Les cellules T ɑβ conventionnelles expriment des récepteurs antigéniques qui peuvent reconnaître et répondre à une grande variété d’agents pathogènes. En parallèle, des mécanismes cruciaux sont en place pour empêcher les cellules T de réagir aux auto-antigènes afin de prévenir le développement d’auto-immunité. Dans le but d’assurer la génération d’un réservoir de cellules T fonctionnelles, diverses et tolérantes au soi, les récepteurs des cellules T (TCR) ɑβ appropriés sont sélectionnés dans le thymus en fonction de la quantité et de la qualité des interactions avec les peptides du soi présentés par le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) sur les cellules présentatrice d’antigènes (CPA). Chez les nouveau-nés, des mécanismes intrinsèques et extrinsèques aux cellules influencent les interactions entre le TCR et le complexe CMH-peptide du soi, résultant en un répertoire de cellules T qui possèdent des propriétés distinctes par rapport à leurs homologues adultes. Par ailleurs, les souris diabétiques non-obèses (NOD), qui ont des cellules T auto-réactives qui attaquent les cellules β du pancréas, responsables de la production d’insuline, sont porteuses de polymorphismes génétiques qui peuvent influencer la sélection thymique. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que des facteurs intrinsèques et extrinsèques aux cellules modulent la sélection thymique tout au long de la vie et peuvent ultimement contribuer à la fonction et au dysfonctionnement de cellules T effectrices. La force globale de la signalisation TCR perçue lors du développement des lymphocytes T peut être mesurée en évaluant le niveau d’expression de différentes molécules, telles que CD5. Nous avons découvert que, tant chez la souris que l’humain, le répertoire des cellules T néonatales est composé de cellules T exprimant des niveaux plus élevés de CD5 que ceux des adultes. Cette augmentation des niveaux d’expression de CD5 n’est pas due à des défauts de tolérance centrale. En fait, nous avons plutôt démontré que les thymocytes exprimant un TCR de faible affinité pour les antigènes du soi ne sont pas sélectionnés efficacement chez les nouveau-nés et donc ne font pas partie du répertoire des cellules T néonatales, alors que ces thymocytes se développent adéquatement chez les adultes. Cette modification dans les seuils de sélection thymique biaise le niveau basal d’auto-réactivité du répertoire de cellules T néonatales et pourrait expliquer en partie les différences de réponse aux infections observées entre les nouveau-nés et les adultes. En comparant les niveaux de CD5 sur les thymocytes et les cellules T périphériques de souris NOD, prédisposées au diabète, avec ceux de souris C57BL/6 (B6), résistantes au développement du diabète auto-immun, nous avons découvert que les populations de cellules T des souris NOD ne perçoivent pas nécessairement des signaux TCR plus forts lorsqu’ils interagissent avec des antigènes du soi. Au contraire, une plus grande proportion de cellules T CD4+ et régulatrices avec un plus faible niveau de CD5 se différencient chez les souris NOD. Ce phénotype est fortement dépendant du locus du CMH des souris NOD. En revanche, les niveaux de CD5 sur les cellules T CD8+ périphériques des souris NOD sont plus élevés que ceux des souris B6, en raison d’un biais de survie intrinsèque aux cellules. Ces différences en niveau d’expression de CD5 sur le répertoire de cellules T des souris NOD ont des conséquences fonctionnelles directes et pourraient contribuer au développement ou à la progression du diabète auto-immun. Enfin, nous avons évalué si la sélection thymique était modulée par une molécule de co-signalisation, le co-stimulateur inductible de cellules T (ICOS). ICOS appartient à la famille des molécules de co-signalisation de type CD28 et se lie au ligand de ICOS (ICOSL). Alors que d’autres molécules de co-signalisation ont été démontré comme étant impliquées dans la tolérance centrale, le rôle joué par ICOS n’est pas clair. Nous avons démontré que ICOSL est exprimé par une variété de CPA thymiques importantes dans l’induction de la tolérance centrale et que ICOS est exprimé à la hausse durant la sélection thymique, en fonction de la force du signal TCR perçue par les thymocytes. Nous fournissons également, pour la première fois, une preuve que la voie ICOS-ICOSL pourrait avoir un rôle dans la régulation fine de la sélection négative. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse démontrent que la sélection thymique être altérés dans le contexte de l’ontogénie et du diabète auto-immun, conduisant au développement de cellules T avec une auto-réactivité basale relativement plus élevée ou plus faible en comparaison aux animaux adultes en bonne santé. Ces modulations pourraient avoir des conséquences importantes sur la fonction immunitaire et doivent être considérées pour le développement de futurs vaccins ou approches thérapeutiques chez ces populations. / Conventional ɑβ T cells express antigen receptors that can recognize and respond to a wide range of foreign pathogens. In parallel, critical mechanisms are in place to prevent T cells from reacting to self-antigens causing autoimmunity. To ensure the generation of a functional, diverse yet self-tolerant T cell pool, appropriate ɑβ T cell receptors (TCR) are selected in the thymus based on the quality and quantity of their interactions with self-peptides presented by the major histocompatibility complex (MHC) on thymic antigen presenting cells (APC). In neonates, cell-intrinsic and -extrinsic mechanisms influence TCR and self-peptide-MHC interactions resulting in a T cell pool that exhibits distinct functions as compared to their adult counterparts. Similarly, non-obese diabetic (NOD) mice, which contain autoreactive T cells that attack insulin-producing pancreatic β cells, carry genetic polymorphisms that can influence thymic selection. Therefore, we hypothesized that cell-intrinsic and -extrinsic factors modulate thymic selection throughout life and may ultimately contribute to the function and dysfunction of effector T cells. The overall perceived strength of TCR signaling during T cell development can be measured by several molecules, including CD5. We found that, in both mice and humans, the neonatal T cell pool is composed of T cells with higher CD5 levels than their adult counterparts. The increased CD5 levels are not due to defects in central tolerance. Instead, we demonstrated that thymic selection is altered in neonates. Thymocytes expressing a TCR with low affinity to self-antigen that develop in adults are not efficiently selected into the neonatal T cell pool. This shift in thymic selection thresholds skews the basal self-reactivity of the neonatal T cell repertoire and may explain, in part, differences in the neonatal versus adult response to infections. By comparing CD5 levels on thymocytes and peripheral T cells from diabetes-prone NOD mice with those from autoimmune-resistant C57BL/6 (B6) mice, we found that T cell populations in NOD mice do not necessarily perceive stronger TCR signals when interacting with self-antigens. Rather, NOD mice allow the differentiation of more CD4+ T cells and thymic Tregs with lower CD5 levels. This phenotype is strongly dependent on the NOD MHC locus. In contrast, CD5 levels on peripheral NOD CD8+ T cells are higher than those in the B6 mice that is likely due to a cell-intrinsic survival bias. These differences in CD5 levels in the NOD T cell pool have direct functional consequences and may contribute to the development or progression of autoimmune diabetes. Lastly, we investigated whether thymic selection is modulated by the co-signaling molecule, inducible T cell costimulator (ICOS). ICOS belongs to the CD28 family of co-signaling molecules and binds to the ICOS ligand (ICOSL). While other co-signaling molecules have been implicated in central tolerance, the role played by ICOS is unclear. We demonstrated that ICOSL is expressed by an array of thymic APCs important for central tolerance induction, and that ICOS is upregulated during thymic selection relative to the strength of TCR signaling the thymocytes perceive. We also provide, for the first time, evidence that the ICOS-ICOSL pathway may fine-tune negative selection. In conclusion, the results presented in this thesis demonstrate that thymic selection appears to be altered within the context of ontogeny and autoimmune diabetes, leading to the development of T cells with relatively higher or lower basal self-reactivity as compared to healthy adult animals. These modulations may have significant consequences on immune function and require careful consideration for future vaccination and therapeutic approaches within these populations.

This final year thesis introduces the principles and properties of the artificial immune systems to the reader, then abstracts the principles from this knowledge and applies the real artificial immune systems on them. It provides a view at the practical applications that use and extend given ideas.

