CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O Ãxido nÃtrico (NO), derivado da L-arginina pela Ãxido nÃtrico sintetase (NOS), a qual existe em vÃrias isoformas, Ã considerado um importante mensageiro molecular em vÃrios ÃrgÃos incluindo o trato genital masculino. Este estudo analisou o possÃvel efeito do L-NAME (NG-nitro-L-arginina metil Ãster), um inibidor nÃo seletivo de NOS sobre a descida testicular, emissÃo seminal induzida por colinÃrgico, funÃÃo testicular, comportamento sexual e fertilidade em ratos Wistar machos. O tratamento de ratos machos de 20 dias de idade com L-NAME na dose de 20mg/kg/dia por 10 dias consecutivos promoveu um significativo retardo na descida testicular comparado ao controle que recebeu salina. Este efeito do L-NAME foi bloqueado em animais prÃ-tratados com L-arginina (600mg/kg, s.c.), um substrato para a biossÃntese de NO, sugerindo que o NO exerce um papel modulador na descida testicular. Em ratos machos adultos, a pilocarpina (0,75 e 3,0 mg/kg, i.p.), droga colinÃrgica, induziu a emissÃo seminal de maneira dose-dependente. A emissÃo seminal em resposta a pilocarpina ( 3,0 mg/kg) foi diminuÃda em animais atropinizados sugerindo um efeito colinÃrgico. L-NAME tembÃm inibiu a emissÃo seminal induzida por pilocarpina e este efeito foi revertido por L-arginina (600mg/kg, s.c.) ou pela administraÃÃo conjunta de nitroprussiato de sÃdio (0,5mg/kg, s.c.). AlÃm disto, a anÃlise urinÃria de nitrato/nitrito demonstrou marcada alteraÃÃo em concordÃncia com o tratamento. Estes resultados sugerem que o NO participa na neurotransmissÃo inibitÃria responsÃvel pela emissÃo seminal em ratos estimulados com pilocarpina. Em experimentos realizados para verificar os efeitos da inibiÃÃo crÃnica de NOS sobre o comportamento copulatÃrio, o tratamento de ratos com L-NAME (40mg/kg/dia) durante um perÃodo de um ciclo completo de espermatogÃnese uma influÃncia inibitÃria sobre o comportamento sexual foi evidenciada por um aumento na latÃncia da primeira monta e intromissÃo e marcada inibiÃÃo da frequÃncia de intromissÃo e ejulaÃÃo. A inibiÃÃo crÃnica de NOS tambÃm demonstrou alteraÃÃo na funÃÃo testicular refletida pela diminuiÃÃo nos nÃveis sÃricos de testosterona, contagem de espermatozÃides e anormalidades espermÃticas. O nÃmero de fÃmeas grÃvidas, de machos que receberam tratamento crÃnico com L-NAME, foi reduzido resultando em 75% de inibiÃÃo da fertilidade. O efeito de L-NAME sobre a fertilidade masculina pode dever-se a inibiÃÃo da NOS perifÃrica e central promovendo inibiÃÃo da secreÃÃo local de androgÃnios e/ou gonadotrofinas. Os resultados mostram evidÃncias que o NO regula de maneira importante o processo reprodutivo masculino tais como descida testicular, comportamento sexual e fertilidade / Nitric Oxide (NO) derived from L-arginine by the nitric oxide synthase (NOS) which is expressed by various isoforms, is considered to be na important messenger molecule in several organ systems including the male genital tract. This study analysed the possible effects of L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester), a nonselective NOS inhibitor on testicilar descent; cholinergic stimulation-induced seminal emission; testicular function; sexual behaviour; and on fertility of male Wistar rats. Treatment of 20 days old male rats with L-NAME at 20mg/kg/day for 10 consecutive days caused a significant delay in the testes descent compared to controls that receives only normal saline. This effect of L-NAME was fully reversed in animals pretreated with L-arginine (600mg/kg, s.c.), a substrate for NO biosynthesis, suggesting stimulant drug pilocarpine (0.75 â 3.0 mg/kg, i.p.) induced a dose-related seminal emission. The seminal emission response to 3.0mg/kg of pilocarpine was greatly diminished in atropinized animals, suggesting a cholinomimetic effect. L-NAME, also inhibited the pilocarpine-induced seminal emission which could be reversed by L-arginine (600mg/kg, s.c.). Further, urine analysis for nitrate/nitrite metabolites showed marked alterations in accordance to the drug treatments. These results suggest that NO mediates the inhibitory neurotransmission responsible for seminal emission in pilocarpine stimulated rats. In experiments carried out to verify the effects of chonic NOS inhibition on copulatory behavior, treatment of rats with L-NAME (40mg/kg/day) for a period of one complete spermatogenic cycle caused an inhibitory influence on sexual behavior as evidenced by a increase in the first mount