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The den V gene from bacteriophage T4 codes for a small, pyrimidine dimer specific, endonuclease. Recent studies have shown that transfection of the gene into DNA excision repair deficient, Xeroderma Pigmentosum cells, can partially restore the excision repair ability of the cells and results in an increased resistance to UV light. In this study the den V gene has been inserted into Herpes Simplex Virus type 1 (HSV 1) in order to determine if HSV 1 can be used as a suitable vector for studying DNA repair genes. A 1.9 kb cartridge containing the den V gene, the 3' LTR of Rous Sarcoma Virus as the promoter, and the SV40 polyadenylation signals was inserted as the thymidine kinase locus of the virus. Properly initiated transcription form the construct, HDV 1, was verified by primer extension analysis. The Host cell reactivation of this virus and several other strains of HSV 1 were examined in normal and Xeroderma Pigmentosum cells. The results from these experiments suggest that both the viral DNA polymerase and thymidine kinase genes play important roles for the survival of UV irradiated HSV 1. / Thesis / Master of Science (MS)

La pyriculariose, maladie causée par le champignon phytopathogène Magnaporthe oryzae, affecte gravement le riz qui constitue l'aliment de base de plus de la moitié de la population mondiale. La connaissance des mécanismes de résistance est nécessaire pour guider la sélection variétale. Au cours de ce travail, une synthèse de la littérature a permis de recenser plus de 60 gènes régulateurs du riz impliqués dans la résistance du riz à différents agents pathogènes. Nous avons complété ces données en étudiant le rôle in planta de huit de ces régulateurs. Un rôle central du facteur de transcription OsWRKY28 a pu être établi et le rôle du récepteur CEBiP a été démontré. Ce travail a aussi exploré l'éventuelle implication d'une nouvelle famille de récepteurs, les Wall-Associated Kinases (WAK) dans la résistance chez le riz. Ce travail montre l'implication des WAK dans la résistance à M. oryzae. Alors que la transcription de la plupart de ces gènes est induite au cours de l'infection, celle du gène WAK112d est réprimée. La régulation transcriptionnelle précoce observée pour certains gènes WAK est déclenchée par la chitine et sous contrôle partiel du récepteur CEBiP et d'OsWRKY28. L'étude de mutants d'insertion et de lignées de surexpression a permis de montrer le rôle positif de trois gènes WAK et le rôle négatif du gène WAK112d dans la résistance. Des approches biochimiques seront nécessaires pour comprendre le mode de fonctionnement de ces récepteurs et pour les relier aux autres systèmes de défense connus. / Rice blast disease, caused by the fungus Magnaporthe oryzae, is one of the most serious diseases on rice which is the staple food of more than the half of the world population. Improving our knowledge of resistance mechanisms is necessary to guide breeding programs. In this study, we reviewed over 60 rice gene regulators involved in resistance against various pathogens. We completed these data by analyzing the role of eight of these regulators. A pivotal role for the transcription factor OsWRKY28 has been established and the role of the CEBiP receptor in planta has been demonstrated. This work also shows the implication of some WAKs in rice blast resistance. Whereas the transcription of most of these genes is induced, transcription of the OsWAK112d gene is repressed upon infection. The early transcriptional regulation observed for some OsWAK genes is triggered by chitin and partially under CEBiP and OsWRKY28 regulation. Analysis of insertion mu tants and over-expressor lines revealed a positive role for three OsWAK genes and a negative role for OsWAK112d gene in rice blast resistance. Biochemical studies will be essential to understand how these receptors work and to connect them to other known defense systems.