Le genre bactérien Salmonella regroupe plus de 2500 sérovars, mais peu sont responsables de pathologies humaines. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est reconnu pour son importance médicale à travers le globe. S. Typhi cause la fièvre typhoïde chez l’Homme, une maladie infectieuse létale caractérisée par la dissémination systémique de la bactérie vers des organes du système réticulo-endothélial. La fièvre typhoïde représente un fardeau pour la santé mondiale, notamment auprès des pays en développement où les conditions sanitaires sont désuètes. La situation se complique davantage par l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques. De plus, les deux vaccins licenciés sont d’efficacité modérée, présentent certaines contraintes techniques et ne sont pas appropriés pour les jeunes enfants et nourrissons. La phase systémique de l’infection par Salmonella repose sur sa survie dans les macrophages du système immunitaire. Dans ce compartiment intracellulaire, la bactérie module les défenses antimicrobiennes grâce à de multiples facteurs de virulence encodés dans son génome. Les mécanismes moléculaires sollicités sont complexes et finement régulés. Malgré les progrès scientifiques réalisés précédemment, plusieurs incompréhensions persistent au sujet de l’adaptation de ce pathogène dans les macrophages de l’hôte. Pour mieux concevoir les déterminants génétiques de S. Typhi impliqués dans l’interaction avec ces cellules, une stratégie de sélection négative a été appliquée afin de vérifier systématiquement l’effet direct des gènes pendant l’infection. En premier temps, une librairie de mutants par transposon chez S. Typhi a été créée pour l’infection de macrophages humains en culture. Après 24 heures d’infection, la présence des mutants fut évaluée simultanément par analyse sur des biopuces de Salmonella. Au total, 130 gènes ont été sélectionnés pour leur contribution potentielle auprès des macrophages infectés. Ces gènes comptaient des composantes d’enveloppe bactérienne, des éléments fimbriaires, des portions du flagelle, des régulateurs, des facteurs de pathogenèse et plusieurs protéines sans fonction connue. En deuxième temps, cette collection de gènes a dirigé la création de 28 mutants de délétion définie chez S. Typhi. Les capacités d’entrée et de réplication intracellulaire de ces mutants au sein des macrophages humains ont été caractérisées. D’abord, les macrophages ont été co-infectés avec les mutants en présence de la souche sauvage, pour vérifier la compétitivité de chacun d’eux envers cette dernière. Ensuite, les mutants ont été inoculés individuellement chez les macrophages et leur infectivité fut mesurée comparativement à celle de la souche sauvage. Sommairement, 26 mutants ont présenté des défauts lorsqu’en compétition, tandis que 14 mutants se sont montrés défectueux lorsque testés seuls. Par ailleurs, 12 mutants ont exposé une déficience lors de l’infection mixte et individuelle, incluant les mutants acrA, exbDB, flhCD, fliC, gppA, mlc, pgtE, typA, waaQGP, STY1867-68, STY2346 et SPI-4. Notamment, 35 nouveaux phénotypes défectueux d’entrée ou de survie intracellulaire chez Salmonella ont été révélés par cette étude. Les données générées ici offrent plusieurs nouvelles pistes pour élucider comment S. Typhi manipule sa niche intracellulaire, menant à l’infection systémique. Les gènes décrits représentent des cibles potentielles pour atténuer la bactérie chez l’humain et pourraient contribuer au développement de meilleures souches vaccinales pour immuniser contre la fièvre typhoïde. / The bacterial genus Salmonella holds over 2500 serovars, but few are responsible for human pathologies. Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) is recognized across the globe for its medical importance. S. Typhi causes typhoid fever in humans, a lethal infectious disease characterized by systemic dissemination of the bacteria to organs of the reticulo-endothelial system. Typhoid fever represents a burden for public health, notably in developing countries where sanitary conditions are obsolete. The situation is further complicated by the appearance of strains resistant to antibiotics. Moreover, both of the licensed vaccines are of moderate efficiency, present certain technical constraints and are not appropriate for young children and newborns. The systemic phase of infection by Salmonella relies on its survival within macrophages of the immune system. In this intracellular compartment, the bacterium modulates antimicrobial defenses thanks to multiple virulence factors encoded within its genome. Molecular mechanisms taking place are complex and finely regulated. Despite scientific advances made previously, many misunderstandings persist concerning the adaptation of this pathogen within host macrophages. To better conceive the genetic determinants of S. Typhi involved in interaction with these cells, a negative selection strategy was applied to systematically verify the direct effect of genes during infection. Firstly, a library of transposon insertion mutants in S. Typhi was created for infection of cultured human macrophages. After 24 hours of infection, the presence of mutants was evaluated simultaneously by analysis on Salmonella microarrays. In total, 130 genes were selected for their potential contribution within infected macrophages. These genes included bacterial envelope components, fimbrial elements, portions of the flagellum, regulators, pathogenesis factors, and many proteins of unknown function. Secondly, this collection of genes led to the creation of 28 defined deletion mutants in S. Typhi. The ability of entry and intracellular replication of these mutants within human macrophages were characterized. To start, macrophages were coinfected with mutants in the presence of the wild-type strain, in order to verify the competitiveness of each of them against the latter. Then, mutants were inoculated individually into macrophages and their infectiveness was measured in comparison with the wild-type strain. In summary, 26 mutants presented defects when in competition, whereas 14 mutants were shown defective when tested alone. Furthermore, 12 mutants exposed a deficiency during mixed and individual infection experiments, including mutants acrA, exbDB, flhCD, fliC, gppA, mlc, pgtE, typA, waaQGP, STY1867-68, STY2346, and SPI-4. In particular, 35 new defective phenotypes of Salmonella entry or intracellular survival were revealed in this study. Data generated here provides significant novel insight for elucidating how S. Typhi manipulates its intracellular niche, leading to systemic infection. Genes described represent potential targets for attenuating the bacteria in the human host and could contribute to the development of better vaccine strains to immunize against typhoid fever.

