Das BCL-2 Gen wurde als Onkogen der t (14;18)(q32;q21)-Translokation bei follikulären Non- Hodgkin-Lymphomen identifiziert. Die biologische Wirkung des BCL-2 Proteins liegt in der Hemmung der Apoptose. Bei der AML wird eine vermehrte BCL-2 Expression und eine dem- entsprechend verminderte Apoptose bei unreifen malignen myeloischen Vorläuferzellen gefun- den. Diese Krankheit ist teilweise auch chemoresistent. Goldstandard der Induktionstherapie bei AML ist eine Kombination aus Ara-C und Idarubicin, welche Doppel- und Einzelstrang- brüche der DNA induzieren. Apoptose der Leukämiezellen wird durch Schädigung der DNA ausgelöst. BCL-2 kann die Zellen durch Hemmung der Apoptose schützen, indem es die Cy- tochrom-C-Freisetzung blockiert. Darüber hinaus befinden sich die BCL-2- überexprimierenden Zellen in der G0-Phase und sprechen dabei schlecht auf die Chemothera- pie an. Deshalb stellt BCL-2 den Leukämiezellen "doppelten" Schutz zur Verfügung. BCL-2 spielt somit eine wichtige Rolle bei der Chemoresistenz. Ob ein Therapieprotokoll in der Be- handlung der AML effektiv ist, schlägt sich in der Kinetik der zunehmenden oder abnehmen- den BCL-2-Transkripte nieder. Zur Kontrolle des BCL-2-Transkriptes ist die quantitative PCR der qualitativen PCR überlegen. Die Quantifizierung dieses Transkriptes wurde mittels Echtzeit-Fluoreszenz-PCR realisiert. Bei der Echtzeit-Fluoreszenz-PCR wird die Reaktion im geschlossenen Reaktionsgefäß durchge- führt, sodass die Gefahr von Kontamination minimiert werden kann. Da keine Post-PCR Schrit- te nötig sind, wird die Überprüfung zahlreicher Proben durch ein 96-well-Format innerhalb eines Laufes ermöglicht. Die Echtzeit-Fluoreszenz-PCR garantiert ihre Spezifität durch eine spezifi- sche Sonde-Zielsequenz-Bindung und erlaubt eine exakte Quantifizierung der BCL-2- Transkriptzahl. In der vorliegenden Arbeit wurde die BCL-2-Expression in 53 AML-Fällen mittels Echtzeit- Fluoreszenz-PCR untersucht. Das ?-Actin Gen wurde als Referenzgen benutzt. Für die BCL-2- Expression wurde eine Ratio aus der Transkriptzahl des BCL-2 Gens und des ?-Actin Gens ge- bildet. Bei 53 AML-Fällen, die den sieben AML-Subtypen zugeordnet werden konnten(FAB M0-M7), konnte eine BCL-2-Expression nachgewiesen werden. Trotz der unterschiedlich hohen BCL-2-Expression bei diesen Patienten, ergab sich keine signifikante Korrelation zwischen der BCL-2-Expression und den FAB-Subtypen. Außerdem wurde die BCL-2-Expression in T- Zellen, B-Zellen und Granulozyten aus 5 AML-Patienten nachgewiesen. Die BCL-2-Expression wurde nicht von den Subpoplationen der mononukleären Zellen wie z.B. T-Zellen, B-Zellen, Granulozyten beeinflusst. Bei sieben Patienten wurden Proben im Verlauf untersucht. Dabei korrelierte eine hohe oder ansteigende BCL-2-Expression mit einem Rückfall der AML. Die Anzahl der untersuchten Proben im Verlauf ist jedoch zu klein, um definitive Schlußfolgerungen zu ziehen. Eine prospektive Untersuchung von größeren Patientenzahlen erscheint sinnvoll. / The bcl-2 oncogene was discovered by virtue of its association with the translocation, t(14;18) (q32;q21), observed in most follicular lymphomas. The bcl-2 protein is a 26 kDa integral membrane protein which functions by enhancing cell viability through the inhibition of apoptotic death. Acute myeloid leukemia is a lethal malignant disease characterized by an abnormal proliferation and differentiation of myeloid progenitor cells. The bcl-2 oncogene contributes to leukemogenesis by prolonging the life span of defected progenitor cells. Although the expression of bcl-2 in blast cells of acute myeloid leukemia is heterogeneous, a significant proportion of blast cells are shown to have high bcl-2 levels. The highest bcl-2 levels are found in cells that grow autonomously in vitro and also in blast cells expressing the CD34 surface antigen. These groups of AML patients are tranditionally the ones in which the prognosis is poor, because most of the chemotherapeutic agents like cytosine-arabinoside (Ara-C) exert their effect by triggering apoptosis. The high level of the bcl-2 gene that inhibits apoptosis is implicated in the resistance of AML blast cells to chemotherapy and leads to unfavorable prognosis. In this study, a real time fluorescence PCR assay was used to monitor the expression of the bcl-2 transcript in the therapeutic course of AML patients. By applying this rapid new developed quantitative method, the changes of the bcl-2 transcript with chemotherapy can help to evaluate the efficacy of therapeutic interventions in AML. The real time fluorescence PCR has many advantages over traditional measures. First, the assay is extremely rapid because post-PCR processing steps are unnecessary. All relevant data are collected real time during the course of a 2h PCR cycle program; data analysis can be completed in less than 10 min. Second, the assay from reaction set-up to data collection and analysis is a closed-tube system, which reduces the risk of false positive resulting from PCR product carry- over contamination and eliminates variation from additional pipetting steps. Finally, the real time fluorescence PCR is highly specific for the gene target of interest. Here the expression levels of the bcl-2 gene were measured in 53 patients with acute myeloid leukemia and normalized by ?-actin, a house-keeping gene expression as endogenous reference. The bcl-2/?-actin ratio from the 53 patients with AML was various, but not related to FAB subtypes. And also, this transcript ratio was not affected by mononucleated cell types. The samples from seven patients were measured to evaluate the association between the bcl-2 expression and the responsiveness of AML patients to the chemotherapy. The high or gradual elevation of the bcl-2 expression demonstrated the loss of effect in update-therapy protocol and the relapse in AML patients. Although the amount of samples are not large enough to reach the final conclusion, it is of significance that a number of patients will be analyzed in the future.

