O presente estudo teve por objetivos caracterizar os vírus Influenza circulantes na cidade de São Paulo e verificar a variabilidade genética do gene da neuraminidase (NA) dos Influenzavírus A. Um total de 3009 amostras de crianças internadas no Hospital Universitário da USP, no período de 1995 a 2006, foram submetidas à duplex RT-PCR para detecção dos Influenzavírus A e B (IA e IB). As amostras positivas para IA foram submetidas à subtipagem pela multiplex RT-PCR. Cento e trinta e três amostras (4,4%) foram positivas, sendo 88,0% (117/133) IA e 12,0% (16/133) IB. Entre as amostras IA, 94 eram H3N2, 7 H1N1 e 16 não foram subtipadas pela multiplex. Um total de 74 amostras (71 H3N2 e 3 H1N1) tiveram o gene da neuraminidase sequenciado (total ou parcialmente). As sequências obtidas foram submetidas à análise filogenética, sendo verificado o agrupamento das cepas circulantes em clusters por ano de isolamento, demonstrando sua evolução temporal. Quando comparadas com as cepas vacinais utilizadas no período, foi verificada uma boa similaridade. / The aim of this study was to characterize Influenza virus circulating in São Paulo city and the neuraminidase (NA) gene sequence of Influenzavirus A in 3009 samples from children hospitalized at USP University Hospital, from 1995 to 2006. Samples underwent duplex RT-PCR for detection and typing of Influenza virus A and B (IA and IB) and also were submitted to multiplex PCR for subtyping of IA. Among 3009 samples, 4.4% were Influenza virus, being 88.0% IA (117/133) and 12.0% IB (16/133). Among samples of IA, 94 were characterized as H3N2, 7 H1N1 and 16 were not subtyped. A total of 74 samples (71 H3N2 and 3 H1N1) had the NA gene sequenced (total or partially). Sequences obtained were compared to sequences of the world and sequences of vaccine strains. Brazilian samples were grouped in clusters with samples isolated in the same year. It was also found a good similarity between circulating strains and vaccine strains.

A neuraminidase 1 (Neu1) é a enzima que regula o catabolismo de sialoglicoconjugados nos lisossomos. A deficiência da Neu1 é a base da sialidose, doença grave associada a um amplo espectro de manifestações, incluindo hipotonia e fraqueza muscular. Camundongos com deficiência de Neu1 desenvolvem degeneração muscular caracterizada principalmente por atrofia, invasão das fibras musculares por fibroblastos e expansão da matriz extracelular. A Neu1 controla a proliferação de fibroblastos de pacientes por meio da desialilação dos receptores de PDGF e IGF. Além disso, há enzimas lisossomais que são moduladas pela Neu1, tais como as catepsinas, que são capazes de degradar componentes musculares e estariam excessivamente ou erroneamente ativas (sialiladas) em decorrência da deficiência de Neu1. O objetivo deste trabalho foi identificar se o fenótipo da musculatura esquelética de camundongos Neu1-/- poderia estar associado à atividade do IGF-1R, PDGFR e/ou à sialilação de catepsina B, através da análise histológica e proteica de músculos esqueléticos e fibroblastos de camundongos Neu1+/+ e Neu1-/- tratados com inibidores de IGF1-R e PDGFR. O estudo da expressão proteica de catepsina B foi realizado nos músculos tratados com os inibidores de IGF-1R e PDGFR, e nas frações citosólica e lisossomal de fibroblastos tratados com neuraminidase exógena. Em comparação com camundongos Neu1+/+, os músculos de animais Neu1-/- apresentam menor área de fibra, peso corporal, expressão de pAkt e maior expressão de catepsina B; e os fibroblastos Neu1-/- exibem maior proliferação e expressão de pAkt. A inibição do IGF-1R em camundongos Neu1-/- aumentou a área das fibras musculares, expressão de pAKt e diminuiu a expressão de catepsina B; em relação aos fibroblastos Neu1-/-, entretanto aumentou a proliferação celular com diminuição de pAkt. A inibição do PDGFR em músculos de camundongos Neu1-/- levou ao aumento da expressão de pAkt, da área das fibras, com diminuição de pERK e catepsina L, quando comparados com os controles Neu1-/-; a mesma inibição in vitro conduziu à diminuição da expressão de pAkt, pERK e proliferação. A catepsina B encontra-se bastante ativa na fração lisossomal e o tratamento com neuraminidase foi eficaz na correção de seu peso molecular e compartimentalização lisossomal. De