Multipotent mesenchymal stem cells (MSCs), found in many adult tissues, may be useful for regenerative medicine applications. Their identification and purification have been difficult due to their low frequency and lack of unambiguous markers. Using a magnetic micro-beads negative selection technique to remove contaminating hematopoietic cells from mouse bone marrow stromal cells (BMSCs), our lab recently isolated a highly purified osteoprogenitor (HipOp) population that was also enriched for other mesenchymal precursors, including MSCs (Itoh and Aubin, 2009). To further enhance enrichment, we positively selected BMSCs and HipOps for CD73, a putative MSC marker, which resulted in no significant additional enrichment for osteoprogenitors when the population was tested in vitro. However, we also found that HipOps were enriched in vascular endothelial cells, and that removing these cells by further negative selection with CD31/PECAM resulted in a CD31(-) HipOp population with higher osteogenic capacity than HipOps in vitro and in vivo.

Multipotent mesenchymal stem cells (MSCs), found in many adult tissues, may be useful for regenerative medicine applications. Their identification and purification have been difficult due to their low frequency and lack of unambiguous markers. Using a magnetic micro-beads negative selection technique to remove contaminating hematopoietic cells from mouse bone marrow stromal cells (BMSCs), our lab recently isolated a highly purified osteoprogenitor (HipOp) population that was also enriched for other mesenchymal precursors, including MSCs (Itoh and Aubin, 2009). To further enhance enrichment, we positively selected BMSCs and HipOps for CD73, a putative MSC marker, which resulted in no significant additional enrichment for osteoprogenitors when the population was tested in vitro. However, we also found that HipOps were enriched in vascular endothelial cells, and that removing these cells by further negative selection with CD31/PECAM resulted in a CD31(-) HipOp population with higher osteogenic capacity than HipOps in vitro and in vivo.

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Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices. / Proteins are the end-products of gene interpretative machinery. Proteins serve essential roles in defining the structure, integrity and dynamics of the cell and mediate most chemical transformations needed for everything from metabolic catalysis to signal transduction. We know that the central dogma of molecular biology, one gene = one mRNA = one protein is a gross simplification and that a protein may do different things depending on the form in which its mRNA was spliced, how and where it is post-translationally modified, what conformational state it may be in or finally, which other proteins it may interact with. Formation of protein complexes may, themselves, be governed by the states in which proteins are expressed in specific cells, cellular compartments or under specific conditions or dynamic phases such has growth or division. Protein complexes involved in mitotic cell cycle regulation are particularly challenging to dissect since they could only form during specific phases of the cell cycle, are highly regulated by post-translational modifications and can be found in any subcellular compartments. To date, no general methods have been developed to allow fine dissection of these protein complexes. The goal of this thesis was to establish and demonstrate a novel strategy for dissecting protein complexes regulating the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) mitotic cell cycle. In this thesis, I describe my development and optimization of a simple survival-selection Protein-fragment Complementation Assay using the prodrug-converting enzyme, yeast cytosine deaminase as reporter (OyCD PCA). I further describe, in a series of proof of principle studies, applications of the OyCD PCA to dissect the mechanism of transcriptional activation by key mitotic transcription factors and to dissect protein-protein interactions (PPIs) among regulators of the mitotic cell cycle. A key feature of the OyCD PCA is that it can be used to detect both formation and disruption of PPIs by virtue of having positive readouts for both assays. I applied the OyCD PCA in a strategy to dissect interactions between the key transcription factors of the G1/S phase: SBF and MBF. These two heterodimeric transcription factors are composed of, respectively, two distinct DNA-binding subunits named Swi4 and Mbp1 and a common transcription activation subunit called Swi6. I took advantage of the dual selection by OyCD PCA to engineer a specific mutant of Swi6 in order to demonstrate the rewiring of a transcriptional network. We isolated Swi6 with mutations found in its C-terminal domain previously identified for binding Swi4 and Mbp1 and important for SBF and MBF activities. Our results support a model where Swi6 undergoes a conformational change upon binding to Swi4 or Mbp1. In addition, this Swi6 mutant was used to dissect the regulatory mechanism that governs the entry of S. cerevisiae to a new round of cell division also known as START. We found that the SBF and MBF repressor Whi5 directly binds to the C-terminal domain of Swi6. Finally, I applied the OyCD PCA to dissect the yeast cyclin dependent kinase Cdk1-protein complexes. Cdk1 is the essential kinase that regulates cell cycle progression and can phosphorylate a large number of different substrates by teaming up with one of nine cyclin regulatory proteins (Cln1-3, Clb1-6). I describe a strategy to identify interaction partners of Cdk1 that can easily be scaled up for a genome-wide screen and associate the complexes with the appropriate cyclin(s) required for mediating the interaction using the OyCD PCA and deletion of the cyclin genes. My results allow us to postulate which phase(s) of the mitotic cell cycle Cdk1 may phosphorylate proteins and what function potential or known substrates of Cdk1 may take on during that phase(s). For example, we identified the interaction between Cdk1 and the γ-tubulin (Tub4) to be dependent upon Clb3, consistent with its role in mediating nucleation and growth of mitotic microtubule bundles on the spindle pole body. This strategy can also be applied to study other PPIs that are contingent upon accessory subunits.

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices. / Proteins are the end-products of gene interpretative machinery. Proteins serve essential roles in defining the structure, integrity and dynamics of the cell and mediate most chemical transformations needed for everything from metabolic catalysis to signal transduction. We know that the central dogma of molecular biology, one gene = one mRNA = one protein is a gross simplification and that a protein may do different things depending on the form in which its mRNA was spliced, how and where it is post-translationally modified, what conformational state it may be in or finally, which other proteins it may interact with. Formation of protein complexes may, themselves, be governed by the states in which proteins are expressed in specific cells, cellular compartments or under specific conditions or dynamic phases such has growth or division. Protein complexes involved in mitotic cell cycle regulation are particularly challenging to dissect since they could only form during specific phases of the cell cycle, are highly regulated by post-translational modifications and can be found in any subcellular compartments. To date, no general methods have been developed to allow fine dissection of these protein complexes. The goal of this thesis was to establish and demonstrate a novel strategy for dissecting protein complexes regulating the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) mitotic cell cycle. In this thesis, I describe my development and optimization of a simple survival-selection Protein-fragment Complementation Assay using the prodrug-converting enzyme, yeast cytosine deaminase as reporter (OyCD PCA). I further describe, in a series of proof of principle studies, applications of the OyCD PCA to dissect the mechanism of transcriptional activation by key mitotic transcription factors and to dissect protein-protein interactions (PPIs) among regulators of the mitotic cell cycle. A key feature of the OyCD PCA is that it can be used to detect both formation and disruption of PPIs by virtue of having positive readouts for both assays. I applied the OyCD PCA in a strategy to dissect interactions between the key transcription factors of the G1/S phase: SBF and MBF. These two heterodimeric transcription factors are composed of, respectively, two distinct DNA-binding subunits named Swi4 and Mbp1 and a common transcription activation subunit called Swi6. I took advantage of the dual selection by OyCD PCA to engineer a specific mutant of Swi6 in order to demonstrate the rewiring of a transcriptional network. We isolated Swi6 with mutations found in its C-terminal domain previously identified for binding Swi4 and Mbp1 and important for SBF and MBF activities. Our results support a model where Swi6 undergoes a conformational change upon binding to Swi4 or Mbp1. In addition, this Swi6 mutant was used to dissect the regulatory mechanism that governs the entry of S. cerevisiae to a new round of cell division also known as START. We found that the SBF and MBF repressor Whi5 directly binds to the C-terminal domain of Swi6. Finally, I applied the OyCD PCA to dissect the yeast cyclin dependent kinase Cdk1-protein complexes. Cdk1 is the essential kinase that regulates cell cycle progression and can phosphorylate a large number of different substrates by teaming up with one of nine cyclin regulatory proteins (Cln1-3, Clb1-6). I describe a strategy to identify interaction partners of Cdk1 that can easily be scaled up for a genome-wide screen and associate the complexes with the appropriate cyclin(s) required for mediating the interaction using the OyCD PCA and deletion of the cyclin genes. My results allow us to postulate which phase(s) of the mitotic cell cycle Cdk1 may phosphorylate proteins and what function potential or known substrates of Cdk1 may take on during that phase(s). For example, we identified the interaction between Cdk1 and the γ-tubulin (Tub4) to be dependent upon Clb3, consistent with its role in mediating nucleation and growth of mitotic microtubule bundles on the spindle pole body. This strategy can also be applied to study other PPIs that are contingent upon accessory subunits.