Der CCAAT enhancer binding protein beta (C/EBPβ) Transkriptionsfaktor reguliert die Differenzierung, Proliferation und Funktion vieler Zelltypen, einschließlich verschiedener Zellen des Immunsystems. Eine detaillierte molekulare Analyse des Mechanismus, wie C/EBPβ alternative Zellschicksale steuert, wurde jedoch bisher noch nicht unternommen. Es wurde gezeigt, dass die ektopische Expression von C/EBPβ in determinierten B- Vorläuferzellen diese zu inflammatorischen Makrophagen reprogrammieren kann. Wir haben dieses Reprogrammierungsystem verwendet, um die Strukturelemente in C/EBPβ, die für die Regulation der (Trans)Differenzierung durch C/EBPβ wichtig sind, zu untersuchen. Um die maßgeblichen C/EBPβ Proteinmodule für die Reprogrammierung zu bestimmen, wurden entweder C/EBPβ Wildtyp Isoformen oder Mutanten in primären murinen B-Vorläuferzellen ektopisch exprimiert. Die Analysen ergaben, dass die translational regulierten langen Isoformen LAP* and LAP, jedoch nicht die kurze Isoform LIP lymphoide Zellen zu myeloischen Zellen reprogrammieren können. Des weiteren haben wir gezeigt, dass die konservierten Regionen 2, 3 und 4 der C/EBPβ Transaktivierungsdomäne essentiell und ausreichend für die Konvertierung von B Zellen zu myeloischen Zellen sind. Die reprogrammierten myeloischen Zellen setzten sich aus einer heterogenen Population verschiedener myeloischer Zelltypen zusammen. Detaillierte Analysen von CD11b+ reprogrammierten Zellen zeigten, dass diskrete konservierte Regionen von C/EBPβ verschiedene pro- und anti-inflammatorische Gene und divergente Entwicklungsprogramme aktivierten. Des Weiteren führten nicht nur strukturelle C/EBPβ Mutanten sondern auch Puktmutationen an Stellen, die posttranslationalen Modifikationen (PTM) unterliegen, zu verschiedenen Reprogrammierungsergebnissen. Diese Daten zeigen, dass die C/EBPβ abhängige myeloische Diversifikation durch die Integration von strukturellen C/EBPβ Proteinmodulen und deren signalabhängigen PTMs erreicht wird. / The CCAAT enhancer binding protein beta (C/EBPβ) transcription factor regulates differentiation, proliferation, and functionality of many cell types, including various cells of the immune system. A detailed molecular understanding of how C/EBPβ directs alternative cell fates remains largely elusive. Ectopic expression of C/EBPβ has been previously shown to reprogram committed B cell progenitors into inflammatory macrophages. We took advantage of this reprogramming system in order to examine how C/EBPβ regulates (trans)differentiation. To determine which C/EBPβ protein modules are important for reprogramming, C/EBPβ wild type isoforms and mutants were ectopically expressed in primary mouse B cell progenitors. The data showed that the translationally regulated long isoforms LAP* and LAP, but not the N-terminally truncated isoform LIP can reprogram lymphoid cells into myeloid cells. Furthermore, we found that conserved regions 2,3 and 4 in the C/EBPβ protein transactivation domain are necessary and sufficient for B-to-myeloid cell conversion. Interestingly, the reprogrammed myeloid cells were found to represent a heterogeneous mixture of different myeloid cell types. Detailed analyses of the reprogrammed CD11b+ cells revealed that discrete conserved regions in C/EBPβ activated distinct pro- and anti-inflammatory genes and triggered divergent differentiation programs. Moreover, not only structural C/EBPβ mutants, but also post-translational modification (PTM) site mutations led to different reprogramming outcomes. These data suggest that C/EBPβ orchestrates myeloid diversification by integrating PTMs with structural plasticity as signal dependent adaptable modular properties to determine cell fate.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde retrospektiv die Minimale Resterkrankung von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und Myelodysplastischen Syndrom nach allogener Stammzelltransplantation mit minimaler Konditionierung untersucht. Hierfür wurden vier unterschiedliche Methoden zur Detektion der Minimalen Resterkrankung analysiert. Nach Etablierung einer quantitativen Real-Time PCR für das Wilms Tumor Gen 1 (WT1) im peripheren Blut wurden diese Ergebnisse mit bereits routinemäßig erhobenen Daten des Chimärismus im Gesamtknochenmark und in CD34+ Zellen sowie der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) krankheitsspezifischer chromosomaler Aberrationen von insgesamt 88 Patienten verglichen und statistisch ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass die Genexpressionanalysen des WT1 sowie die Chimärismusanalysen ein Rezidiv im Gegensatz zu den FISH Analysen vier Wochen im Voraus detektieren können. In Reiceiver Operating Curve Analysen wurden eine WT1 Expression von > 24 WT1/10.000 ABL1 Kopien und der Abfall des CD34+ Spenderchimärismus von ≥ 5% als diagnostisch stärkste Methoden identifiziert. In uni- und multivariaten Analysen von insgesamt 20 Parametern wurden die beiden Methoden als unabhängige Variablen für ein frühes Rezidiv, progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben bestätigt. Kombiniert man beide Methoden, so kann bei jeweiligem negativen Testergebnis ein Rezidiv innerhalb der nächsten vier Wochen nahezu ausgeschlossen werden.

Unter Verwendung eines mathematischen Hämatopoese-Modells werden verschiedene Fragen adressiert, die im Zusammenhang mit einer möglichen Optimierung der gegenwärtigen Therapie chronischer myeloischer Leukämie (CML) stehen. Es handelt sich um ein agentenbasiertes Modell, das heißt, jede Zelle wird als einzelnes Objekt repräsentiert und gemäß festgelegter Regeln im Computer simuliert. Es werden proliferative von ruhenden Stammzellen unterschieden, wobei sich der Proliferationszustand reversibel ändern kann. Das Modell basiert auf der Annahme, dass sich normale und maligne Stammzellen in einem Wettbewerb um gemeinsame Ressourcen befinden, wobei der CML-Klon einen kompetitiven Vorteil besitzt. Es ist ungeklärt, ob Tyrosinkinaseinhibitoren wie Imatinib (IM) in der Lage sind, die Erkrankung zu heilen. Es gibt Evidenz, dass residuale leukämische Stammzellen im Knochenmark persistieren, welche in einem Ruhezustand (G0-Phase des Zellzyklus) von IM nicht eradiziert werden können. Proliferativ aktive Zellen sind der IM-Wirkung hingegen ausgesetzt. Das Modell sagt voraus, unter welchen Bedingungen eine Kombinationsstrategie von IM mit stammzellaktivierenden Substanzen Synergieeffekte hervorbringen könnte. Ein verwandtes Problem ist die Frage, in welchen Fällen nach Reduktion der Tumorlast auf ein mittels hochsensitiver Messmethoden undetektierbares Niveau ein Therapieabbruch gerechtfertigt ist. Basierend auf dem dynamischen Modell wird in dieser Arbeit ein Prädiktor vorgeschlagen, der vorhersagt, ob ein Patient nach Abbruch der Therapie einen molekularen Rückfall zu erwarten hat. Zusätzlich wird approximativ ein modellunabhängiger Prädiktor angegeben, der die Vorhersage nur auf Basis klinisch messbarer Größen gestattet.

Aberrant subcellular localization of mutant transmembrane receptors is increasingly acknowledged as a possible mechanism for an altered signaling quality leading to transformation. There is evidence that mutated receptor tyrosine kinases of subclass III, for example the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) and KIT-protein, are aberrantly localized in human cancers. In order to further analyze this phenomenon, we investigated the localization of FLT3, a subclass III receptor tyrosine kinase frequently mutated in leukemia. By immunofluorescence staining and confocal laser scanning microscopy we found that in retrovirally transduced COS7 cells, wild type FLT3 receptor protein is localized primarily at the cell surface. In contrast, a mutant FLT3 receptor protein with an internal tandem duplication (ITD) accumulates in a perinuclear region and is not detectable at the plasma membrane. Surprisingly, and in contrast to previously published data, intracellular FLT3-ITD accumulation could neither be detected in the endoplasmic reticulum (ER) nor in the Golgi apparatus. Furthermore, transient overexpression per se leads to accumulation of wild type FLT3 receptor protein in the ER in addition to surface localization, probably due to inefficient intracellular transport by the overloaded sorting machinery of the secretory pathway. Based on our data and the immature glycosylation pattern of FLT3-ITD, we speculate that the mutant protein resides most probably in an unidentified compartment of the secretory pathway between the ER and the Golgi apparatus. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Hintergrund Die chronische myeloische Leukämie (CML) ist eine myeloproliferative Er- krankung, die aufgrund ihres Modellcharakters unter der Behandlung mit Tyrosin-Kinase- Inhibitoren (TKI) gut für eine Beschreibung mittels computerbasierter Modelle geeignet ist. Grundlage für die Entstehung einer CML ist die Bildung eines Philadelphia-Chromosoms durch eine Translokation der Chromosomen 9 und 22. Es resultiert das Onkogen BCR- ABL1, welches für eine konstitutiv aktive Tyrosinkinase codiert. Diese führt zu ungeregelter Proliferation der betroffen Zellen und zur Verdrängung der gesunden Blutbildung. Das überaktivierte Protein kann durch TKIs gezielt gehemmt werden. Damit ist es möglich, die Tumorlast erheblich zu senken und das Fortschreiten der Erkrankung aufzuhalten. Aktuell werden in der klinischen Anwendung außerhalb von Studien TKIs für die gesamte Lebensdauer der Patienten eingesetzt. Absetzstudien zeigten, dass circa 50% der Patienten nach einer über zwei Jahren nicht nachweisbaren BCR-ABL1-Last nach Behandlungsstopp kein erneutes Anwachsen der Tumorlast aufwiesen. Die Anwendung von computergestützten Modellsimulationen hilft, Zugriff auf die klinisch nur schwer zu messenden leukämischen Stammzellen zu bekommen und darüber Vorhersagen über den weiteren Therapieverlauf zu treffen. Aufgabenstellung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollen Möglichkeiten der Übertragung von Patientendaten auf das etablierte Modell nach Roeder und Loeffler (2002) verbessert werden. Die vom Modell vorhergesagten Stammzellkinetiken sollen abschließend auf Praxistauglichkeit geprüft werden. Material und Methoden Aufgrund der Vergleichbarkeit zu früheren Untersuchungen erfolgte die Auswahl von 51 Patienten des deutsches Armes der IRIS-Studie. Deren Therapieverläufe wurden analysiert und können über eine biphasische exponentielle (biexponentielle) bzw. über eine stückweise lineare Funktion beschreiben werden. Als Erweiterung der Arbeiten von Horn et al. (2013) wurden alle Parameter der biexponentiellen Funktion in die Entwicklung neuer Methoden einbezogen. Zusätzlich wurde untersucht, ob die Einbeziehung von zensierten Messpunkte die Form der biexponentiellen Funktion verändert. Basierend auf den Therapiedaten der IRIS-Patienten erfolgte die Ermittlung eines Para meterraumes für Eingangsparameter der Modellsimulation (Modellparameter), welcher in 270.400 individuelle Paramterkombinationen unterteilt wurde. Es erfolgten anschließend die Simulation und Auswertung nach der biexponentiellen Beschreibung. Auf Basis dieser erheblich größeren Datengrundlage konnten zwei neue Verfahren der Modellparameteridentifikation für individuelle Patienten entwickelt werden. Einerseits wurde in Anlehnung an die Arbeit von Horn et al. (2013) ein Verfahren unter Nutzung der Regression vorgestellt. Andererseits konnte über den Vergleich der Abstände zwischen simulierten und realen Therapieverläufen eine Suche (lookup-table) etabliert werden. Die Berechnung des Abstandes zwischen Therapieverläufen ermöglicht gleichzeitig den Vergleich der verschiedenen Verfahren und damit eine Aussage über deren Anpassungsgüte. Zum Schluss wurde beispielhaft für einen Patienten das Verfahren der lookup-table angewendet und die resultierende Stammzellkinetik weiter analysiert. Ergebnisse Einführend erfolgte die Analyse der resultierenden biexponentiellen Funktion mit und ohne Einbeziehung von Messunsicherheiten. Es zeigte sich, dass der Verlauf dieser Funktion besonders in Bereichen, die von einbezogenen Messunsicherheiten betroffen sind, abweichend ist. Die Beschreibung des Langzeitverlaufs erfolgt jedoch annähernd gleich. Anschließend erfolgte die Validierung der Größe des vorsimulierten Datenpool anhand eines Vergleichs der statistischen Parameter von Patienten und Simulationen. Dieser zeigte sich dabei für die weiteren Untersuchungen geeignet. Die Nutzung der lookup-table zur Identifikation der am besten zu einem Patienten passenden Therapiesimulation ist überlegen sowohl gegenüber von der Horn et al. (2013) beschriebenen als auch in dieser Arbeit neu entwickelten Regressionsverfahren. Diese ergeben deutliche Abweichungen zwischen Patientendaten und Simulation. Eine Analyse des vorhergesagten Therapieverlaufes im Stammzellkompartiment ergibt jedoch, dass ähnliche Therapieverläufe im peripheren Blut durch stark unterschiedliche Stammzellkonfigurationen beschrieben werden können. Es resultiert eine starke Streuung der vorhergesagten Zeitpunkte eines möglichen Therapieendes. Schlussfolgerungen Die Nutzung der lookup-table zu Identifikation einer passenden Therapiesimulation ist hoch effektiv und anderen Verfahren, die auf Regression basieren, überlegen. Die etablierte Computersimulation nach Roeder und Loeffler (2002) bietet Zugriff auf die Therapie in der Ebene der Stammzellen. Die in weiteren Analysen gezeigten Streuungen der vorhergesagten Therapieverläufe im Stammzellkompartiment lassen den Schluss zu, dass Methoden zur Eingrenzung der Stammzellverläufe entwickelt werden müssen, um die Vorhersagen klinisch nutzbar zu machen. Weiterhin muss anhand von Messungen an Knochenmarkproben von realen Patienten geprüft werden, ob die von der Simulation postulierten Verläufe der Tumorlast im Stammzellkompartiment der realen Behandlung entsprechen. Ausblick Die in aktuellen Arbeiten beschriebene Rolle des Immunsystems im Therapieverlauf der CML (Saussele et al. 2016; Clapp et al. 2016) sollte in eine Verbesserung des Stammzellmodells nach Roeder und Loeffler (2002) einfließen. Weiterhin kann die Validierung der im Rahmen der Individualmedizin zu treffenden Absetzvorhersagen letztendlich nur über klinische Absetzuntersuchungen ermöglicht werden. / Background Chronic myeloic leukaemia (CML) is a myeloproliferative disease, which is well suited for modelling approaches. It is characterized by the oncogenic BCR-ABL1 fusion gene originating from an inverse translocation of the chromosomes 9 and 22 leading to the Philadelphia chromosome. The result is a constitutively activated tyrosine-kinase. This is followed by an extensive proliferation of leukaemic stem cells leading to a displacement of normal haematopoesis. The molecular specificity of CML forms the basis of a highly efficient, targeted therapy by tyrosine kinase inhibitors (TKIs). TKIs can decrease the tumour burden and slow down or eventually stop progressing of the disease. Currently, in clinical applications drugs are administered for the remaining life span. Interestingly, in recent treatment cessation trials patients were stopped after two years of non-detectable tumour burden and about 50% remained without relapse. The application of computer-based modelling helps to gain access to stem cell counts being difficult to measure clinically. This forms the basis for predictions of long-term therapy outcomes. Aim of this work This work aims on identifying a suitable algorithm to efficiently identify model simulations that optimally decribe individual patient kinetics. Furthermore, the clinical usability of the new methods was investigated. Material and methods The analysed group of patients was chosen out of the German cohort of the IRIS trial to ensure comparability to former investigations. It consists of 51 individuals. The course of leukaemic burden , i. e. leukaemic vs. non-leukaemic cells on a single patient level can be described as a biphasic exponential (bi-exponential) or a piecewise linear function. As an extension to former methods described by Horn et al. (2013) all parameters are included into further method development. Additionally, an investigation was conducted whether censored data points change the functional behaviour of a bi-exponential fit based on patients’ data. According to therapy data of all patients an input parameter space for the model simulation was delimited, such that all observed patient kinetics can be mimicked by the model. This parameter space was uniformly divided into 270.400 discrete parameter combinations. The therapy simulation of each combination was conducted and described by a bi-exponential function likewise to the patients’ fit. With the help of these huge variety of in silico therapies two new methods of model parameter identification for individual patients were developed. The first one is an advanced approach based on a regression model proposed by Horn et al. (2013). The second one by comparing distances between the patients’ and the models’ bi-exponential functions (lookup table). The comparison of the distances between different therapy courses (either simulated or patients’ data) was also used to compare the quality of different methods. As an example, for one patient the stem cell kinetics from the model were analysed in more detail and checked for robustness. Such a strategy, which might build the basis for clinical applications. Results A comparison between the different bi-exponential functions with and without censored data points revealed differences especially in the area in which censoring was performed. However, for the long-term tumour burden censored data had no influence. Secondly, an investigation was performed showing the sufficiency of the pre-simulated therapy courses for the new methods, i. e. lookup-table and regression models. The lookup- table turns out to be superior to identify a therapy simulation for a unique patient, since the complexity of linear regression models lead to increased deviations between patients’ therapy courses and the simulations. Unfortunately, distinct stem cell configurations lead to similar therapy descriptions in peripheral blood, assuming the correctness of the model. As a result, the prediction of a safe treatment cessation is often widely spread. Conclusions The new developed lookup-table to identify model simulations suitable for an individual patient is highly effective and superior to other methods using regression models. The simulation of the TKI treatment using the agent-based model of Roeder und Loeffler (2002) gives easy access to therapy courses on the level of leukaemic stem cells. Unfortunately, the finding of a well fitting simulation within the peripheral blood is not enough to provide a point of safe treatment cessation, since different stem cell configurations can lead to similar therapy courses. Additionally, it is necessary to check which of the assumed therapy courses on the stem cell level is appropriate. This could be done by gathering more information from bone-marrow punctures during the course of treatment. Outlook Investigations of new data showed the important role of the immune system in CML treatment (Saussele et al. 2016; Clapp et al. 2016). This should be taken into account by improving the model of Roeder und Loeffler (2002). Additionally, data from cessation trials can be used to validate the model assumptions.

Acute myeloid leukemia (AML) is a malignancy of the hematopoietic system caused by somatic mutations that accumulate in hematopoietic stem and progenitor cells. The cells are thereby transformed into leukemic stem cells (LSCs), which cannot be efficiently eliminated with the standard chemotherapy treatment. Thus, LSCs pose a risk of relapse for AML patients. There- fore, identification and characterization of LSCs is a major challenge in the field of AML research. Through next generation sequencing approaches the mutational spectrum of AML cells has been established and a continuous effort is being made to resolve the order of mutation acquisition and their functional consequences. In the subgroup of AML patients that bear a mutation in Nucleophosmin 1 (NPM1 ), a mutation in DNA-methyltransferase 3 A (DNMT3A) has been often found as a co-occurring event. Evidence suggests that this mutation arises early in leukemogene- sis and marks leukemic progenitors and stem cells. However, the functional consequences of this mutation are far from being understood. In this thesis work, I set out to unravel novel functional dependencies of the DNMT3A-mutant AML cells that can be exploited for therapeutic purposes. To nominate genes that are essential for the survival of primary AML cells, I performed a func- tional RNA interference-mediated drop out screen in 38 DNMT3A- and NPM1-mutant AML patient lines. The patients in this cohort were divided into two groups, based on the treatment outcome: an early relapse (ER) group and a long term remission (LTR) group. To nominate can- didate genes in each group, I have selected 12 screens with the highest data quality and performed a differential bioinformatic analysis. The analysis yielded 7 potential candidates, from which I initially validated three: Glucocorticoid modulatory element binding protein 1 (GMEB1), Mouse double minute 4 (MDM4) – both shared between the ER and the LTR groups – and Thioredoxin domain containing protein 9 (TXNDC9 ), which scored only in the ER group. Additional rounds of validation nominated MDM4 as the strongest candidate. To investigate the role of MDM4 in LSCs, I knocked it down in three patient samples and performed the long-term culture-initiating cell assay. However, the number of progenitor colonies that formed by the end of the assay was not enough for a statistical evaluation, probably due to the low frequency of long-term culture- initiating cells in the samples. Therefore, no conclusion regarding the functional dependency of LSCs on MDM4 could be made. However, a recent study suggested that loss of MDM4 causes cell cycle arrest and induces apoptosis in leukemic cell lines and primary cells, including progenitor populations, confirming the findings of this thesis. Nevertheless, the question about the role of MDM4 in NPM1 -mutant AML cells remains open. The NPM1 involvement in the p14Arf-MDM2- p53 pathway and the deregulation of this pathway caused by the NPM1 mutation indicate that MDM4 might poses special functions in NPM1 -mutant AML. Therefore, it should be investigated if MDM4 is a particularly suitable therapeutic target in AML with NPM1 mutation.

Die Chronisch Myeloische Leukämie (CML) ist eine maligne, hämatologische Erkrankung, welche auf der unregulierten Proliferation von leukämischen myeloischen Zellen im Knochenmark beruht. Die Folge ist eine Verdrängung der normalen Hämatopoese durch leukämische Zellen mit einem unbehandelt letalen Verlauf. Die Einführung einer spezifischen Therapie der CML durch Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) hat die Behandlung der CML maßgeblich beeinflusst und stellt aktuell die Standardtherapie für betroffene Patienten dar. Mehrere klinische Studien zeigten, dass bei einem Teil der Patienten mit gutem Therapieansprechen im Verlauf die Therapie beendet werden kann, ohne dass es dabei zu einem Rückfall der Patienten kommt. Eine sichere Identifikation dieser Patienten ist aktuell nicht möglich. Weiterhin sind die Mechanismen, welche einer therapiefreien Remission zugrunde liegen, nicht endgültig geklärt. Allerdings ergaben mehrere aktuelle Studien Hinweise auf eine immunologische Komponente, der in diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle zukommen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf gewöhnlichen Differentialgleichungen basierendes, mathematisches Modell der CML um eine immunologische Komponente erweitert, um eine bessere Beschreibung des Verhaltens von CML-Patienten unter TKI-Therapie und nach Beendigung dieser zu ermöglichen. Es wurde im Sinne eines konzeptionellen Modellierungsansatzes untersucht, welche Mechanismen dem Rezidivverhalten innerhalb eines solchen Modells zugrunde liegen und ob anhand des verwendeten Modells das Auftreten eines Rezidivs zuverlässig vorhergesagt werden kann. Grundlage dieser Arbeit stellen BCR-ABL Verlaufsmessungen von 21 CML-Patienten dar, welche mit einem TKI behandelt wurden und bei denen dieser im Rahmen einer klinischen Intervention abgesetzt wurde. Während die Anpassung eines mathematischen Modells ohne immunologische Komponente bereits eine gute Beschreibung des BCR-ABL/ABL Abfall unter Therapie ermöglichte, versagte dieses Modell bei der Beschreibung einer therapiefreien Remission. Nur durch die Erweiterung des Modells um eine individuelle immunologische Komponente konnte der BCR-ABL/ABL Verlauf während und nach Stopp der TKI-Therapie korrekt wiedergegeben werden. Dabei zeigte sich, dass zur Bestimmung der Modellparameter allerdings eine Einbeziehung der BCR-ABL Messwerte nach Absetzen der Therapie notwendig war. Deutliche Unterschiede der auf diese Weise ermittelten immunologischen Modellparameter zwischen Patienten mit und ohne Rezidiv signalisierten einen entscheidenden Einfluss der immunologischen Komponente auf das Rezidivverhalten. Die weitere Untersuchung der Attraktorlandschaften für das Rezidivverhalten zeigte, dass Patienten darüber hinaus anhand ihrer Immunantwort in drei verschiedene Klassen eingeteilt werden können: Einige Patienten zeigten eine insuffiziente Immunantwort (Klasse A) und somit nach Therapiestopp immer ein Rezidiv, da ihr Immunsystem nicht in der Lage ist, die erneute Proliferation residualer leukämischer Zellen nach Absetzen der Therapie zu verhindern. Im Gegensatz dazu zeigten einige Patienten eine suffiziente Immunantwort. Während Patienten mit einer suffizienten und starken Immunantwort (Klasse B) nur eine minimale Therapiedauer in den Simulationen zur Aufrechterhaltung einer Remission nach Therapiestopp benötigten, war die Verhinderung eines Rezidivs für Patienten mit einer suffizienten und schwachen Immunantwort (Klasse C) nur bei Erreichen eines optimalen Gleichgewicht zwischen der Zahl leukämischer Zellen und der Aktivität des Immunsystems möglich. Es konnte gezeigt werden, dass dies theoretisch durch eine individuelle, fein abgestimmte Anpassung von Therapiedauer und Therapieintensität erreicht werden kann. Da eine Bestimmung der Modellparameter nur unter Einbeziehung der BCR-ABL Messungen nach Stopp der TKI-Therapie möglich war, erlaubte dieses Vorgehen entsprechend keine Vorhersage des Rezidivverhaltens. Daher erfolgte die Simulation einer 12-monatigen TKI-Dosisreduktion für jeden Patienten mit einer anschließenden Betrachtung der BCR-ABL/ABL Verläufe während der Dosisreduktion. Eine Korrelation zwischen dem BCR-ABL/ABL Anstieg innerhalb dieses Zeitraums und dem klinischen Rezidivverhalten zeigte, dass die aus einer solchen Systemstörung resultierenden Veränderungen der BCR-ABL/ABL Verläufe die notwendigen Informationen zur Vorhersage des Rezidivverhaltens liefern könnten. Dabei sind diese Modellvorhersagen in qualitativer und quantitativer Übereinstimmung mit klinischen Daten der DESTINY-Studie (NCT01804985). Es konnte somit gezeigt werden, dass ein mathematisches Modell der CML durch Erweiterung um eine immunologische Kontrollkomponente in der Lage ist, den Krankheitsverlauf von CML Patienten während und nach Absetzen der TKI-Therapie korrekt zu beschreiben. Damit unterstützt diese Arbeit die Ergebnisse aktueller klinischer Studien, welche einer anti-leukämischen Immunantwort eine Bedeutung in der Aufrechterhaltung einer therapiefreien Remission zuschreiben. Da eine Vorhersage des individuellen Rezidivverhaltens allein anhand der BCR-ABL Messungen vor Therapieabsetzen nicht möglich war, unterstreicht diese Arbeit die Notwendigkeit weiterer Studien auf diesem Gebiet. Dabei legen die Ergebnisse diese Arbeit nahe, dass Studien mit klinischen Interventionen, wie z.B. einer temporären TKI-Dosisreduktion, die notwendigen Informationen für solche Vorhersagen enthalten könnten.:1. Einleitung und Zielstellung 1.1. Einleitung 1.2. Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit 2. Medizinischer Hintergrund 2.1. Hämatopoese 2.2. Chronische Myeloische Leukämie 2.2.1. Epidemiologie 2.2.2. Ätiologie und Pathogenese 2.2.3. Klinik und Verlauf 2.2.4. Diagnostik 2.2.5. Therapie 2.2.6. Immunologische Einflussfaktoren auf das Rezidivverhalten 3. Systembiologischer Hintergrund 3.1. Statistische Modelle der TKI-Therapie 3.2. Mechanistische Modelle der TKI-Therapie 3.3. Modellierung von Therapie und Absetzverhalten 3.4. Modelle der CML mit einer immunologischen Komponente 4. Material und Methoden 4.1. Klinische Daten 4.1.1. Herkunft der klinischen Daten 4.1.2. Selektion geeigneter Patienten 4.2. Statistische Beschreibung 4.2.1. Bi-exponentielles Modell 4.2.2. Modellanpassung 4.2.3. Statistische Tests 4.3. Mechanistisches Modell 4.3.1. CML-Modell ohne immunologische Komponente 4.3.2. CML-Modell mit immunologischer Komponente (Immunmodell) 4.3.3. Allgemeines Vorgehen zur Modellanpassung 4.3.4. Berechnung der Anfangsbedingungen 4.3.5. Anpassungsstrategien 4.3.6. Sensitivitätsanalysen 4.3.7. Phasenportaits 4.3.8. Regressionsmodelle 4.3.9. Statistische Tests 5. Ergebnisse 5.1. Patientencharakteristika 5.2. Struktureller Vergleich der Patienten mit und ohne Rezidiv 5.3. CML-Modell ohne immunologische Komponente 5.3.1. Aufbau des Modells 5.3.2. Sensitivitätsanalyse 5.3.3. Anpassung an die klinischen Daten 5.4. CML-Modell mit immunologischer Komponente (Immunmodell) 5.4.1. Aufbau des Modells 5.4.2. Anpassung an die klinischen Daten 5.4.3. Klassifizierung der Patienten anhand ihrer Immunantwort 5.4.4. Sensitivitätsanalyse 5.4.5. Einfluss der Therapie auf das Rezidivverhalten 5.4.6. Informationsgewinn durch Simulation einer Dosisreduktion 6. Diskussion 6.1. Diskussion der initial formulierten Fragestellungen 6.2. Kritische Betrachtung der Herangehensweise 6.2.1. Patientenselektion 6.2.2. Modellierung der CMLII 6.3. Ausblick 6.3.1. Erweiterungsmöglichkeiten des verwendeten mathematischen Modells 6.3.2. Unterstützung des Designs klinischer Studien 7. Zusammenfassung 8. Summary A. Anhang A.1. Berechnung des Immunfensters A.2. Berechnung der Attraktoren A.2.1. Heilungs-Attraktor A.2.2. Remissions- und Rezidiv-Attraktor A.3. Abbildungen und Tabellen Literaturverzeichnis / Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a hematological cancer characterized by the unregulated proliferation of immature myeloid cells in the bone marrow. This leads to a displacement of the normal hematopoiesis with a lethal course if untreated. The introduction of Tyrosine Kinase Inhibitors (TKIs) as a specific therapy has significantly influenced the CML treatment and represents the current first line treatment option for affected patients. Several clinical trials confirmed that TKI treatment can be stopped for some well responding patients without the occurrence of a relapse. It is not yet possible to prospectively identify those patients. Also, the mechanisms leading to a relapse or a treatment-free remission still remain unclear. However, recent clinical trials suggest that an immunological component plays an important role in the long-term disease control. Aim of this work was the expansion of a mathematical CML model by an anti-leukemic immune component to improve the description of the disease behavior of CML patients while treated with TKI and after stopping treatment. A mathematical proof of concept analysis of the model mechanisms leading to relapse or treatment-free remission was performed. Also, it was examined whether such a model can reliably predict the occurrence of a relapse. The BCR-ABL time courses of 21 TKI-treated CML patients, for whom TKI-therapy had been stopped as a clinical intervention, were used in this work. While the adaption of a simplified ODE-model without the immune component could describe the BCR-ABL/ABL decrease during therapy, the model failed to describe a treatment-free remission. Only by expanding the model with an individual immune component, it was possible to correctly reproduce the BCR-ABL/ABL time courses during TKI-treatment and after treatment cessation. Also, an estimation of the individual parameters was only possible by fitting the model to the complete BCR-ABL/ABL time course (including measurements after treatment cessation). Significant differences of the immune parameters determined in this way between relapsing and non-relapsing patients signaled an important influence of the immune component on the relapse behavior. A detailed mathematical analysis of the identified relapse behavior attractor landscapes also suggested that the available patients can be grouped in three general classes (A–C) corresponding to their individual immune response. Certain patients presented an insufficient immune response (class A) and thus, consistently relapsed after stopping treatment as they were unable to prevent a renewed proliferation of residual leukemic cells after treatment cessation. In contrast, some patients showed a sufficient immune response. While patients with a sufficient and strong immune response (class B) required only a minimal treatment duration in the simulations to retain a remission after stopping treatment, the prevention of a relapse for patients with a sufficient and weak immune response (class C) was only possible if an optimal balance between leukemia abundance and immunological activation was achieved before treatment cessation. It could be shown that this balance can theoretically be achieved by an individual titrated and narrowly adapted treatment duration and intensity. Since estimations of the model parameters could only be obtained if the complete data (including post-cessation measurements) were available, it was not possible to predict the individual relapse behavior. Therefore, a 12-months TKI dose reduction simulation was performed for each patient and the resulting BCR-ABL/ABL changes within this period were analyzed. A correlation between the BCR-ABL/ABL increase and the clinical relapse behavior suggested that the BCR-ABL/ABL changes from such system perturbation yields the required information for predictions of the relapse behavior. These simulation results are in qualitative and quantitative agreement with clinical data of the DESTINY trial (NCT01804985). It could be shown that a mathematical CML model is capable of describing the treatment response and relapse behavior of CML patients by incorporation of an immunological control component. Thus, this work supports the results of recent clinical trials which suggest an important role of immune cells for the maintenance of a treatment-free remission. Since a prediction of the individual relapse behavior cannot be obtained from BCR-ABL measurements before stopping treatment, this work highlights the need for further research in this clinical field. Moreover, the results of this work suggest that clinical trials with treatment interventions like a TKI-dose reduction could provide the information required for those predictions.:1. Einleitung und Zielstellung 1.1. Einleitung 1.2. Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit 2. Medizinischer Hintergrund 2.1. Hämatopoese 2.2. Chronische Myeloische Leukämie 2.2.1. Epidemiologie 2.2.2. Ätiologie und Pathogenese 2.2.3. Klinik und Verlauf 2.2.4. Diagnostik 2.2.5. Therapie 2.2.6. Immunologische Einflussfaktoren auf das Rezidivverhalten 3. Systembiologischer Hintergrund 3.1. Statistische Modelle der TKI-Therapie 3.2. Mechanistische Modelle der TKI-Therapie 3.3. Modellierung von Therapie und Absetzverhalten 3.4. Modelle der CML mit einer immunologischen Komponente 4. Material und Methoden 4.1. Klinische Daten 4.1.1. Herkunft der klinischen Daten 4.1.2. Selektion geeigneter Patienten 4.2. Statistische Beschreibung 4.2.1. Bi-exponentielles Modell 4.2.2. Modellanpassung 4.2.3. Statistische Tests 4.3. Mechanistisches Modell 4.3.1. CML-Modell ohne immunologische Komponente 4.3.2. CML-Modell mit immunologischer Komponente (Immunmodell) 4.3.3. Allgemeines Vorgehen zur Modellanpassung 4.3.4. Berechnung der Anfangsbedingungen 4.3.5. Anpassungsstrategien 4.3.6. Sensitivitätsanalysen 4.3.7. Phasenportaits 4.3.8. Regressionsmodelle 4.3.9. Statistische Tests 5. Ergebnisse 5.1. Patientencharakteristika 5.2. Struktureller Vergleich der Patienten mit und ohne Rezidiv 5.3. CML-Modell ohne immunologische Komponente 5.3.1. Aufbau des Modells 5.3.2. Sensitivitätsanalyse 5.3.3. Anpassung an die klinischen Daten 5.4. CML-Modell mit immunologischer Komponente (Immunmodell) 5.4.1. Aufbau des Modells 5.4.2. Anpassung an die klinischen Daten 5.4.3. Klassifizierung der Patienten anhand ihrer Immunantwort 5.4.4. Sensitivitätsanalyse 5.4.5. Einfluss der Therapie auf das Rezidivverhalten 5.4.6. Informationsgewinn durch Simulation einer Dosisreduktion 6. Diskussion 6.1. Diskussion der initial formulierten Fragestellungen 6.2. Kritische Betrachtung der Herangehensweise 6.2.1. Patientenselektion 6.2.2. Modellierung der CMLII 6.3. Ausblick 6.3.1. Erweiterungsmöglichkeiten des verwendeten mathematischen Modells 6.3.2. Unterstützung des Designs klinischer Studien 7. Zusammenfassung 8. Summary A. Anhang A.1. Berechnung des Immunfensters A.2. Berechnung der Attraktoren A.2.1. Heilungs-Attraktor A.2.2. Remissions- und Rezidiv-Attraktor A.3. Abbildungen und Tabellen Literaturverzeichnis

Unter Verwendung eines mathematischen Hämatopoese-Modells werden verschiedene Fragen adressiert, die im Zusammenhang mit einer möglichen Optimierung der gegenwärtigen Therapie chronischer myeloischer Leukämie (CML) stehen. Es handelt sich um ein agentenbasiertes Modell, das heißt, jede Zelle wird als einzelnes Objekt repräsentiert und gemäß festgelegter Regeln im Computer simuliert. Es werden proliferative von ruhenden Stammzellen unterschieden, wobei sich der Proliferationszustand reversibel ändern kann. Das Modell basiert auf der Annahme, dass sich normale und maligne Stammzellen in einem Wettbewerb um gemeinsame Ressourcen befinden, wobei der CML-Klon einen kompetitiven Vorteil besitzt. Es ist ungeklärt, ob Tyrosinkinaseinhibitoren wie Imatinib (IM) in der Lage sind, die Erkrankung zu heilen. Es gibt Evidenz, dass residuale leukämische Stammzellen im Knochenmark persistieren, welche in einem Ruhezustand (G0-Phase des Zellzyklus) von IM nicht eradiziert werden können. Proliferativ aktive Zellen sind der IM-Wirkung hingegen ausgesetzt. Das Modell sagt voraus, unter welchen Bedingungen eine Kombinationsstrategie von IM mit stammzellaktivierenden Substanzen Synergieeffekte hervorbringen könnte. Ein verwandtes Problem ist die Frage, in welchen Fällen nach Reduktion der Tumorlast auf ein mittels hochsensitiver Messmethoden undetektierbares Niveau ein Therapieabbruch gerechtfertigt ist. Basierend auf dem dynamischen Modell wird in dieser Arbeit ein Prädiktor vorgeschlagen, der vorhersagt, ob ein Patient nach Abbruch der Therapie einen molekularen Rückfall zu erwarten hat. Zusätzlich wird approximativ ein modellunabhängiger Prädiktor angegeben, der die Vorhersage nur auf Basis klinisch messbarer Größen gestattet.

Aberrant subcellular localization of mutant transmembrane receptors is increasingly acknowledged as a possible mechanism for an altered signaling quality leading to transformation. There is evidence that mutated receptor tyrosine kinases of subclass III, for example the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) and KIT-protein, are aberrantly localized in human cancers. In order to further analyze this phenomenon, we investigated the localization of FLT3, a subclass III receptor tyrosine kinase frequently mutated in leukemia. By immunofluorescence staining and confocal laser scanning microscopy we found that in retrovirally transduced COS7 cells, wild type FLT3 receptor protein is localized primarily at the cell surface. In contrast, a mutant FLT3 receptor protein with an internal tandem duplication (ITD) accumulates in a perinuclear region and is not detectable at the plasma membrane. Surprisingly, and in contrast to previously published data, intracellular FLT3-ITD accumulation could neither be detected in the endoplasmic reticulum (ER) nor in the Golgi apparatus. Furthermore, transient overexpression per se leads to accumulation of wild type FLT3 receptor protein in the ER in addition to surface localization, probably due to inefficient intracellular transport by the overloaded sorting machinery of the secretory pathway. Based on our data and the immature glycosylation pattern of FLT3-ITD, we speculate that the mutant protein resides most probably in an unidentified compartment of the secretory pathway between the ER and the Golgi apparatus. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.