forma geral, o fenótipo muscular de camundongos Neu1-/- parece estar relacionado com a atividade de IGF-1R e PDGFR, e a catepsina B hipersialilada é potencialmente deletéria para o músculo esquelético / Neuraminidase 1 (Neu1) is an enzyme that regulates the catabolism of sialoglycoconjugates in lysosomes. Neu1 deficiency is the basis of sialidosis, a severe disease associated with a broad spectrum of manifestations, including hypotonia and muscle weakness. Neu1 deficient mice develop muscular degeneration characterized by atrophy, invasion of muscle fibers by fibroblasts, and expansion of the extracellular matrix. Neu1 controls the proliferation of fibroblasts from patients through the desialylation of PDGF and IGF receptors. In addition, lysosomal enzymes are modulated by Neu1, such as cathepsins, which degrade muscle components and are excessively or erroneously active (sialylated) as a result of Neu1 deficiency. The aim of this study was to identify whether skeletal muscle phenotype of Neu1-/- mice may be associated with IGF-1R, PDGFR and/or sialylation of cathepsin B, through protein and histological analysis of skeletal muscles and fibroblast from Neu1+/+ and Neu1-/- mice treated with IGF-1R and PDGFR inhibitors. The study of cathepsin B protein expression was performed in skeletal muscles treated with IGF-1R and PDGFR inhibitors, and in the cytosolic and lysosomal fractions of fibroblasts treated with exogenous neuraminidase. Compared with Neu1+/+ animals, Neu1-/- muscles showed smaller muscle fiber area, body weight, pAkt expression and higher cathepsin B expression; and Neu1-/- fibroblasts exhibited increased proliferation and expression of pAkt. The inhibition of IGF-1R Neu1-/- mice increased the area of muscle fibers, expression of pAkt and decreased expression of cathepsin B; but, considering Neu1-/- fibroblasts, there was increased cell proliferation with reduction of pAkt. The inhibition of PDGFR in muscles of Neu1-/- mice led to increased expression of pAkt, muscle fiber area, with decreased expression of pERK and cathepsin L, when compared with the Neu1-/- controls; the same inhibition in vitro led to reduced expression of pAkt, pERK and cell proliferation. Cathepsin B presented high activity in the lysosomal fraction and the treatment with neuraminidase was effective in the correction of its molecular weight and lysosomal compartmentalization. In general, the muscular phenotype of Neu1-/- mice is possibly related to IGF-1R and PDGFR activity, and oversialylated cathepsin B is potentially deleterious for the skeletal muscle

A neuraminidase 1 (Neu1) é a enzima que regula o catabolismo de sialoglicoconjugados nos lisossomos. A deficiência da Neu1 é a base da sialidose, doença grave associada a um amplo espectro de manifestações, incluindo hipotonia e fraqueza muscular. Camundongos com deficiência de Neu1 desenvolvem degeneração muscular caracterizada principalmente por atrofia, invasão das fibras musculares por fibroblastos e expansão da matriz extracelular. A Neu1 controla a proliferação de fibroblastos de pacientes por meio da desialilação dos receptores de PDGF e IGF. Além disso, há enzimas lisossomais que são moduladas pela Neu1, tais como as catepsinas, que são capazes de degradar componentes musculares e estariam excessivamente ou erroneamente ativas (sialiladas) em decorrência da deficiência de Neu1. O objetivo deste trabalho foi identificar se o fenótipo da musculatura esquelética de camundongos Neu1-/- poderia estar associado à atividade do IGF-1R, PDGFR e/ou à sialilação de catepsina B, através da análise histológica e proteica de músculos esqueléticos e fibroblastos de camundongos Neu1+/+ e Neu1-/- tratados com inibidores de IGF1-R e PDGFR. O estudo da expressão proteica de catepsina B foi realizado nos músculos tratados com os inibidores de IGF-1R e PDGFR, e nas frações citosólica e lisossomal de fibroblastos tratados com neuraminidase exógena. Em comparação com camundongos Neu1+/+, os músculos de animais Neu1-/- apresentam menor área de fibra, peso corporal, expressão de pAkt e maior expressão de catepsina B; e os fibroblastos Neu1-/- exibem maior proliferação e expressão de pAkt. A inibição do IGF-1R em camundongos Neu1-/- aumentou a área das fibras musculares, expressão de pAKt e diminuiu