La Phostine (PSN ; PHOSphate STarvation response INductor) est une petite molécule organique de synthèse, identifiée dans une chimiothèque par son effet inducteur de l’expression du gène PHT1;4 codant un transporteur de phosphate chez Arabidopsis thaliana. Au cours de cette thèse, j’ai caractérisé l’effet de la PSN chez Arabidopsis et montré que cette drogue induit plusieurs réponses typiques de la carence en phosphate : expression de gènes régulés localement ou à longue distance, accumulation d’anthocyanes et d’amidon, activité des phosphatases acides, inhibition de la croissance des racines. De plus, la PSN provoque une accumulation de phosphate soluble dans les racines.L’étude d’analogues structuraux de la PSN m’a permis d’identifier un motif commun (#10) nécessaire à son activité biologique. Il apparaît que la PSN et ses analogues actifs sont instables à pH acide, ce qui libère le motif #10. Nous montrons que le motif #10 pénètre dans la plante essentiellement par les racines et qu’il ne circule pas des racines vers les feuilles, et faiblement des feuilles vers les racines. L’accumulation de #10 dans les racines expliquerait l’ensemble des effets observés de la PSN et de ses analogues actifs. Nous avons isolé un mutant d’Arabidopsis dont la croissance racinaire résiste à la PSN. Chez ce mutant, la PSN ne provoque plus l’accumulation d’anthocyanes et d’amidon dans les feuilles, ni celle de phosphate dans les racines. En absence de PSN, et sur un milieu de culture partiellement appauvri en phosphate, les feuilles et les racines de ce mutant accumulent plus de phosphate que celles du type sauvage. Chez les plantes, l’homéostasie du phosphate est soumise à une régulation complexe, la caractérisation approfondie de ce mutant apportera de nouveaux éléments pour sa compréhension. / The Phostin (PSN ; PHOSphate STarvation response INductor) is a small organic synthetic molecule identified in a chemical library by its induction effect on PHT1;4 expression, a gene encoding a phosphate transporter in Arabidopsis thaliana. During my PhD, I characterized the effects of PSN in Arabidopsis and shown that this drug induces several phosphate starvation responses: expression of locally or systemically regulated genes, anthocyanin and starch accumulation, acid phosphatase activity, primary root growth inhibition. Moreover, PSN induces inorganic soluble phosphate accumulation in roots.Thanks to PSN’s structural analogues, we identified a common motif (motif #10) necessary to its biological activity. PSN and its analogues are unstable in acidic conditions, leading to the release of #10 motif. We have shown that #10 motif enters the plant mostly by the roots and do not circulate from roots to shoots, and weakly from shoots to roots. The accumulation of #10 motif in the roots explains all the PSN and analogues observed effects. We characterized an Arabidopsis mutant resistant to PSN for its root growth. In this mutant, PSN does not induce anthocyanin or starch accumulation in leaves, neither phosphate in roots. When growing without PSN, on partially phosphate depleted medium, the mutant presents higher phosphate content than the wild type. Phosphate homeostasis is a very complex process in plant, the deep characterization of this mutant will bring new elements for the comprehension of this pathway.

La taille du fruit et la morphologie des tissus du fruit sont des caractères clés définissant la qualité finale du fruit. Parmi la grande diversité de fruits observée dans la nature, la domestication et la sélection ont entrainé d’importantes modifications de la taille et de la morphologie des tissus du fruit. Jusqu'à présent, seuls quelques régulateurs génétiques ont été identifiés, et les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels la morphologie des tissus du fruit est définie restent imprécis. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse est d'identifier et de caractériser de nouveaux régulateurs impliqués dans la morphologie des tissus du fruit. Pour cela, j'ai utilisé une collection de mutants EMS de tomate comme source de diversité génétique et phénotypique et j'ai sélectionné deux mutants présentant des tendances opposées et extrêmes d'épaisseur du péricarpe. Grace à une stratégie de cartographie par séquençage, j’ai identifié une région génétique du chromosome 10, associée au phénotype péricarpe épais. J'ai également étudié le rôle de la Guanylate Binding Protein (GBP) à l’origine du phénotype péricarpe fin chez la tomate. La GBP est une grosse GTP binding protein qui n’a jamais été caractérisée chez les plantes. Afin d'approfondir l’étude de cette protéine, j'ai