and intromission latencies and marked inhibitions of the intromission and ejaculation frequencies. Chronic NOS inhibition further evidenced impaired testicular function, reflected by decreases in serum levels of testosterone, epididymal sperm counts and sperm abnormalities. The number of females impregnated with males that received chronic L-NAME treatment was highly reduced, resulting in 75% inhibition of fertility. The adverse influence of L-NAME on male infertility could be due to NOS inhibition at both peripheral and central sites causing inhibition of local androgen and/or gonadotropin secretions. These results provide evidence that NO importantly regulates male reproductive processes such as testicular descent, sexual behavior and fertility

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Neste trabalho foi realizada a sÃntese e a caracterizaÃÃo dos complexos cis-[Ru(bpy)2(TU)(H2O)](PF6)2 e cis-[Ru(bpy)2(TU)(NO)](PF6)3, onde TU=TiourÃia e bpy= 2,2â-bipiridina, bem como os estudos preliminares relacionados a reatividade do nitrosilo-complexo frente a luz branca e na presenÃa do redutor biolÃgico cisteÃna. O aquo-complexo possui o ligante TiourÃia coordenado ao centro metÃlico via Ãtomo de enxofre, tendo em vista os dados obtidos por espectroscopia vibracional na regiÃo do infravermelho bem como aqueles calculados por DFT. O complexo apresentou um potencial de meia-onda (E1/2) referente ao par redox RuIII/II em 415 mV vs Ag|AgCl e um espectro eletrÃnico dependente do pH devido ao equilÃbrio de deprotonaÃÃo do hidrogÃnio do grupo NH2 da TiourÃia que ocorre com pKa = 10,11. O nitrosilo-complexo, que tambÃm possui o ligante TiourÃia coordenado ao centro metÃlico via Ãtomo de enxofre, apresentou um valor correspondente a frequÃncia de estiramento NO em 1932 cm-1, coerente com o valor do potencial de meia-onda (E1/2) referente ao par redox NO+/0 em 37,5 mV, com o valor obtido para a constante de equilÃbrio relacionada a reaÃÃo de inter-conversÃo nitrosil-complexo/nitro-complexo, K = 1,26 x 1015, e com os valores calculados por DFT para a energia do orbital LUMO e da carga parcial sobre o ligante nitrosil. O nitrosilo-complexo apresentou uma boa reatividade em relaÃÃo à liberaÃÃo de NO0 tanto por reduÃÃo eletroquÃmica quanto por reduÃÃo fotoquÃmica, porÃm o mecanismo em que ocorre esta liberaÃÃo no que se refere à fotoquÃmica se dà de uma forma diferenciada em relaÃÃo a sistemas similares da literatura. O mecanismo de liberaÃÃo do NO0 a partir do nitrosilo-complexo apÃs reaÃÃo com o redutor biolÃgico cisteÃna, tambÃm parece ocorrer de forma diferenciada em relaÃÃo a sistemas similares jà estudados. / In this work, it was carried out the synthesis and characterization of the complexes cis-[Ru(bpy) 2 (TU)(H 2 O)](PF 6 ) 2 and cis - [Ru(bpy) 2 (TU)(NO)](PF 6 ) 3 , where TU = thiourea and bpy = 2,2 ' - bipyridine, and preliminary studies of the photoreactivity of the nitrosyl complex and its reaction with cysteine, a biological reductant agent. The aqua - complex contains the thiourea ligand coordinated to the metal center through the sulfur atom, according to the data obtained by infrared vibrational spectroscopy and reinforced by theoretical study using DFT. The complex showed a half -wave potential (E1/2) for the RuIII/II redox couple at 415 mV vs Ag | AgCl and a p H-dependent electronic spectrum, due to acid - base equilibrium of the proton released from the NH 2 group of thiourea that presents a pKa = 10.11. The nitrosyl complex, which also contains the thiourea ligand coordinated to the metal center through the sulf ur atom, showed NO stretching frequency at 1932 cm - 1 , which is also consistent with the half - wave potential (E 1/2 ) for the NO +/0 redox couple at 37.5 mV. Additionally, it was measured the equilibrium constant for the inter - conversion reaction of nitrosyl to nitro complex at K = 1.26 x 10 15 . These data were further supported by empirical calculations carried out by DFT, where the en ergy of the LUMO orbital and the electronic density on the nitrosyl ligand were in agreement with the previous data. The nitrosyl complex has exhibited efficient release of NO in solution whether upon electrochemical or photochemical reduction. Curiously, the mechanism for the photochemical release of NO was different from other similar complexes. The chemical reduction of the nitrosyl complex with cysteine has efficiently released NO but again it followed a different mechanism from that found in other rel ated systems.