a expressão de catepsina B; em relação aos fibroblastos Neu1-/-, entretanto aumentou a proliferação celular com diminuição de pAkt. A inibição do PDGFR em músculos de camundongos Neu1-/- levou ao aumento da expressão de pAkt, da área das fibras, com diminuição de pERK e catepsina L, quando comparados com os controles Neu1-/-; a mesma inibição in vitro conduziu à diminuição da expressão de pAkt, pERK e proliferação. A catepsina B encontra-se bastante ativa na fração lisossomal e o tratamento com neuraminidase foi eficaz na correção de seu peso molecular e compartimentalização lisossomal. De forma geral, o fenótipo muscular de camundongos Neu1-/- parece estar relacionado com a atividade de IGF-1R e PDGFR, e a catepsina B hipersialilada é potencialmente deletéria para o músculo esquelético / Neuraminidase 1 (Neu1) is an enzyme that regulates the catabolism of sialoglycoconjugates in lysosomes. Neu1 deficiency is the basis of sialidosis, a severe disease associated with a broad spectrum of manifestations, including hypotonia and muscle weakness. Neu1 deficient mice develop muscular degeneration characterized by atrophy, invasion of muscle fibers by fibroblasts, and expansion of the extracellular matrix. Neu1 controls the proliferation of fibroblasts from patients through the desialylation of PDGF and IGF receptors. In addition, lysosomal enzymes are modulated by Neu1, such as cathepsins, which degrade muscle components and are excessively or erroneously active (sialylated) as a result of Neu1 deficiency. The aim of this study was to identify whether skeletal muscle phenotype of Neu1-/- mice may be associated with IGF-1R, PDGFR and/or sialylation of cathepsin B, through protein and histological analysis of skeletal muscles and fibroblast from Neu1+/+ and Neu1-/- mice treated with IGF-1R and PDGFR inhibitors. The study of cathepsin B protein expression was performed in skeletal muscles treated with IGF-1R and PDGFR inhibitors, and in the cytosolic and lysosomal fractions of fibroblasts treated with exogenous neuraminidase. Compared with Neu1+/+ animals, Neu1-/- muscles showed smaller muscle fiber area, body weight, pAkt expression and higher cathepsin B expression; and Neu1-/- fibroblasts exhibited increased proliferation and expression of pAkt. The inhibition of IGF-1R Neu1-/- mice increased the area of muscle fibers, expression of pAkt and decreased expression of cathepsin B; but, considering Neu1-/- fibroblasts, there was increased cell proliferation with reduction of pAkt. The inhibition of PDGFR in muscles of Neu1-/- mice led to increased expression of pAkt, muscle fiber area, with decreased expression of pERK and cathepsin L, when compared with the Neu1-/- controls; the same inhibition in vitro led to reduced expression of pAkt, pERK and cell proliferation. Cathepsin B presented high activity in the lysosomal fraction and the treatment with neuraminidase was effective in the correction of its molecular weight and lysosomal compartmentalization. In general, the muscular phenotype of Neu1-/- mice is possibly related to IGF-1R and PDGFR activity, and oversialylated cathepsin B is potentially deleterious for the skeletal muscle

O presente estudo teve por objetivos caracterizar os vírus Influenza circulantes na cidade de São Paulo e verificar a variabilidade genética do gene da neuraminidase (NA) dos Influenzavírus A. Um total de 3009 amostras de crianças internadas no Hospital Universitário da USP, no período de 1995 a 2006, foram submetidas à duplex RT-PCR para detecção dos Influenzavírus A e B (IA e IB). As amostras positivas para IA foram submetidas à subtipagem pela multiplex RT-PCR. Cento e trinta e três amostras (4,4%) foram positivas, sendo 88,0% (117/133) IA e 12,0% (16/133) IB. Entre as amostras IA, 94 eram H3N2, 7 H1N1 e 16 não foram subtipadas pela multiplex. Um total de 74 amostras (71 H3N2 e 3 H1N1) tiveram o gene da neuraminidase sequenciado (total ou parcialmente). As sequências obtidas foram submetidas à análise filogenética, sendo verificado o agrupamento das cepas circulantes em clusters por ano de isolamento, demonstrando sua evolução temporal. Quando comparadas com as cepas vacinais utilizadas no período, foi verificada uma boa similaridade. / The aim of this study was to characterize Influenza