étudié en parallèle son rôle dans les modèles tomate et Arabidopsis" thaliana. J'ai démontré que les deux protéines homologues sont localisées dans le noyau. La mutation de la GBP chez la tomate induit de fortes altérations de la division et de l'expansion cellulaire à l'intérieur du péricarpe ainsi qu'une altération de la croissance des racines latérales chez la tomate et Arabidopsis, une caractéristique classiquement retrouvée chez les mutants altérés dans la mitose. Cette étude suggère que le GBP joue un rôle dans le contrôle précis des divisions cellulaires dans le péricarpe de tomate. / Fruit size and morphology are key characters defining the final fruit quality. Among the large fruit diversity observed in the nature, human domestication and selection has induced changes in fruit size and tissue morphology. Only a few genetic regulators have been identified so far, thus cellular and molecular mechanisms by which fruit tissue morphology is defined remain incomplete. In this context, the aim of my thesis is to identify and characterize new regulators of fruit tissue morphology. For this purpose, I used a collection of tomato EMS mutants as a source of genetic and phenotypic diversity. I selected two mutants presenting opposite trends of pericarp thickness. Through a mapping-by-sequencing strategy, I identified a genetic region on chromosome 10, associated with an extreme thick pericarp phenotype. I also investigated the role of the Guanylate Binding Protein (GBP) at the origin of a thin pericarp phenotype. The GBP is a large GTP binding protein that was never characterized in plants so far. In order to go deeper into its functional characterization in plants, I studied in parallel the role of the protein in tomato and Arabidopsis "thaliana" models. I showed that both homolog proteins are localized at the nucleus. Mutation of GBP in tomato induced strong alterations in cell division and cell expansion inside the pericarp and altered lateral root growth in tomato and Arabidopsis, a classical feature for mutants impaired in mitosis. This study suggests a role for the GBP in the fine control of cell division in the tomato pericarp.

L'hévéa (Hevea brasiliensis) est la seule source de caoutchouc naturel commercialisé à travers le monde. En Afrique et en Asie, la maladie 'Corynespora Leaf Fall' (CLF), causée par le champignon nécrotrophe Corynespora cassiicola, affecte les plantations hévéicoles en provoquant des défoliations massives sur les clones les plus sensibles. L’évaluation précoce de la sensibilité des clones dans les programmes de sélection est un enjeu majeur pour écarter les individus les plus sensibles des programmes de développement et ainsi réduire la pression de la maladie. Une des méthodes d’évaluation envisagée consiste à tester indirectement la sensibilité des clones aux effecteurs fongiques responsables de la virulence (test toxinique). Parmi tous les effecteurs potentiels du champignon identifiés in silico, seule la cassiicoline Cas1 a été purifiée et caractérisée à ce jour. Il s’agit d’une petite glycoprotéine sécrétée qui jouerait un rôle dans les phases précoces de l’infection en induisant la nécrose des tissus. Les souches porteuses du gène Cas1 sont parmi les plus agressives sur les clones d'hévéa testés. Néanmoins, certaines souches de C. cassiicola ne produisant pas de cassiicoline présentent tout de même une agressivité modérée, suggérant l'implication d'autres effecteurs dans l'établissement de la maladie CLF. Les objectifs de cette thèse sont (i) de déterminer si la sensibilité à la cassiicoline Cas1 est un critère de sélection pertinent pour identifier les clones d’hévéa les plus sensibles à la maladie CLF, et (ii) d’identifier chez l’hévéa des facteurs de sensibilité à la cassiicoline Cas1. Nous avons d'abord analysé l’inoculum naturel et montré que les souches porteuses du gène Cas1 représentent un quart de la population de C. cassiicola dans les plantations d’hévéa d’Afrique de l’Ouest, le reste étant majoritairement constitué de souches dépourvues du gène codant la cassiicoline (Type A/Cas0). Nous avons ensuite créé un mutant de délétion du gène Cas1 pour la souche de référence CCP et comparé sa virulence à celle de la souche sauvage. Nous avons ainsi pu montrer que la cassiicoline Cas1 est bien un effecteur de nécrotrophie déterminant pour la virulence de C. cassiicola chez l’hévéa puisque la souche délétée perd toute virulence sur les clones testés. Enfin, nous avons recherché chez l'hévéa des facteurs de sensibilité à la cassiicoline Cas1 à travers deux approches. La technique de "double hybride en levures" nous a permis d'identifier une trentaine de protéines candidates qui pourraient interagir physiquement avec la toxine. Une approche transcriptomique, nous a permis d’identifier les gènes d’hévéa dont l’expression est modifiée suite à l’application de la cassiicoline purifiée, en comparant un clone sensible (PB260) et un clone tolérant (RRIM600). En conclusion, ces travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'interaction compatible entre C. cassiicola et l'hévéa et ouvrent la voie de la sélection assistée par effecteur. / The rubber tree (Hevea brasiliensis) is the primary commercial source of natural rubber worldwide. In Asia and Africa, H. brasiliensis is affected by the Corynespora leaf fall (CLF) disease, caused by the broad-spectrum necrotrophic fungus Corynespora cassiicola. During severe attacks, massive fall of young leaves can occur in susceptible cultivars. Early evaluation of the susceptibility of rubber clones in breeding programs is required to avoid developing highly susceptible clones that would amplify the disease. An indirect phenotyping procedure envisaged consists in testing the sensitivity to the fungal toxins (or effectors) rather than the susceptibility to the fungus itself (toxin test). Among all putative effectors identified in silico, only cassiicolin Cas1 has been purified and characterized to date. This small secreted glycoprotein was for long suspected to play a role in the early phase of infection by inducing tissue necrosis. Strains carrying the Cas1 gene are the most aggressive on tested rubber clones. However, strains without cassiicolin gene (called Cas0) still show moderate aggressiveness, suggesting the existence of effectors other than cassiicolin. The objectives of this study are (i) to determine if susceptibility to cassiicolin Cas1 is a relevant selection criterion to eliminate the rubber clones most susceptible to CLF disease, and (ii) identify molecular factors involved in the sensitivity to Cas1, in rubber tree. We have thus analyzed the typology of a large set of C. cassiicola isolates collected from various rubber plantations in West Africa. Our results show that isolates carrying the cassiicolin isoform Cas1 are widely represented, but that the most represented type (A/Cas0) are isolates without cassiicolin gene. Here we show that deletion of the cassiicolin gene in the isolate CCP resulted in a total loss of virulence. This clearly demonstrated that cassiicolin is indeed a necrotrophic effector required for the virulence of isolate CCP in rubber tree. Finally, we have investigated susceptibility factors to cassiicolin Cas1 on rubber tree with two different approaches. We identified about thirty candidate proteins that could physically interact with the toxin, through the two-hybrid assay. A transcriptomic approach allowed us to identify the rubber genes differentially expressed in response to the purified cassiicolin, comparing a susceptible clone (PB260) and a tolerant clone (RRIM600). In conclusion, we think that the necrotrophic effector Cas1 can be an interesting tool for effector-based selection of tolerant clones for African plantations; however, efforts should also be placed on A/Cas0 isolates, in order to identify potential necrotrophic effector(s) responsible for their virulence. This would enlarge the potential of effector-based selection.

À en croire Chris Hables Gray nous sommes tous devenus des cyborg citizen. La science-fiction regorge de ces corps fantasmés de cyborgs aux allures de dieux antiques parcourant les espaces intersidéraux ou bien voyageant dans le temps. Toujours plus beaux, performants, rapides et intelligents que l'homo sapiens sapiens, les êtres humains du futur sont généralement divisés en deux catégories : ceux qui ont évolué et ceux qui sont toujours aussi limités que l'homme actuel, « obsolètes » pour employer le mot de néo-mutants comme Lukas Zpira ou Stélarc. Tantôt machine anthropomorphe aux airs de dieu omnipotent, tantôt cerveau synthétique omniscient, l'I.A. renvoie en partie à « la fin », au double sens du terme, de l'humanité. Le cyborg, la fin de l’homme ou un homme meilleur ? Ces « intentions mélioristes » qui laissent sceptique un David Le Breton sont perceptibles dans le cinéma, la littérature ou le jeu vidéo. Le corps s’altère. Humain, trop humain, surhumain, posthumain ? Au travers des progrès scientifiques, tant de la génétique que des technologies de l'information, le corps humain lambda se retrouve trié sur le volet à la naissance par des politiques eugénistes dissimulées sous des propos de luttes contre les maladies à la manière d'un Bienvenue à Gattaca, puis propulsé dans les