O Óxido Nítrico inalatório (iNO) é uitlizado para tratamento de várias doenças pulmonares, porém algumas evidências apóiam que esses efeitos farmacológicos do iNO podem alcançar outros leitos vasculares. Desse modo, esse estudo tem como objetivo investigar o possível efeito anti-inflamatório do iNO no modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos e identificar por qual via ele desempenha essa resposta. Concluimos que o iNO foi eficaz na redução de sinais inflamatórios e houve indícios que o NO desempenha seus efeitos pela via do GMPc, pelo fato de ter aparecido um efeito potencializador na redução do edema quando associoado ao sildenafil e não com o rolipram. Esses resultados indicam que a terapia com iNO vai além dos efeitos vasculares pulmonares inicialmente descritos. / Inhaled Nitric Oxide (iNO) is useful to treat many lung diseases, but some evidences support that these pharmacological effects of iNO can reach other vasculature, beyond the pulmonary vasculature. Thus, this study aimed to investigate the possible antiinflammatory effect of inhaled nitric oxide on the mice paw edema induced by carrageenan and investigate for which way iNO is acting. We conclude that iNO was effective in reducing inflammatory signs and there are some traces that this responses occurred by cGMP way. These results indicate that the beneficial effect of inhaled nitric oxide therapy goes beyond the initially described pulmonar vascular effects.

Neste trabalho foram realizados as sínteses, caracterização e o estudo da reatividade química dos complexos trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O e trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O. Os compostos foram isolados e caracterizados através de técnicas espectroscópicas (UV-vis, infravermelho e 1H RMN), eletroquímicas (voltametria cíclica e polarografia de pulso diferencial) e análise elementar. Os dados espectroscópicos, eletroquímicos e os resultados da análise elementar foram consistentes com as fórmulas dos complexos analisados. Foram utilizados como precursores os compostos [RuCl2(DMSO)4], trans-[RuCl2(py)4] e trans-[Ru(NO2)2(py)4]. O composto com NO foi obtido a partir do complexo trans-[Ru(NO2)2(py)4] em ácido clorídrico concentrado e precipitado como sal de PF6-, formando o complexo trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O. O trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O foi obtido a partir de uma solução do complexo trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2.½H2O, adicionando-se uma solução de cloreto de tetrabutilamônio para precipitar o composto na forma de cloreto. Os espectros na região do UV-vis dos complexos trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O e trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O apresentaram três bandas nas regiões ao redor de 230 nm, 260nm e 450 nm. Os espectros de infravermelho apresentaram freqüência de estiramento NO entre 1900 e 1925 cm-1, cujo valor variou dependendo das condições em que foram obtidos os espectros. O ciclovoltamograma do composto trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O, obtido em solução de acetonitrila, apresentou um processo redox atribuído ao par NO+/0 e um outro processo com E2c = -0,59 V vs Ag/AgCl atribuído à redução do NO0. A atribuição do processo redox com E½ = +0,30 V vs Ag/AgCl foi confirmada através do experimento de espectro eletroquímica na região do infravermelho, onde a banda atribuída ao NO foi diminuindo à medida que o composto ia sendo reduzido. Na espectroeletroquímica na região de UV-vis em acetonitrila foi possível observar uma reação acoplada à redução do composto trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O, podendo ser a substituição do NO0 por uma molécula de solvente. O comportamento eletroquímico do composto trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O foi estudado em solução aquosa. O ciclo voltamograma do composto apresentou um processo redox com E½ =+0,13 V vs Ag/AgCl, que é atribuído ao par NO+/0, um processo em +0,25 V e outro em 0,59 V. Dois processos redox dependentes do processo em +0,25 V foram observados nas faixa entre 0,4-0,7 V e podem ser devidos a produtos formados após uma provável saída do Cl- seguido da liberação do NO, como ocorre com o complexo trans-[RuCl(NO)(cyclam)](PF6)2. No estudo da reatividade do ligante NO no complexo trans-[RuCl(NO)(py)4]2+, observou-se que o NO é pouco reativo ao ataque nucleofílico do OH-, apresentando um pKa do equilíbrio entre as espécies nitro e nitrosilo em 11,5 e um Keq = 6,2.104 L2.mol-2. / In this work, the syntheses, characterization and chemical reactivity of trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O and trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O