virus circulating in São Paulo city and the neuraminidase (NA) gene sequence of Influenzavirus A in 3009 samples from children hospitalized at USP University Hospital, from 1995 to 2006. Samples underwent duplex RT-PCR for detection and typing of Influenza virus A and B (IA and IB) and also were submitted to multiplex PCR for subtyping of IA. Among 3009 samples, 4.4% were Influenza virus, being 88.0% IA (117/133) and 12.0% IB (16/133). Among samples of IA, 94 were characterized as H3N2, 7 H1N1 and 16 were not subtyped. A total of 74 samples (71 H3N2 and 3 H1N1) had the NA gene sequenced (total or partially). Sequences obtained were compared to sequences of the world and sequences of vaccine strains. Brazilian samples were grouped in clusters with samples isolated in the same year. It was also found a good similarity between circulating strains and vaccine strains.

La influenza es una enfermedad altamente infectocontagiosa de la cual se tienen registros históricos descriptivos desde la época griega y de certeza etiológica tan solo hace casi ocho décadas atras. Su agente causal es el virus del influenza de los que se conoce exiten tres grandes tipos: A B y C. El tipo A tiene la propiedad de circular por diversos reservorios biológicos, tales como el hombre, los cerdos y las aves, entre otros. Representa además una elevada variabilidad genética lo que le permite continuos cambios o derivas antigénicas menores responsables de la influenza humanas epidémicas y a veces reordenamientos amplios con cambios antigénicos mayores los que originan la temida influenza pandémica. En un mundo cada vez mas globalizado, con una población superior a los seis mil millones de personas, marcado por grandes inequidades sociales y con cambios climáticos evidentes, los virus de la influenza serán un riesgo permanente para la seguridad de la humanidad. La clínica de los diversos subtipos virales pueden balancearce desde las formas inaparentes hasta las formas graves de gripe o influenza, dependiendo de la virulencia del subtipo viral infectante y del huesped. Aunque nuestra tecnología diagnóstica y de inmunización ha avanzado sorprendentemente, la preparación y disposición de los nuevos kits diagnósticos suelen tardar al principio y en el caso de las vacunas estas no están disponibles para el un nuevo subtipo viral pandémico en el momento que se las necesita. El desarrollo de antivirales contra la gripe no es notorio, contándose aprobados para uso humano los amadantanes como la amantadina y la rimantadina y los inhibidores de la neuraminidasa como oseltamivir y sanamivir principalmente. Claramente los más vulnerables en este contexto son los países en vías de desarrollo y en especial aquellos mas pobres, hecho que nos debería llamar a una profunda reflexión. / Influenza is a highly contagious disease. There are some historical descriptions of this condition by ancient Greek physicians, and the etiological agents have been known only for the last eight decades. The causative agent is the influenza virus, which has three main types: A, B, and C. Type A is capable of circulating within many different biological reservoirs, including humans, swine, and birds. It also has high genetic variability, which allows it to have minor antigenic drifts or mutations which are responsible of epidemics in humans. Sometimes changes are quite marked, leading to pandemics. In a globalized world, with more than 6 billion inhabitants, with many social inequities and evident climate changes, influenza viruses are a permanent risk for mankind. Clinical features for the different viral subtypes may vary from subtle infections to full blown and severe, life-threatening forms. Event with the great advances in diagnostics and immunization, the manufacture and distribution of new diagnostic kits may take some time, and new vaccines are not always readily available. Specific therapies against influenza are not well developed. There are two groups of drugs, the so called adamantane derivatives, such as amantadine and rimantadine, and the neuraminidase inhibitors, such as oseltamivir and zanamivir. Most vulnerable areas for the new flu pandemics include developing countries, particularly the poorest ones, so that the greatest effort must be made for helping these areas.