mondes virtuels, pénétrant des royaumes, jusqu'à présent fictifs, sur une base quotidienne par le biais des technologies qui l'entourent. Le rêve des body hacktivistes est une hétérotopie futuriste, où chacun est libre de choisir sa mutation et où La Mouche de David Cronenberg pourrait côtoyer un Na'vi d'Avatar sans que personne ne s’étonne de ces corps de freaks qui ne sont plus simplement des corps de cyborgs à l'aspect humain mais des corps de monstres à l'esprit humain. Ces biocyborgs sont paradoxalement plus humains que nous. Quelle part restera-t-il de notre corps charnel dans le corps futur ? Y-a-t-il encore une place pour l'homo sapiens sapiens dans le futur ou bien sera-t-il forcé d'abandonner son corps ? À en croire Paul Virilio ou Jean Baudrillard, la disparition du corps est inévitable. Après avoir mis en évidence l’histoire et la généalogie du cyborg, du mythe fictionnel à sa réalisation actuelle, cette thèse se demandera « qu’est-ce que vivre en cyborgs aujourd’hui ? » / According to Chris Hable Gray we all are cyborg citizen now. Science-fiction is full of fantasy bodies looking like ancient gods wandering through space and time, always more beautiful, capable of more performances, faster and smarter than homo sapiens sapiens, generally beings of the future belong to two types: those who evolved and those that remained as limited as present humans, « obsolete » to quote the word of neo-mutants like Lukas Zpira or Stélarc. Some are anthropomorphic almighty god-like machines, others all-knowing synthetic brains, A.I. partly refers to « the end » of Humankind in its double meaning. Is the cyborg the end of man or a better human? Those intended enhancements which puzzled David Le Breton are seen in films, literature or video games. The body alters itself. Human, too human, superhuman, posthuman? Through scientific progress both in genetic and in mass media, the everyday human body finds himself screened at birth by eugenic policies hidden under motives like fight against diseases, as depicted in Gattaca and then thrown into virtual worlds on a daily base, entering kingdoms, fictive so far, using the surrounding technologies. The Body Hacktivist's dream is a futuristic heterotopia, where everyone is free to choose his mutation and where the David Cronenberg's Fly could walk alongside a Na'vi from Avatars surprising no one by their freaks bodies, ultimately: not cyborg bodies looking like humans but freak bodies implanted with human souls. Those biocyborgs are paradoxically more human than we are. What part of our carnal body will remain? Does homo sapiens sapiens have a future or will he need to shed away his body ? If we follow Paul Virilio or Jean Baudrillard, the vanishing of the body is inescapable. After bringing out the history and genealogy of the cyborg, from fictional myth to actual realisation, this thesis will endeavour to show “what is living as a cyborg nowadays?”

L’acide ascorbique (AsA) est un antioxydant essentiel à la fois pour l’homme et les végétaux. L’AsA provenant des plantes représente la source principale de vitamine C dans l’alimentation quotidienne. Au-delà de son impact nutritionnel, augmenter la teneur en AsA dans le fruit de tomate serait susceptible d’influencer la qualité des fruits après la récolte, en termes de conservation mais également de résistance à des pathogènes. Bien que le métabolisme de l’AsA soit bien caractérisé, les mécanismes impliqués dans sa régulation restent jusqu'à présent peu compris. Des études récentes menées sur des feuilles d’Arabisdopsis thaliana montrent que certaines protéines seraient capables de réguler la teneur en AsA, en agissant au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. A ce jour, ce type de régulation n’a pas été encore décrit chez les fruits. Dans ce but, une approche de génétique directe a été développée afin d’étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la teneur en AsA et ceci dans le fruit de tomate (Solanum lycopersicum). L’analyse d’une population de mutants EMS de tomate Micro-Tom a permis l’identification de lignées de mutants présentant des teneurs en AsA de 2,5 à 4 fois plus importantes que celles observées dans les fruits de tomate sauvage. La caractérisation de ces lignées a conduit à des résultats prometteurs pour l’étude de la qualité des fruits après la récolte. Une stratégie de NGS-mapping a permis l’identification des mutations causales responsables du phénotype AsA observé. Ainsi, le criblage de mutants EMS a permis la découverte de nouvelles protéines inattendues, permettant de confirmer au niveau moléculaire l’existence d’une interaction directe en