were studied. The complexes were isolated and characterizated by elemental analyses UV-vis, infrared and 1H NMR spectroscopies, cyclic voltammetry and spectroelectrochemistry. [RuCl2(DMSO)4], trans-[RuCl2(py)4] and trans-[Ru(NO2)2(py)4] were used as precursor complexes. The compound with NO ligand was obtained from the reaction of trans-[Ru(NO2)2(py)4] with chloridric acidic, and precipitation with PF6-, resulting in trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O. The trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O complex was obtained from a trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O acetonitrile solution adding a tetrabutylammonium chloride acetonirile solution. The complex was precipitated as a chloride salt. The UV-vis spectra of trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O and trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O displayed three bands around the 230 nm, 260 nm and 450 nm regions. The infrared spectra showed the stretching frequencies NO in the 1900-1925 cm-1 range whose values depend on the conditions with which the spectra were recorded. The cyclic voltammetry of the trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O in acetonitrile solutions showed a pair of peaks (E½ = +0.30 V vs Ag/AgCl) corresponding to the NO+/0 redox processes, and other process at E2c = -0.59 V vs Ag/AgCl assigned to NO0 reduction. The assignment of the redox processes was confirmed through infrared spectroelectrochemistry, where the band of NO decreases while the compound was reduced. The UV-vis spectroelectrochemistry in acetonitrile solution, showed a coupled reaction following the trans-[RuCl(NO)(py)4]2+ reduction. This coupled reaction is probably the NO substitution by a solvent molecule. The electrochemical behavior of trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O was studied in aqueous solution. The cyclic voltammetry of this complex displayed a pair of peaks (E½ = +0.13 V vs Ag/AgCl) corresponding to NO+/0 redox processes, a process at -0,25 V and other at 0,59 V. Two other couples dependent on the process at 0.25 V, were observed between +0,4 V and +0,7 V. These may be due to products of the Cl- release followed by the NO release, as occurs in trans-[RuCl(NO)(cyclam)](PF6)2. The trans-[RuCl(NO)(py)4]2+ complex showed a low affinity for OH-, with a pKa of the equilibrium between nitro and nitrosyl species at 11.5 and a Keq = 6.2 x 104 L2.mol-2.

Neste trabalho propusemos a utilização do fotossensibilizador ZnPC associado ao complexo nitrosilo de rutênio Ru-tpy por meio de lipossomas de longo tempo de circulação, com o objetivo de analisar o efeito sinérgico das espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERONs) geradas respectivamente pelos mesmos, atuando sobre uma linhagem celular neoplásica. Foram estudadas as propriedades fotofísicas e fotoquímicas do sistema misto ZnPC/Ru-tpy empregando-se técnicas de espectroscopia no estado estacionário e resolvido no tempo. Com isto foi possível determinar importantes parâmetros que elucidaram seu perfil fotodinâmico, confirmando sua viabilidade para aplicação em estudos in vitro e in vivo. Estes estudos também indicaram uma possível interação entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy através do mecanismo de transferência de elétron do fotossensibilizador para o complexo de rutênio, desta forma liberando o NO. Realizamos os estudos em meio biológico utilizando a linhagem neoplásica B16-F10, avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausência e na presença de luz. Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPC/Ru-tpy em meio lipossomal apresenta propriedades fotofísicas e fotobiológicas úteis, gerando as espécies reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela TFD. / We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC) associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes (stealth liposome), with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated, acting on the neoplastic cell line. The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPC/Ru-tpy were studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time. With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its photodynamic profile, confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo. These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium complex which leads to release nitric oxide (NO). We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10, evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light. Our results demonstrated that the system ZnPC/Ru-tpy in the stealth liposome presents useful photophysical and photobiological properties, generating the species reactives (EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT).