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-28Bitstream added on 2015-05-14T16:58:58Z : No. of bitstreams: 1 000829155.pdf: 363339 bytes, checksum: dbf6106e4f09a1f8ded3d4f562685ee4 (MD5) / Espécies de lactobacilos são os principais componentes da microbiota vaginal e a manutenção do predomínio lactobacilar é importante para proteção desse ambiente contra possíveis patógenos. A vaginose bacteriana é uma condição em que se observa a perda de lactobacilos e substituição desses microrganismos por espécies bacterianas, anaeróbias em sua maioria. Tal condição pode acarretar inúmeras complicações ginecológicas e obstétricas, como o aumento do risco de aquisição de infecções sexualmente transmissíveis, parto prematuro e baixo peso ao nascimento. O principal método utilizado para o diagnóstico da vaginose bacteriana é o proposto por Nugent et al. (1991) e se baseia na classificação da microbiota vaginal em flora normal, intermediária e vaginose bacteriana. Enquanto que o perfil imunológico e microbiológico da vaginose bacteriana tenha sido amplamente estudado, pouco se sabe sobre tais características na flora intermediária. Portanto, o objetivo desse estudo foi caracterizar a flora intermediária quanto aos níveis cérvico-vaginais de Interleucina (IL)1-beta, IL-6, IL-8, IL-10, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa, antagonista de receptor de IL-1(IL-1ra), sialidases bacterianas e quanto às cargas de Gardnerella vaginalise de bactérias totais, além de verificar se o perfil geral observado na flora intermediária se assemelha ao de mulheres com flora normal ou com vaginose bacteriana. Foi realizado um estudo transversal que incluiu 526 mulheres não grávidas em idade reprodutiva. Deste total, foram constituídos os grupos de estudo de acordo com o padrão de flora vagina, segundo Nugent et al. Todos os 145 casos de vaginose bacteriana foram incluídos nas análises, bem como os 63 casos de flora intermediária e 145 das 318 mulheres que apresentaram flora normal. A determinação dos níveis cérvico-vaginais de citocinas, sialidases e a carga bacteriana foram realizados por, respectivamente, ELISA, ...

Orientador: Camila Marconi / Coorientador: Màrcia Guimarães da Silva / Banca: Andrea da Rocha Tristão / Banca: Ana Katherine da Silveira Gonçalves / Banca: Eliane Melo Brolazo / Banca: Cristina Maria Garcia de Lima Parada / Resumo: Espécies de lactobacilos são os principais componentes da microbiota vaginal e a manutenção do predomínio lactobacilar é importante para proteção desse ambiente contra possíveis patógenos. A vaginose bacteriana é uma condição em que se observa a perda de lactobacilos e substituição desses microrganismos por espécies bacterianas, anaeróbias em sua maioria. Tal condição pode acarretar inúmeras complicações ginecológicas e obstétricas, como o aumento do risco de aquisição de infecções sexualmente transmissíveis, parto prematuro e baixo peso ao nascimento. O principal método utilizado para o diagnóstico da vaginose bacteriana é o proposto por Nugent et al. (1991) e se baseia na classificação da microbiota vaginal em flora normal, intermediária e vaginose bacteriana. Enquanto que o perfil imunológico e microbiológico da vaginose bacteriana tenha sido amplamente estudado, pouco se sabe sobre tais características na flora intermediária. Portanto, o objetivo desse estudo foi caracterizar a flora intermediária quanto aos níveis cérvico-vaginais de Interleucina (IL)1-beta, IL-6, IL-8, IL-10, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa, antagonista de receptor de IL-1(IL-1ra), sialidases bacterianas e quanto às cargas de Gardnerella vaginalise de bactérias totais, além de verificar se o perfil geral observado na flora intermediária se assemelha ao de mulheres com flora normal ou com vaginose bacteriana. Foi realizado um estudo transversal que incluiu 526 mulheres não grávidas em idade reprodutiva. Deste total, foram constituídos os grupos de estudo de acordo com o padrão de flora vagina, segundo Nugent et al. Todos os 145 casos de vaginose bacteriana foram incluídos nas análises, bem como os 63 casos de flora intermediária e 145 das 318 mulheres que apresentaram flora normal. A determinação dos níveis cérvico-vaginais de citocinas, sialidases e a carga bacteriana foram realizados por, respectivamente, ELISA, ... / Abstract: Not available / Doutor