la signalisation lumineuse et la régulation de la voie de biosynthèse de l’AsA. / The ascorbic acid (AsA) is an essential antioxidant in both plants and humans. Plant-derived AsA is the major source of vitamin C in the human diet. In addition to its effect on tomato nutritional value, increasing tomato AsA content would likely affect postharvest storage and resistance to pathogens of the fruit. While AsA metabolism is well characterized, the mechanisms involved in its regulation remain poorly understood. Recent studies in Arabidopsis leaves indicate that few regulatory proteins can regulate this pathway at transcriptional and post-transcriptional levels. Still nothing equivalent has been described in fruits. In that aim, a forward genetic approach has been carried out to investigate the regulation of AsA in tomato (Solanum lycopersicum) fruit. The screening of an EMS tomato mutant population in the miniature cultivar Micro-Tom for identifying mutant lines with AsA-enriched fruits was done. Among the 500 M2 mutant families screened, four mutant lines with higher AsA content ranging from 2.5 to 4 fold were selected. These mutant lines have been characterized for postharvest traits quality and showed promising results. A method based on NGS-mapping allowed the identification of the putative AsA-enriched related gene. Thus, the screening of EMS mutants led to original findings such as the discovery of new unexpected proteins regulating AsA in plants, and particularly in fruits. Our work confirms at the molecular level the direct interaction between light signaling component and the regulation of the AsA biosynthesis pathway.

The Heat Shock Protein 90 (Hsp90) is an essential and highly conserved chaperone that facilitates the maturation of a wide array of client proteins, including many kinases. These clients in turn regulate a wide array of cellular processes, such as signal transduction, and transcriptional reprogramming. As a result, the activity of Hsp90 has the potential to influence physiology, which in turn may influence the ability to adapt to new environments. Previous studies using a deep mutational scanning approach, (EMPIRIC) identified multiple substitutions within a 9 amino acid substrate-binding loop of yeast Hsp90 that provides a growth advantage for yeast under elevated salinity conditions and costs of adaptation under alternate environments. These results demonstrate that genetic alterations to a small region of Hsp90 can contribute to evolutionary change and promote adaptation to specific environments. However, because Hsp90 is a large, highly dynamic and multi-functional protein the adaptive potential and evolutionary constraints of Hsp90 across diverse environments requires further investigation. In this dissertation I used a modified version of EMPIRIC to examine the impact of environmental stress on the adaptive potential, costs and evolutionary constraints for a 118 amino acid functional region of the middle domain of yeast Hsp90 under endogenous expression levels and the entire Hsp90 protein sequence under low expression levels. Endogenous Hsp90 expression levels were used to observe how environment may affect Hsp90 mutant fitness effects in nature, while low expression levels were used as a sensitive readout of Hsp90 function and fitness. In general, I found that mutations within the middle domain of Hsp90 have similar fitness effects across many environments, whereas, under low Hsp90 expression I found that the fitness effects of Hsp90 mutants differed between environments. Under individual conditions multiple variants provided a growth advantage, however these variants exhibited growth defects in other environments, indicating costs of adaptation. When comparing experimental results to 261 extant eukaryotic sequences I find that natural variants of Hsp90 support growth in all environments. I identified protein regions that are enriched in beneficial, deleterious and costly mutations that coincides with residues involved in co-chaperone-client-binding interactions, stabilization of Hsp90 client-binding interfaces, stabilization of Hsp90 interdomains and ATPase chaperone activity. In summary, this thesis uncovers the adaptive potential, costs of adaptation and evolutionary constraints of Hsp90 mutations across several environments. These results complement and extend known structural and functional information, highlighting potential adaptive mechanisms. Furthermore, this work elucidates the impact environment can have on shaping Hsp90 evolution and suggests that fluctuating environments may have played a role in the long-term evolution of Hsp90.