O ancoramento do complexo trans-[RuIII(NH3)4(SO4)ina]Cl em dendrímeros PAMAM de geração 0 e 2 (G0 e G2) foi realizada por meio de uma ligação peptídica, e esses produtos foram submetidos à reação com NO(g) gerando os respectivos nitrosilo complexos G0/RuNO e G2/RuNO. A caracterização desses compostos por infravermelho, UV-vis, voltametria cíclica, RMN de 1H e 13C, e análise elementar indica que os nitrosilo complexos foram imobilizados na superfície dos PAMAM G0 e G2. Os espectros de infravermelho para G0/RuNO e G2/RuNO apresentaram apenas um estiramento &nu;NO+, respectivamente em 1933 e 1937 cm-1, e para o produto RuNO (não ligado ao dendrímero) em 1933 cm-1. O espectro eletrônico para esses três compostos apresentou bandas nas regiões de 230, 270 e 330 nm, e por meio de voltametria cíclica observou-se o processo eletroquímico relativo a NO+/NO0 com ENO+/NO0 vs ECS igual a -0,173 V para G0/RuNO, -0,178 V G2/RuNO e -0,175 V para RuNO. O espectro de 1H RMN do complexo RuNO apresentou dois dubletos com deslocamentos químicos centrados em 8,73 e 8,35 ppm, referentes aos hidrogênios aromáticos respectivamente nas posições orto e meta do ligante ina coordenado ao metal. Para G0/RuNO e G2/RuNO esses sinais foram observados em 8,73 e 8,36 ppm, e os sinais referentes aos dendrímeros nesses produtos foram verificados entre 2,7 e 4,0 ppm. O espectro de RMN 13C para o complexo RuNO apresentou quatro sinais, e para G0/RuNO e G2/RuNO, respectivamente, dez e doze sinais, conforme esperado para esses compostos. Apesar dos resultados supracitados indicarem que o ancoramento ocorreu de forma satisfatória, os dados de análise elementar apresentaram desvios significativos entre o valor teórico e o experimental, principalmente para G2/RuNO. Em adição, foram realizados ensaios em células do baço de camundongos para verificar a toxicidade dos nitrosilo complexos às células saudáveis, e os resultados indicaram baixa citotoxicidade (<15%) para RuNO, G0/RuNO e G2/RuNO. Também foram realizados experimentos sobre a atividade in vitro desses compostos contra os parasitos Trypanosoma cruzi e Leishmania major. Os melhores resultados, ainda que preliminares, foram obtidos com a maior concentração, 200&micro;M (em relação à Ru), em que observou-se atividade tripanocida (média) em torno de 88% para G2/RuNO, 82% para G0/RuNO e 72% para RuNO, enquanto que para o Bz (referência) esse valor foi de 96%. Já a atividade leishmanicida (concentração de 200&micro;M) desses compostos ficou entre 60 a 70% (65% para G2RuNO, 69% para G0/RuNO e 60% para RuNO). / The anchoring of the complex trans-[RuIII(NH3)4(SO4)ina]Cl on PAMAM dendrimers of generation 0 and 2 (G0 and G2) was performed by a peptide bond, and the products were submitted to reaction with NO (g) generating the related nitrosyl complexes G0/RuNO and G2/RuNO. The characterization of these compounds by IR, UV-vis, cyclic voltammetry, 1H and 13C NMR, and elemental analysis indicated that the nitrosyl complexes were immobilized on the surface of PAMAM G0 and G2. Infrared spectra for G0/RuNO and G2/RuNO showed only one &nu;NO+ band in 1933 and 1937 cm-1 respectively, and for RuNO (complex not bounded to the dendrimer) at 1933 cm-1. Electronic spectra for these three compounds showed bands in the regions of 230, 270 and 330 nm, and by cyclic voltammetry it was possible to observe the electrochemical process relative to NO+/NO0 with ENO+/NO0 equal to -0.173 V vs SCE for G0/RuNO , -0.178 V for G2/RuNO and -0.175 V for RuNO. The 1H NMR spectra for RuNO complex showed two doublets with chemical shifts centered at 8.73 and 8.35 ppm, respectively referring to the aromatic hydrogens in the ortho and meta positions of the ina ligand coordinated to the metal. The same signals obtained for G0/RuNO and G2/RuNO were observed in 8.73 and 8.36 ppm, and signals related to dendrimers between 2.7 and 4.0 ppm. The 13C NMR spectrum for RuNO exhibited four signals, and for G0/RuNO and