Cystic fibrosis (CF) is one of the relatively common inherited diseases caused by a mutation in the gene encoding for CFTR protein, which forms a chloride channel that significantly affects ion homeostasis and the associated fluid management of the cell. This disease mainly affects the respiratory and digestive systems, being the most life-threatening in the respiratory tract. Patients with CF suffer from frequent and recurrent respiratory infections that lead to the development of chronic inflammation and gradual destruction of lung tissue. These lung infections, which are caused mostly by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa, are the most common cause of morbidity and mortality in these patients. At present, antibiotics are used in the treatment of Pseudomonas aeruginosa infections, but new methods of antibacterial therapy need to be found to overcome the development of resistance. In addition to active immunization of CF patients against Pseudomonas aeruginosa, their passive immunization with specific chicken antibodies directed against this pathogen offers promising possibilities. This dissertation thesis is aimed to verify the prophylactic potential of hen IgY antibodies against the virulence factor Pseudomonas aeruginosa - lectin PAIIL, and to further develop an experimental...

The hemagglutinin-neuraminidase (HN) molecule of Newcastle disease virus (NDV) is an integral membrane glycoprotein that is oriented with its N-terminus in the cytoplasm and its C-terminus external to the infected cell. Single spanning membrane proteins with this type of topology (N-terminus in, C-terminus out) have been classified as Type II glycoproteins, in contrast to the more common Type I glycoproteins, which are oriented in the opposite direction. (C-terminus in, N-terminus out). The membrane integration of HN protein was investigated using a wheat germ translation system to synthesize and integrate HN protein into microsomal membranes in vitro. The insertion and translocation of HN protein into microsomal vesicles was found to occur cotranslationally without signal sequence cleavage. The membrane targeting required both signal recognition particle (SRP) and SRP receptor. Membrane binding assays utilizing HN nascent chain/ribosome/SRP complexes demonstrated that the membrane insertion of HN polypeptide required the presence of GTP, in a way similar to that described for secretory, multispanning and Type I proteins. To investigate further the membrane translocation process of HN protein, the amino terminal region of HN was mutated to determine the role of this region in the membrane integration of HN. The cDNA sequence encoding the bulk of the cytoplasmic tail of the HN glycoprotein was deleted. When transcripts produced from the mutated cDNA were translated in wheat germ extract in the presence of membranes, several abnormalities were identified in the interaction of the mutant protein with membranes. Although translocation and glycosylation of the mutant protein was detected, the efficiency of membrane translocation and the stability of the mutant protein's membrane interaction were reduced. Even though a large proportion of the mutant products remained nontranslocated and unglycosylated, many of these products were inserted into membrane vesicles in a reverse orientation from the wild type HN protein. The aberrant insertion of the mutant protein required both SRP and SRP receptor. Ribosome-bound mutant nascent chains were able to insert into membranes without the addition of GTP or SRP, but this GTP-independent insertion was in reverse. Therefore, the cytoplasmic tail of the HN glycoprotein appears to playa critical role in the maintanence of faithful directionality of the protein's membrane insertion.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第19048号 / 農博第2126号 / 新制||農||1032(附属図書館) / 学位論文||H27||N4930(農学部図書室) / 31999 / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 植田 充美, 教授 植田 和光, 教授 小川 順 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM