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La dystrophie musculaire est une maladie génétique monogénique récessive liée au chromosome X. Elle atteint 1 garçon sur 3500 naissances mâles. Le garçon atteint de la maladie présente des troubles de la locomotion à l’âge de 3-4 ans et la perd vers l’âge de 11 ans. La mort survient entre 18-30 ans suite à des complications cardio-pulmonaires. Il n’existe pas à ce jour un traitement curatif efficace contre cette grave maladie. Nous avons développé une approche de thérapie génique appelée CRISPR-induced deletion (CinDel) pour corriger le gène DMD muté. Elle utilise deux ARNg qui ciblent les exons précédant et suivant la délétion responsable du décalage du cadre de lecture. La reconnaissance des sites ciblés par les deux ARNg permet le recrutement de la nucléase Cas9 qui génère des coupures double-brin. Les séquences exoniques et introniques situées entre les deux coupures sont ensuite délétées. Les restes des exons sont joints par la recombinaison non homologue (NHEJ) pour produire un exon hybride, rétablir le cadre de lecture et permettre la synthèse d’un edystrophine tronquée ayant une structure correcte des répétitions de type spectrine (Spectrin-Like Repeat: SLR) et des heptades. Cette approche CinDel a été utilisée dans le cadre de ce projet d’abord pour corriger le gène DMD muté dans les myoblastes d’un patient avec une délétion des exons 51-53. Les exons 50 et 54 ont été ciblés avec deux ARNg et la Spcas9 pour produire des coupures double-brin et déléter les séquences situées entre ces deux sites et produire par NHEJ un exon hybride 50-54. L’approche a également permis de corriger in vivo le gène DMD muté dans le modèle animal, la souris transgénique avec un gène DMD humain ayant une délétion de l’exon 52 (del52hDMD) en utilisant un vecteur viralAAV9 contenant le gène SpCas9 et deux ARNgs. Pour vérifier la localisation par rapport au sarcolemme de la dystrophine tronquée avec ou sans une structure correcte des SLR et des heptades, nous avons électroporé les muscles Tibialis anteriorde souris mdx/mdx avec des plasmides codant pour les gènes normal et tronqué de la dystrophine fusionnée avec le gène de l’EGFP. Les résultats de cette expérience montrent que les dystrophines tronquées et normale se localisent correctement sous le sarcolemme. En vue de réprimer efficacement le gène de la SpCas9 et éviter son expression prolongée qui peut être à la base de coupures aléatoires et inattendues (off-target effects) dans le génome, nous avons mis au point une méthode de répression appelée Hara-Kiri moléculaire. Elle utilise la méthode CinDel et consiste à cibler deux régions du gène de SpCas9 avec deux ARNg. Le recrutement de la nucléase permet à celle-ci de couper son propre gène (Hara-Kiri). La séquence située entre les deux sites de coupures est délétée. Par NHEJ, les restes du gène de SpCas9 sont joints en générant un codon stop TAA au point de jonction. Cette approche a permis de réprimer efficacement le gène de SpCas9 in vitro et in vivo / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked genetically recessive genetic disorder. It affects 1 boy out of 3500 male births. The boy with the disorder presents walking disorders at the age of 3-4 years and loses it around the age of 11. Death occurs around 18-30 years of age from cardiopulmonary complications. To date, there is no effective cure for this serious disease. We have developed a gene therapy approach called CRISPR-induced deletion (CinDel) to correct the mutated DMD gene. It uses two gRNAs that target the exons preceding and following the deletion responsible for the frame shift. The recognition of the target sites by the two gRNAs allows the recruitment of the Cas9 nuclease, which generates double-strand breaks. The exonic and intronic sequences located between the two cuts are then deleted and the remains of the exons are fused by Non-Homologous End Joining (NHEJ) to produce a hybrid exon and restore the reading frame and to allow the synthesis of the truncated dystrophin with correct SLR structure and heptads. The CinDel approach was used in this project to correct the mutated DMD gene in the myoblasts of a patient with a 51-53 deletion. Exons 50 and 54 were targeted by SpCas9 and two gRNAs and to produce double strand breaks, delete the