G2/RuNO, respectively, ten and twelve signals, as expected for these compounds. Despite the results above, which indicate that anchoring occurred satisfactorily, the elemental analysis showed significant deviations between the theoretical and experimental values, especially for G2/RuNO. In adition, in vitro assays were performed on mice spleen cells to determine the toxicity of the nitrosyl complex to healthy cells, and the results showed low cytotoxicity (<15%) for RuNO, G0/RuNO and G2/RuNO. In vitro experiments were also carried out to determine the activity of these compounds against the parasite Trypanosoma cruzi and Leishmania major. The best results (preliminary) were obtained with the highest concentration 200&micro;M (relative to Ru), which was observed trypanocidal activity (average) around 88% for G2/RuNO, 82% for G0/RuNO and 72% for RuNO, while for Bz (reference) it was around 96%. The leishmanicidal activity (concentration of 200&micro;M) of these compounds was in the range of 60 to 70% (65% for G2RuNO, 69% for G0/RuNO and 60% for RuNO).

A redução eletroquímica de íons complexos do tipo trans-[Ru(NH3)4LNO]2+, foi investigada com o intuito de verificar a possibilidade desses complexos atuarem como doadores de nitroxil (HNO/NO-). Neste trabalho foi dada uma ênfase especial no estudo da espécie em que L = P(OEt)3. Aplicando-se as técnicas de voltametria cíclica e de pulso diferencial, voltametria de onda quadrada e espectroeletroquímica, foi possível verificar que a espécie trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]2+ sofre redução monoeletrônica gerando o íon complexo trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]+. Foram analisadas as estabilidades relativas das espécies possivelmente formadas, trans- [Ru(NH3)4P(OEt)3NO]+ e trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3HNO]2+, baseadas na Teoria de Densidade Funcional (DFT). Após a transferência eletrônica, de acordo com a equação abaixo, a espécie formada sofre isomerização de spin, ocorrendo posteriormente a dissociação do grupo NO O processo apresenta-se como irreversível no espectro voltamétrico devido às restrições de spin. A reação do íon complexo trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]3+ com o alfacetoglutarato (Ered = -0,90 V), composto capaz de agir como redutor de dois elétrons por transferência de elétrons de esfera externa, foi monitorada eletroquímica e espectrofotometricamente utilizando a metmioglobina, Mb - Fe(III), captador seletivo de nitroxil. Os resultados obtidos sugerem o complexo supracitado como um possível doador de niroxil. / The electrochemical reduction behavior of the complexes trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]2+ was investigated in order to determine the possibility of these complexes to serve as nitroxyl donors (HNO/NO-). Special emphasis was given when L = P(OEt)3. Using cyclic voltammetry and differential pulse, square wave voltammetry and spectroelectrochemistry techniques was possible to infer that the ion complex trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]2+ suffers an one electron reduction generating the ion complex trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]+. Analyzing the behavior of the cyclic voltammetry spectra, is possible to conclude that the process is irreversible by spin restrictions. The reaction of the ion complex trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]+ with the reductor agent alpha-ketoglutarate (Ered = -0,90V), a two electron reductor by outersphere pathway, was monitored by electrochemistry and UV-vis spectroscopy techniques using Mb-Fe(III) as a selective nitroxyl scavenger. The results obtained with these experiments confirm the original purpose of this study.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem importância vital em muitos processos fisiológicos e apresenta uma multiplicidade de funções de regulação no corpo humano, tais como neurotrasmissão, vasodilatação, participa nas respostas imunes e em vários processos associados com o desenvolvimento dos tumores. Vários estudos fornecem evidências sobre as propriedades tumoricidas do óxido nítrico e doadores de NO que podem ser usados para o tratamento de tumores malignos e são objetos de interesse na atualidade. Baseado nisto o objetivo deste trabalho foi de sintetizar e descrever aspectos estruturais dos compostos [Ru(bpy)2(dcbpy)] (dcbpy = ácido 4,4\'-dicarboxi-2,2\'-bipiridina, bpy = 2,2\'-bipyridina) [Ru(bpy)(dcbpy)2], cis-[RuCl2(dcbpy)2], cis-[Ru(dcbpy)2NO(L)]n+ (L = cloreto), [Ru(TERPY)(dcbpy)Cl] (TERPY = 2,2\': 6\'\', 2\'\' - terpiridina) and [Ru(TERPY)(dcbpy)NO], além de ensaios de citotoxicidade in vitro para alguns dos complexos sintetizados. Ensaios de citotoxicidade com solução aquosa de complexos rutênio-nitrosilo em linhagem de células metastáticas B16-F10 mostrou resultados relativamente baixos. Medidas de viabilidade celular mostrou que estes decrescem cerca de 10 % em relação ao controle. Este resultado foi interpretado como sendo devido a baixa interação entre o complexo e a célula. Bioconjugação de rutênio-nitrosilo com anticorpo policlonal IgG foi obtido por interação convalente e mostrou maior especificidade com um alvo na célula. Cromatografia de exclusão foi utilizada para separar o bioconjugado --IgG, que foi caracterizado por teste Western Blotting. Após a bioconjugação, o --IgG foi submetido a estudos de citotoxicidade com células metastáticas e a viablidade celular avaliada com ensaios MTT. Os resultados exibiram um incrível aumento na citotoxicidade de células B16-F10. Viabilidade celular foi determinada e valores de morte celular de cerca de 90 % obtida para uma das frações de --IgG. Nossos resultados demonstraram que o bioconjugado --IgG pode aumentar a resposta citotóxica e quiçá ser útil em terapia clínica. / Nitric oxide (NO) is a biological messenger that has vital importance in many physiological processes and shows a multitude of regulatory roles in the human body, such as neurotrasmission, vasodilatation, immune responses and also participates in various processes associated with cancer development. Several studies provide evidences of the tumoricidal properties of NO donors that can be used for the treatment of malignant tumors and nowadays are objects of interest. Based on this the aim of this work was synthesize compounds that in a controlled manner can deliver NO in a biological process. The synthesis, structural aspects, and in vitro cytotoxic properties of [Ru(bpy)2(dcbpy)] (dcbpy = 2,2\'-bipyridine-4,4\'-dicarboxylic acid), 2\'-bipyridine; bpy = 2,2\'-bipyridine) [Ru(bpy)(dcbpy)2], cis-[RuCl2(dcbpy)2], cis-[Ru(dcbpy)2NO(L)]n+ (L = chloride), [Ru(TERPY)(dcbpy)Cl] (TERPY = 2,2\': 6\'\', 2\'\' - terpiridine) and [Ru(TERPY)(dcbpy)NO] are described. Citotoxicity assays with aqueous nitrosyl ruthenium complex in metastatic B16-F10 cells displayed very little effect. Cell viability measurement showed decrease around 10 % in comparison to the control. It was associated due to the low interaction between nitrosyl ruthenium specie and the cell. Bioconjugation of nitrosyl ruthenium specie with polyclonal antibody IgG was achieved by covalent interaction and showed more specific interaction between bioconjugated and target cell. Exclusion chromatography was used to isolate --IgG conjugated, which was characterized by Western Blotting test. Following bioconjugation, the --IgG was submitted to cytotoxic studies with metastatic cells and the viability evaluated by MTT assay. The results displayed incredible increase of citotoxicity for B16F10 cells. Cell viability was achieved to decrease until to 90 % in comparison to the control when one fraction of --IgG was used. Taken together, the present findings demonstrate that the --IgG complex may elicit citotoxicity responses that may find useful applications in clinical therapy.

