Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells, which display an extraordinary capacity to induce T-cell responses. Recent findings revealed that DCs also play a crucial role in the activation of natural killer (NK) cells representing important effectors in the innate immune defense against viruses and tumors. Here, we summarize various studies investigating the bidirectional crosstalk between human DCs and NK cells. In this context, it has been reported that DCs efficiently enhance CD69 expression, proliferation, interferon (IFN)-γ secretion and cytotoxic activity of NK cells. Cell membrane-associated molecules as well as soluble factors such as interleukin-12, tumor necrosis factor-α and type I IFNs contributed to DC-mediated NK cell activation. Reciprocally, the ability of human NK cells to enhance the immunostimulatory capacity of DCs was shown. Thus, NK cells promoted the maturation of DCs and markedly augmented their capacity to produce proinflammatory cytokines and to stimulate T-cell responses. The NK cell-mediated effects on DCs were dependent on cell membrane-associated molecules such as NKp30 and soluble factors such as tumor necrosis factor-α and IFN-γ. In conclusion, the reciprocal activating interaction between human DCs and NK cells may play a pivotal role in the immune defense against viruses and tumors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells, which display an extraordinary capacity to induce T-cell responses. Recent findings revealed that DCs also play a crucial role in the activation of natural killer (NK) cells representing important effectors in the innate immune defense against viruses and tumors. Here, we summarize various studies investigating the bidirectional crosstalk between human DCs and NK cells. In this context, it has been reported that DCs efficiently enhance CD69 expression, proliferation, interferon (IFN)-γ secretion and cytotoxic activity of NK cells. Cell membrane-associated molecules as well as soluble factors such as interleukin-12, tumor necrosis factor-α and type I IFNs contributed to DC-mediated NK cell activation. Reciprocally, the ability of human NK cells to enhance the immunostimulatory capacity of DCs was shown. Thus, NK cells promoted the maturation of DCs and markedly augmented their capacity to produce proinflammatory cytokines and to stimulate T-cell responses. The NK cell-mediated effects on DCs were dependent on cell membrane-associated molecules such as NKp30 and soluble factors such as tumor necrosis factor-α and IFN-γ. In conclusion, the reciprocal activating interaction between human DCs and NK cells may play a pivotal role in the immune defense against viruses and tumors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Die Implantation eines linksventrikulären Herzunterstützungssystems (LVADs) hat sich in den letzten Jahren als eine vielversprechende Therapieoption für die terminale Herzinsuffizienz etabliert. Obwohl Infektionen nach LVAD-Implantation eine der häufigsten Komplikationen darstellen, sind die Veränderungen immunologischer Parameter vor und nach LVAD-Implantation unzureichend untersucht. Ein Großteil der Patienten mit LVAD-Implantation leidet unter Adipositas und weist damit zusätzliche Risikofaktoren in Bezug auf die Ausbildung von Komplikationen, insbesondere Infektionen auf. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie untersucht, welche Veränderungen sich in Bezug auf ausgewählte immunologische Zellparameter in Abhängigkeit vom Body-Mass-Index (BMI) im ersten Jahr nach LVAD-Implantation ergeben. Die Patienten wurden anhand ihres BMI zum Zeitpunkt der LVAD-Implantation einer von drei Gruppen (Gruppe A, Normalgewicht: BMI von 18,5-24,9 kg/m2; n = 17; Gruppe B, Präadipositas: 25,0-29,9 kg/m2; n = 24; Gruppe C, Adipositas: ≥ 30,0 kg/m2; n = 27) zugeordnet. Die Gruppen wurden anhand der Erhebung demografischer Daten, vor Implantation bestehender Komorbiditäten, im postoperativen Verlauf auftretender Komplikationen sowie klinischer Laborparameter verglichen. An vier Messzeitpunkten (vor Implantation, 3 Monate, 6 Monate und 12 Monate nach LVAD-Implantation) wurden Vollblut- und Serumproben entnommen. Diese wurden mittels Durchflusszytometrie auf zelluläre Immunzellpopulationen, wie T- und B-Zellen, regulatorische T-Zellen (Tregs), dendritische Zellen (DCs) sowie Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) untersucht. Mittels Multiplex-Analyse wurde das Zytokinprofil analysiert. In der vorliegenden Studie waren die Gruppen in Bezug auf ihre demografischen Daten, vor Implantation bestehender Komorbiditäten und nicht-infektiöser Komplikationen im Verlauf nach LVAD-Implantation vergleichbar. Die Analyse der T-Zellen und ausgewählter T-Zell-Subpopulationen zeigte zum einen eine stärkere Erhöhung der T-Zellen bei präadipösen Patienten, geringere Anteile der CD8+ T-Zellen bei adipösen Patienten ein Jahr nach LVAD-Implantation sowie geringere Anteile von Tregs bei präadipösen Patienten ab sechs Monaten nach LVAD-Implantation. Ein Jahr nach LVAD-Implantation wiesen adipöse Patienten einen höheren Anteil an DCs auf als normalgewichtige und präadipöse Patienten. Eine vertiefende Analyse der Subpopulationen von mDCs und pDCs anhand der BDCA-Oberflächenmoleküle ergab, dass normalgewichtige und präadipöse Patienten im Verlauf des ersten Jahres nach LVAD-Implantation eine Erhöhung der Anteile BDCA1+ und BDCA3+ mDCs aufwiesen. Die Anteile der BDCA4+ pDCs waren bei den präadipösen und adipösen Patienten im Vergleich zu den normalgewichtigen Patienten drei Monate nach LVAD-Implantation reduziert. Es konnten keine Unterschiede der Anteile von NK-Zellen zwischen normalgewichtigen, präadipösen und adipösen Patienten detektiert werden, jedoch zeigte sich bei adipösen LVAD-Patienten im Vergleich zu den Normalgewichtigen zum ersten Messzeitpunkt nach LVAD-Implantation ein erhöhter Anteil der CD56bright NK-Zellen und ein reduzierter Anteil der CD56dim NK-Zellen. Zusammenfassend lässt sich mit dieser Studie ein deutlicher Einfluss des BMI auf immunologische Veränderungen nach LVAD-Implantation nachweisen. Neben den adipösen LVAD-Patienten zeigten auch präadipöse LVAD-Patienten weitreichende Änderungen immunologischer Zellparameter, die NK-Zellen, Tregs, DCs sowie CD4+ und CD8+ T-Zellen betrafen. Die Betrachtung aller nachgewiesenen immunologischen Veränderungen präadipöser und adipöser Patienten deutet auf eine eingeschränkte antivirale und antibakterielle Immunreaktivität und damit auf ein erhöhtes Risikoprofil für Infektionen nach LVAD-Implantation hin.:1. Inhaltsverzeichnis II 2. Abbildungsverzeichnis IV 3. Tabellenverzeichnis VII 4. Abkürzungsverzeichnis IX 5. Einführung 1 5.1 Herzinsuffizienz und linksventrikuläre Herzunterstützungssysteme 1 5.2 Infektionen als Komplikation nach LVAD-Implantation 4 5.3 Immunologische Parameter bei Herzinsuffizienz und nach LVAD-Implantation 6 5.3.1 T-Zellen 6 5.3.2 B-Zellen 8 5.3.3 Dendritische Zellen 9 5.3.4 Natürliche Killerzellen 10 5.3.5 Zytokine 10 5.4 Einfluss einer Adipositas auf das Outcome nach LVAD-Implantation und auf immunologische Parameter 12 6. Aufgabenstellung 14 7. Materialien und Methoden 15 7.1 Studiendesign und Probenentnahme 15 7.2 Probenaufarbeitung 17 7.3 Durchflusszytometrie 17 7.3.1 Messung der Immunzellpopulationen 19 7.3.2 Auswertung der durchflusszytometrischen Daten 22 7.4 Multiplexanalyse 26 7.5 Demografische Datenerhebung 28 7.6 Statistik 28 8 Ergebnisse 29 8.1 Demografische Daten und Komorbiditäten 29 8.2 Medikation im Zeitraum von sechs Wochen vor LVAD-Implantation 31 8.3 Gesundheitlicher Verlauf im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 33 8.3.1 Gesundheitlicher Verlauf ohne Betrachtung eines Infektionsgeschehens 33 8.3.2 Infektionsgeschehen im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 33 8.4 Flussraten des LVADs im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 36 8.5 Vergleich ausgewählter Laborparameter 36 8.5.1 Hämatokrit, Erythrozyten- und Hämoglobinkonzentration 36 8.5.2 Thrombozytenkonzentration 39 8.5.3 Leukozytenkonzentration 40 8.5.4 CRP-Konzentration 40 8.5.5 Quick-Wert und die INR 41 8.6 Durchflusszytometrische Analyse 43 8.6.1 CD3+ T-Zellen 43 8.6.2 CD3+ CD8+ T-Zellen 44 8.6.3 CD3+ CD4+ T-Zellen 46 8.6.4 Regulatorische T-Zellen 49 8.6.5 B-Zellen 50 8.6.6 Zirkulierende DCs 50 8.6.7 Plasmazytoide DCs 51 8.6.8 Myeloide DCs 53 8.6.9 NK-Zellen 55 8.6.10 CD56bright und CD56dim/- NK-Zellen 56 8.7 Analyse der Immunbalance 58 9 Diskussion 60 10 Zusammenfassung der Arbeit 69 11 Literaturverzeichnis 71 12 Anhang 83 13 Selbstständigkeitserklärung 97 15 Danksagung 98

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Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Generierung und Evaluation von Natürlichen Killerzellen, die EGFRvIII-positive und SDF-1alpha sekretierende primäre Glioblastomzellen aufspüren, erkennen und effizient abtöten können. Die Kombination der gelenkten Zytotoxizität mit einer optimierten Migration von Effektorzellen des Immunsystems wird auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Daten als ein vielversprechender Ansatz für eine zukünftige Therapie des primären Glioblastoms vorgeschlagen.

Clinical application of natural killer (NK) cells against leukemia is an area of intense investigation. In human leukocyte antigen-mismatched allogeneic hematopoietic stem cell transplantations (HSCT), alloreactive NK cells exert powerful anti-leukemic activity in preventing relapse in the absence of graft-versus-host disease, particularly in acute myeloid leukemia patients. Adoptive transfer of donor NK cells post-HSCT or in non-transplant scenarios may be superior to the currently widely used unmanipulated donor lymphocyte infusion. This concept could be further improved through transfusion of activated NK cells. Significant progress has been made in good manufacturing practice (GMP)-compliant large-scale production of stimulated effectors. However, inherent limitations remain. These include differing yields and compositions of the end-product due to donor variability and inefficient means for cryopreservation. Moreover, the impact of the various novel activation strategies on NK cell biology and in vivo behavior are barely understood. In contrast, reproduction of the thirdparty NK-92 drug from a cryostored GMP-compliant master cell bank is straightforward and efficient. Safety for the application of this highly cytotoxic cell line was demonstrated in first clinical trials. This novel ‘off-theshelf’ product could become a treatment option for a broad patient population. For specific tumor targeting chimeric-antigen-receptor-engineered NK-92 cells have been designed.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Generierung und Evaluation von Natürlichen Killerzellen, die EGFRvIII-positive und SDF-1alpha sekretierende primäre Glioblastomzellen aufspüren, erkennen und effizient abtöten können. Die Kombination der gelenkten Zytotoxizität mit einer optimierten Migration von Effektorzellen des Immunsystems wird auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Daten als ein vielversprechender Ansatz für eine zukünftige Therapie des primären Glioblastoms vorgeschlagen.

Die genaue Implikation natürlicher Killer(NK)-zellen und Neutrophile in Autoimmunerkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist nach wie vor ungeklärt und wurde daher im Mausmodell der multiplen Sklerose (MS), der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), sowie bei MS und Neuromyelitis optica (NMO) Patienten untersucht. Bei MS Patienten konnte eine mit der Krankheitsaktivität korrelierende, reduzierte Zahl zirkulierender CX3CR1+NK Zellen festgestellt werden. Daher wurden die NK Zell-Dynamiken und der Einfluss von CX3CR1 auf diese im EAE Mausmodell untersucht. Hierbei konnte in Wildtyp(WT) sowie auch CX3CR1-defizienten EAE Mäusen eine Rekrutierung peripherer NK Zellen in das ZNS beobachtet werden. Anders als bei WT EAE Mäusen wiesen die NK Zellen bei CX3CR1-defizienten Mäusen einen primär unreifen Phänotyp auf, der möglicherweise als ursächlich für die erhöhte Krankheitsaktivität dieser Tiere gemutmaßt werden kann. Der Transfer reifer NK Zellen vor Immunisierung CX3CR1-defizienter Tiere zeigte folglich protektive Effekte und lässt schlussfolgern, dass die CX3CR1-vermittelte Rekrutierung reifer NK Zellen die EAE Neuroinflammation limitiert. Die Diskriminierung der MS von der klinisch ähnlichen NMO stellt nach wie vor eine Herausforderung dar. Neutrophile in ZNS-Läsionen und der Cerebrospinalflüssigkeit(CSF) können bei NMO, nicht aber MS Patienten nachgewiesen werden, weshalb Neutrophile aus dem Blut von NMO und MS Patienten hier vergleichend untersucht wurden. Die Neutrophile beider Patientengruppen wiesen einen aktivierten Phänotyp im Vergleich zu gesunden Kontrollen auf. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine von Medikation und neurologischen Defiziten der Patienten unabhängige, kompromittierte Funktionalität der NMO verglichen mit MS Neutrophilen im Hinblick auf Migration, oxidativen Burst und Degranulierung. Die Neutrophilenfunktionalität könnte entsprechend potentiell als diagnostisches Diskriminierungskriterium zwischen der MS und der NMO dienen. / The implication of natural killer (NK) cells and neutrophils in autoimmune disorders of the central nervous system (CNS) remains elusive, and therefore was investigated in a mouse model for multiple sclerosis (MS), experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), and in patients with MS and neuromyelitis optica (NMO), respectively. In MS, a decreased frequency of circulating CX3CR1+NK cells correlating with the patient disease activity has been reported. Therefore, the pattern of NK cell mobilization and the contribution of CX3CR1 to NK cell dynamics in response to neuroinflammatory insult were investigated in the EAE model. Here, NK cells similarly mobilized from the periphery and accumulated in the CNS in both wild-type (WT) and CX3CR1-deficient mice during EAE. However, in mice lacking CX3CR1 the infiltrated NK cells displayed an immature phenotype contrasting with the mature infiltrates in the WT counterparts, apparently contributing to EAE exacerbation in those animals since transfer of mature WT NK cells prior to immunization of CX3CR1-deficient mice exerted a protective effect. Together, these data suggest that the CX3CR1-mediated recruitment of mature CX3CR1+NK cells limits EAE neuroinflammation. Due to clinical similarities, the discrimination between MS and NMO is still challenging. In contrast to MS, neutrophil accumulations were found in CNS lesions and the cerebrospinal fluid (CSF) of NMO patients wherefore a comparative analysis of peripheral blood neutrophils in NMO and MS patients was performed. The results revealed an activated neutrophil phenotype in NMO and MS when compared to healthy individuals. In contrast, analysis of neutrophil migration, oxidative burst activity and degranulation showed a compromised neutrophil functionality in NMO compared to MS, which was not influenced by the treatment regime and clinical parameters of the patients. Thus, neutrophil functionality may represent a new diagnostic tool to discriminate between NMO and MS.

Die spezifische adoptive Immuntherapie ist ein hoffnungsvoller Ansatz zur Behandlung von Tumoren. Die aufwendige individuelle Bereitstellung primärer Effektorlymphozyten könnte durch den Einsatz etablierter tumorantigenspezifischer Effektorzellinien vermieden werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich ein Tumortargeting der humanen Natürlichen Killer-(NK)-Zellinie YT durch den Gentransfer chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren (cIgTCRs) erreichen läßt. Die cIgTCR-Konstrukte wurden aus single-chain-Fv-Fragmenten (scFv), dem IgG1-Fc-Teil und der CD3-Zeta-Signalkette erzeugt. Die scFv-Fragmente wurden aus den humanisierten Antikörpern BW431/26 und HuM195, die spezifisch für das karzinoembryonale Antigen (CEA) bzw. CD33 sind, konstruiert und zeigten als scFv-hFc-Fusionsproteine eine spezifische Bindung an Tumorzellen. Die YT-Zellen wurden mit den cIgTCR-Genkonstrukten über Elektroporation transfiziert und über immunologische Verfahren angereichert. In-vitro-Studien ergaben eine spezifische Lyse von CEA+ Kolonkarzinomzellinien durch die scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen. Die Zytotoxizität korrelierte mit der Expression des cIgTCR-Antigens auf den Tumorzellen und wurde durch zirkulierendes CEA nicht gehemmt. Die scHuM195-hFcZeta+ YT-Zellen zeigten eine spezifische Lyse der CD33+ myeloischen Leukämiezellinie KG1. Die Bestrahlung wurde zur Wachstumsbegrenzung der YT-Zellen eingesetzt. Die spezifische Zytotoxizität der scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen gegenüber CEA+ Tumorzellen war einen Tag nach Bestrahlung unverändert. Die Koinjektion von CEA+ Tumorzellen mit bestrahlten scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums in NOD/SCID-Mäusen. Die cIgTCR+ YT-Zellen zeigten in vitro eine geringe Sensibilität gegenüber allogenen Blutlymphozyten. Die Ergebnisse zeigen, daß die Zytotoxizität der NK-Zellinie YT tumorantigenspezifisch durch cIgTCR-Gentransfer erweitert wird und ein Potential zur Behandlung minimaler Tumorerkrankungen besteht. / The specific adoptive immunotherapy is a promising strategy for cancer treatment. The utilization of established tumor antigen specific effector cell lines could bypass the expendable individual preparation and often limited specificity of primary effector lymphocytes. This study investigated the tumor targeting of the human Natural Killer (NK) cell line YT by gene transfer of chimeric immunoglobulin T cell receptors (cIgTCRs). The cIgTCR constructs were generated of single chain antibody fragments (scFv), the IgG1 Fc part and the CD3 Zeta chain. The scFv fragments were constructed of the humanized antibodies BW431/26 and HuM195 with specificity for the carcinoembryonic antigen (CEA) and CD33, respectively, and showed as scFv-Fc fusion proteins a specific binding to tumor cells. YT cells were transfected with the cIgTCR gene constructs by electroporation and enriched by immunological cell separation. In vitro studies revealed a specific lysis of CEA+ colon carcinoma cell lines by scBW431/26-hFcZeta+ YT cells. The cytotoxicity correlated with the expression of the cIgTCR antigen on the tumor cells and was not inhibited in the presence of soluble CEA. The scHuM195-hFcZeta+ YT cells mediated a specific lysis of the CD33+ myeloic leukemia cell line KG1. The irradiation was used to limit the growth of the YT cell line. The specific cytotoxicity of the scBW431/26-hFcZeta+ YT cells against CEA+ tumor cells was unaltered one day after irradiation. The coinjection of CEA+ tumor cells and irradiated scBW431/26-hFcZeta+ YT cells led to a significant growth inhibition in NOD/SCID mice. The cIgTCR+ YT cells showed a low susceptibility to the cytotoxicity of allogeneic blood lymphocytes in vitro. The results demonstrated that the cytotoxicity of the human NK cell line YT can be specifically extended to tumor antigens by cIgTCR gene transfer. The employment of receptor gene modified YT cells could be a useful tool for the adoptive immunotherapy of minimal tumor diseases.

Nierenzellkarzinome (NZKs) gelten als stark immunogene Tumore. Dies ist insbesondere auf die Infiltration durch verschiedene Immunzellpopulationen, wie T-Lymphozyten und Natürliche Killer (NK)-Zellen, sowie das klinische Ansprechen auf immuntherapeutische Strategien zurückzuführen. Bisher existieren jedoch nur sehr wenige Studien zur Rolle von humanen nativen dendritischen Zellen (DCs) in NZK-Geweben und über die Tumor-vermittelte Modulation dieser DCs. DCs nehmen als professionelle Antigen-präsentierende Zellen eine zentrale Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der angeborenen sowie adaptiven Immunantwort ein. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der Effekt von klarzelligen NZKs auf den Phänotyp sowie die immunmodulatorischen Fähigkeiten von 6-sulfo LacNAc+ (slan)DCs evaluiert. SlanDCs, welche eine große Subpopulation humaner Blut-DCs darstellen, sind neben der Sekretion großer Mengen proinflammatorischer Zytokine dazu befähigt, Tumorzellen direkt zu lysieren. Des Weiteren sind slanDCs in der Lage, die antitumoralen Effekte von NK-Zellen zu fördern und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie Tumor-reaktive CD8+ T-Lymphozyten effizient zu stimulieren. Angesichts dieser proinflammatorischen Eigenschaften können slanDCs wesentlich an einer Tumor-gerichteten Immunantwort beteiligt sein. Auf dieser Grundlage erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der immunhistochemische Nachweis von slanDCs in klarzelligen NZK-Geweben. Im Vergleich zu Tumor-freiem Nierengewebe trat in den primären Tumorgeweben eine erhöhte Zahl infiltrierender slanDCs auf. Zudem wurde die Präsenz von slanDCs in Lymphknoten- sowie Fernmetastasen von NZK-Patienten beobachtet. Weiterführende Untersuchungen an frischen klarzelligen NZK-Geweben demonstrierten, dass NZK-infiltrierende slanDCs einen unreifen Phänotyp ausprägen und Interleukin-10 produzieren. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten funktionelle Analysen, bei denen der Einfluss der kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1 sowie der primären klarzelligen NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC auf bedeutende immunmodulatorische Fähigkeiten von slanDCs untersucht wurde. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass NZK-Zellen effektiv in der Lage sind, sowohl die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, als auch die slanDC-induzierte Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten in proinflammatorische T-Helfer 1-Zellen zu inhibieren. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass NZK-Zellen das Potenzial von slanDCs zur Aktivierung von NK-Zellen hemmen. Untersuchungen der zugrunde liegenden Mechanismen zeigten, dass die funktionelle Inhibition von slanDCs durch klarzellige NZK-Zellen über membranständige Moleküle vermittelt wird. Die im Rahmen dieser Dissertation gewonnenen Erkenntnisse weisen darauf hin, dass NZKs die Ausreifung sowie wesentliche funktionelle Eigenschaften von DCs inhibieren. Dies deutet auf einen neuen Immunescape-Mechanismus klarzelliger NZKs hin, welcher auf einer Tumorzell-vermittelten Generierung von tolerogenen slanDCs basiert und eine unzureichende Aktivierung der angeborenen sowie adaptiven Tumor-gerichteten Immunantwort zur Folge hat. Diese neuen Erkenntnisse können einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Interaktion von NZKs mit nativen humanen DCs leisten und die Konzeption neuer therapeutischer Strategien ermöglichen, welche auf einer Verstärkung der antitumoralen Eigenschaften von DCs beruhen.