sequences between the two cleavage sites and produce a hybrid exon 50-54 by NHEJ. This restored the normal reading frame and allowed the expression of truncated dystrophin in the patient's myotubes. The approach also made it possible to correct in vivo the mutated DMD gene in the animal model, the transgenic mouse with a human DMD gene having a deletion of exon 52 (del52hDMD) using an AAV9 viral vector containing the SpCas9 gene and two ARNgs. To verify the location with respect to the sarcolemma of truncated dystrophin with or without a correct SLR structure and heptads, we electroporated the Tibialis anterior muscles of mdx/mdx mice with the plasmids encoding the normal or the truncated dystrophin gene fused with the eGFP gene. The results of this experiment show that truncated and normal dystrophins were well localized under sarcolemma. In order to effectively repress the SpCas9 gene and avoid its prolonged expression that may be the basis of random and unexpected (off-target effects) cuts in the genome, we have developed a method of repression called molecular Hara-Kiri. It uses the CinDel method and consists of targeting two regions of the SpCas9 gene with two gRNAs. Recruiting nuclease allows it to cut its own gene (Hara-Kiri). The sequence between the two cleavage sites is deleted. The residues of the SpCas9 gene are then joined by NHEJ generating a TAA stop codon at the junction point. This approach effectively repressed the SpCas9 gene in vitro and in vivo.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Résumé : Introduction : La sarcopénie est la perte de masse musculaire avec le vieillissement et conduit à un plus grand risque de chutes, d'incapacité physique et même à un plus grand risque de mortalité. La dynapénie, aussi notée avec le vieillissement, consiste en la perte de force musculaire et contribue à plusieurs problèmes associés à la perte d’autonomie. L’entrainement en résistance est considéré comme la stratégie la plus efficace pour lutter contre la sarcopénie et à la dynapénie, mais les résultats dépendent d’un apport suffisant en acides aminés essentiels, qui proviennent principalement de sources animales. Par contre, certaines évidences scientifiques montrent que la consommation de protéines animales pourrait être néfaste pour la santé métabolique des personnes âgées, bien que d’autres études présentent certaines nuances importantes en fonction de la source de protéines animales étudiée. À cet effet, les produits laitiers pourraient constituer une alternative intéressante, allant même jusqu’à la prévention de certains désordres métaboliques. Ainsi, l’objectif de cette thèse est de mieux comprendre la relation entre le métabolisme de la masse musculaire, l’apport en protéines et certains paramètres de la santé métabolique. En deuxième lieu, cette thèse cherche à vérifier l’impact d’un programme d’entrainement en résistance ayant pour but d’améliorer la masse et la fonction musculaire, accompagné d’une supplémentation en protéines provenant de produits laitiers sur la fonction physique et le métabolisme des lipides. Plus spécifiquement, la thèse 1- vérifie la relation entre la masse musculaire, l’apport de différentes sources de protéines animales et le métabolisme du glucose, 2- étudie l’impact d’un plus grand apport en protéines sur la masse grasse et le profil métabolique chez des gens individus présentant différents phénotype de masse musculaire, 3- évalue l’effet de l’entrainement en résistance et de la supplémentation en produits laitiers sur la force et la masse musculaire et 4- évalue l’effet de l’entrainement en résistance et de la supplémentation en produits laitiers sur le métabolisme de repos, le quotient respiratoire et les niveaux d’inflammation chez l’homme âgé sarcopénique. Résultats : Par le biais d’un devis transversal, nos résultats démontrent que les protéines de sources animales ne sont pas associées aux désordres métaboliques sauf en ce qui concerne les viandes transformées et qu’elles pourraient même avoir un rôle protecteur sur le profil métabolique des femmes ménopausées en surplus de poids ayant un risque métabolique élevé à cause de leur grande masse musculaire. Par le biais d’une étude d’intervention, nos résultats indiquent que l'indice de masse musculaire appendiculaire et la force augmentent significativement après 16 semaines d’entrainement, autant pour les participants recevant une supplémentation en acides aminés du commerce, que ceux recevant une supplémentation à base de lait ou une supplémentation contrôle. De plus, aucun changement n’a été démontré pour la capacité physique et le profil inflammatoire. Néanmoins, la masse grasse a significativement diminué seulement pour le groupe recevant une supplémentation à base de lait. Conclusion : Les protéines de sources animales semblent importantes pour la prévention de certains désordres métaboliques observés avec le vieillissement, particulièrement chez des personnes à risque à cause d’une grande masse musculaire. De plus, même si l'exercice en résistance semble augmenter la masse musculaire, indépendamment d’une supplémentation en protéines, la supplémentation en produits laitiers est la seule qui a permis de réduire significativement la masse grasse suite au programme. Malgré les gains semblables de force et de masse musculaire, les produits laitiers ont donc eu un impact positif sur la masse grasse, suggérant ainsi qu’ils sont sans équivoque une source de protéines à privilégier pour prévenir la prise de masse grasse et la perte de force musculaire chez des hommes âgées sarcopéniques. / Abstract : Introduction: Sarcopenia is defined as the loss of muscle mass with aging and leads to a greater risk of falls, physical disability and even increased risk of mortality. Dynapenia, the loss of muscle strength is also observed with aging and contributes to several problems associated with the loss of independence. Resistance training is considered as the most effective strategy to fight against sarcopenia and dynapenia, but the results depend on an adequate intake of essential amino acids, which come mainly from animal sources. However, some scientific evidence shows that consumption of animal protein could be detrimental to metabolic health of older people, although some other studies have some important nuances depending on the source of animal protein studied. To this end, dairy products could be an interesting alternative even for the prevention of certain metabolic disorders. Thus, the objective of this thesis is to better understand the relationship between muscle mass metabolism, protein intake and parameters of metabolic health. Secondly, this thesis seeks to assess the impact of a resistance training program designed to improve muscle mass and function, accompanied with protein supplementation from dairy products on lipid metabolism. More specifically, this thesis will 1- verify the relationship between muscle mass and the contribution of different sources of animal protein on glucose metabolism, 2 study the impact of a larger protein intake combined with different muscle mass phenotypes on fat mass and metabolic profile, 3- evaluate the effect of resistance training and dairy supplementation on strength and muscle mass and 4 evaluate the effect of resistance training and dairy supplementation on resting metabolism, respiratory quotient and inflammatory profile in sarcopenic older men. Results: Through a cross-sectional design, our results show that IV proteins from animal sources are not associated with metabolic disorders except processed meats and might even have a protective effect on metabolic profile of overweight postmenopausal women with a high risk of metabolic disorders due to their greater muscle mass. Through an intervention study our results indicate that appendicular muscle mass index and strength increased significantly after 16 weeks of training, either for participants receiving amino acid supplementation and those receiving milk supplementation or in the control group. In addition, no change was demonstrated for physical capacity or inflammatory profile. However, fat mass was significantly reduced only in the group receiving supplementation with milk. Conclusion: Proteins from animal sources are important for the prevention of certain metabolic disorders observed with aging, particularly among those at risk due to greater muscle mass. Moreover, even if resistance exercise appears to increase muscle mass, independently of protein supplementation, dairy products is the only supplement that significantly reduced fat mass following the program. Despite similar gains in strength and muscle mass, dairy products therefore have a positive impact of fat mass, indicating that they are unequivocally a preferred source of protein to prevent fat mass gain and loss of muscle strength observed in sarcopenic elderly men.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la maladie neuromusculaire la plus fréquente de l'enfant. Son évolution progressive inexorable conduit habituellement au décès dans la troisième décade. La DMD constitue cependant une affection hétérogène pour la sévérité de l'atteinte musculaire, cognitive et cardiaque, et cette hétérogénéité n'est pas totalement expliquée par la localisation des mutations dans le gène de la dystrophine. Ma thèse comporte trois volets: (1) une analyse clinique multivariée d'une cohorte de DMD suivie à long terme qui nous a permis de définir 4 phénotypes distincts de DMD; (2) une étude de corrélation clinico-pathologique qui a identifié la fibrose endomysiale précoce comme seul facteur histologique prédictif de sévérité motrice; (3) la mise au point d'un modèle murin original de myofibrose dystrophique chez la souris mdx déficiente en dystrophine. 1- Étude multiparamétrique clinique. La saisie par la même équipe des données fonctionnelles musculaires, cardiaques, respiratoires et cognitives de 75 patients atteints de DMD (tous génotypés et présentant une absence complète de dystrophine musculaire), suivis pendant >10 ans, a permis d'établir un modèle multiparamétrique satisfaisant à deux dimensions principales, cognitive et motrice, et de définir 4 clusters phénotypiques : (i) DMD cognitive et motrice congénitale (20%), (ii) DMD classique (28%), (iii) DMD motrice pure modérée (22%), (iv) DMD motrice pure sévère (30%). La corrélation génotypephénotype était restreinte à la seule atteinte cognitive. Des indicateurs pronostics précoce ont été identifiés et validés sur une 2ème série de 34 patients. 2- Étude histopathologique. Les variations de sévérité de l'atteinte musculaire n'étant pas expliquées par la génétique moléculaire, nous avons cherché à corréler les paramètres moteurs et la biopsie musculaire prélevée dans le quadriceps à un stade précoce (3-7 ans) chez 25 patients (analyse stéréologique des images numérisées pour les paramètres élémentaires: nécrose/régénération, fibres hypercontractées, adipocytes, fibrose endomysiale et périmysiale). Seule la fibrose endomysiale était associée à un pronostic moteur défavorable (p<0.002) attesté par l'âge de perte de marche, la force du quadriceps et le testing musculaire global à 10 ans. Cette fibrose endomysiale dissociait les capillaires des myofibres (écartement x 2.5), et s'accompagnait d'une augmentation sélective des macrophages CD206+ activés dans la voie alterne (M2) et d'une diminution relative des cellules satellites musculaires (p<0.0001). Ces données suggèrent un rôle clé de la fibrose endomysiale (et des macrophages M2 profibrosant) et dans la sévérité clinique de la DMD. 3- Étude expérimentale. Ces éléments rendent nécessaire la mise au point d'un modèle expérimental de myofibrose dystrophique, la souris mdx présentant peu de fibrose et un déficit moteur modéré et tardif. Nous avons mis au point une nouvelle méthode de lésion musculaire focale profibrosante du tibialis antérieur chez la souris mdx (piqûres multiples quotidiennes pendant 15 jours). Une fibrose endomysiale attestée par un fort immunomarquage du collagène I (à 8, 30, 60 et 90 jours) a été quantifiée et corrélée à la perte de la force musculaire dans la patte lésée (comparée au muscle contralatéral). Ces résultats légitiment et préparent les futures stratégies thérapeutiques "anti-fibrosantes" dans la DMD

Les objectifs de cette étude étaient de comparer la relation entre les différentes méthodes et expressions de la force musculaire et les facteurs de risques métaboliques puis de comparer les changements de la force musculaire en utilisant différentes méthodes et expressions avant et après un entraînement en musculation. Quarante-et-une femmes obèses sédentaires post-ménopausées ont été recrutées pour cette étude (âge : 59.3 ± 4.6 ans; indice de masse corporelle : 34.2 ± 3.4 kg/m2; pourcentage de masse grasse : 47.3 ± 3.8 %). La force musculaire a été évaluée à l'aide de deux appareils d'entraînement incluant un développé des jambes pour le bas du corps (leg press) et un appareil développé assis (chest press) pour le haut du corps ainsi qu'avec un dynamomètre manuel. Nous avons mesuré la composition corporelle (DEXA), profil sanguin, la glycémie, la sensibilité à l'insuline, la dépense énergétique, la consommation maximale d'oxygène, la pression artérielle et le profil psychosocial. Les résultats montrent que les corrélations, les prédicteurs ainsi que les changements de la force musculaire selon la méthode varient de manière importante avec les facteurs de risque métaboliques. Par exemple, pour le VO2peak, nous observons des corrélations différentes avec les indices de force musculaire entre le VO2peak (L/min) (une négative et une positive), le VO2peak (ml/kg/min) et le VO2peak (ml/kg MM/min). De plus, lorsque la force musculaire est évaluée avec les appareils de musculation, nous remarquons que la masse osseuse est un prédicteur de la force musculaire quand elle est exprimée en kg et également lorsqu'elle est exprimée en kg/kg de masse maigre. Nous remarquons de plus que la force musculaire exprimée en joules est prédite par l'indice HOMA. D'autre part, nous n'avons trouvé aucun prédicteur de force musculaire quand la force musculaire est exprimée en kg/kg de poids corporel, en Joules/kg de poids corporel ainsi qu'en Joule/kg de masse maigre. Finalement, pour la force musculaire évaluée avec les appareils de musculation, les changements observés de force musculaire varient significativement entre 14.7 et 23.3 %. En conclusion, la présente étude nous indique que les corrélations, les prédicteurs ainsi que les changements de la force musculaire selon la méthode d'évaluation et d'expression varient de manière importante avec les facteurs de risque métaboliques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : force musculaire, profil métabolique, entraînement en musculation, composition corporelle, profil sanguin, glycémie, sensibilité à l'insuline, dépense énergétique, consommation maximale d'oxygène, pression artérielle

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est une maladie chronique se situant au 4e rang mondial en terme de mortalité et qui affecte près d’un demi-million de personnes au Québec. Les patients avec une MPOC présentent une détérioration progressive de leur fonction respiratoire, associée notamment à des épisodes de toux et de dyspnée de plus en plus invalidante. La diminution de la tolérance à l’effort, du statut fonctionnel et de la qualité de vie sont des conséquences habituelles de la maladie. Parmi les nombreuses répercussions systémiques caractéristiques de la MPOC, la diminution de la force des muscles locomoteurs est un meilleur prédicteur de mortalité que la fonction respiratoire seule. Son évaluation fait à ce titre partie des recommandations internationales de prise en charge des patients avec une MPOC. Malgré ces recommandations, l’évaluation de la fonction musculaire n’est pas systématique dans les milieux cliniques. Les objectifs de ce mémoire sont donc de faire un état des connaissances recueillies pendant mon cheminement post-gradué et de présenter les résultats d’un projet de recherche visant à 1) évaluer les propriétés métrologiques (fidélité test-retest et validité de construit) et la faisabilité d’un protocole standardisé d’évaluation de la force maximale volontaire isométrique du quadriceps avec un dynamomètre manuel commercial fixé (CMVi-DM) chez des patients avec une MPOC, et 2) déterminer les associations entre la CMVi-DM du quadriceps et la capacité fonctionnelle de ces patients (évaluée avec le test composite Short Physical Performance Battery [SPPB]). Le protocole standardisé de CMVi-DM a démontré une excellente fidélité test-retest et une bonne validité de construit avec les mesures obtenues avec un dynamomètre informatisé (mesure-étalon). Les CMVi-DM étaient faiblement associées avec les sous-composantes de vitesse de marche et d’équilibre du SPPB, mais pas avec le temps pris pour compléter le test de cinq levers de chaise du SPPB ni le score total du test. Ces résultats permettent de conclure qu’un protocole standardisé d’évaluation de la CMVi-DM procure des valeurs reproductibles et valides chez les patients canadiens avec une MPOC, mais que l’évaluation de la force isométrique du quadriceps ne permet pas de statuer sur la capacité fonctionnelle des patients