O hormônio melatonina produzido pela glândula pineal no período de escuro, participa na regulação circadiana de processos, fisiológicos e fisiopatológicos envolvendo vasos sanguíneos. Alguns destes estudos sugerem que as células endoteliais, que revestem os vasos sanguíneos são alvo para a melatonina circulante e medeiam a regulação do tônus vascular, em condições fisiológicas, e da interação neutrófilo-endotélio, em resposta a um estímulo injuriante. O óxido nítrico produzido pelas células endoteliais é um dos responsáveis por grande parte dos eventos vasculares, e a melatonina inibe a produção de óxido nítrico em diversos modelos. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da melatonina na produção de óxido nítrico induzido por bradicinina em células endoteliais em cultura. Para tanto, utilizamos uma técnica de cultura primária de células endoteliais de rato e através de um marcador fluorescente de óxido nítrico intracelular, mensuramos a fluorescência em microscópio confocal. Foi verificado que a melatonina e seu precursor N-acetilserotonina inibem a produção de óxido nítrico induzido por bradicinina e este efeito não ocorre pela inibição do aumento de cálcio que induz a produção de óxido nítrico. O análogo de receptores MT2 (4P-PDOT) e MT3 (5-MCA-NAT) não provocaram qualquer alteração sobre o aumento de óxido nítrico induzido por bradicinina, e a utilização do antagonista de receptores MT1 e MT2 (luzindol) não reverteu o efeito inibitório da melatonina. Portanto, nossos dados indicam que o efeito da melatonina sobre a atividade da NOS constitutiva não é mediado por receptores de membrana. Considerando que a melatonina é capaz de ligar-se à calmodulina, inibindo desta maneira a atividade da NOS endotelial constitutiva, poderíamos sugerir que este seria o mecanismo de ação. No entanto, é preciso ressaltar que tal atividade não é comprovada para a N-acetilserotonina, assim, apesar de ser este um possível mecanismo de ação, há a necessidade de demonstrar que a N-acetilserotonina está se ligando a calmodulina extraída de células endoteliais. Em resumo, neste trabalho mostramos que a melatonina em concentrações compatíveis com o pico noturno encontrado na circulação, pode modular eventos vasculares no organismo, através da inibição da produção de óxido nítrico em células endoteliais induzida por bradicinina. / Melatonin, the hormone synthesized by the pineal gland at night, signalizes darkness and modulates, in a circadian basis, blood vessels activity. Previous studies suggest that endothelial cells are the target for circulating melatonin and mediate changes in vascular tone and leukocyte-endothelial adherence properties. Melatonin effects can be mediated by several pathways, such as G protein-coupled receptors (MT1 and MT2 receptors), a putative membrane receptor, most probably an enzyme-binding site (MT3 receptor), and several intracellular mechanisms, including calmodulin binding and inhibition of constitutive and induced nitric oxide synthase. The aim of the present study was to characterize melatonin effect on the production of nitric oxide by bradykinin-stimulated endothelial cells in culture. Nitric oxide production was measured in real time at cellular level by detecting fluorescent stimulation of the probe DAF by confocal microscopy. After determining the ideal conditions for recording cumulative dose-response curves for bradykinin (1 – 100 nM) the effect of pre-incubated (1 min) melatonin and analogs was evaluated. Melatonin and its precursor, N-acetylserotonin, but not the selective ligands for receptors MT2 (4P-PDOT) and MT3 (5-MCA-NAT) receptors inhibited bradykinin-stimulated nitric oxide production. This effect was not blocked by the classical antagonist of MT1 and MT2 receptors, luzindol; excluding therefore the participation of membrane receptors. Taking into account that melatonin inhibits calmodulin activation of several enzymes, including constitutive nitric oxide synthase in brain and cerebellum, it could be suggested a similar mechanism for endothelial cells. However, this hypothesis is discussed taking into account that N-acetylserotonin was shown to do not bind neural cells calmodulin. In addition, here we discuss the relevance of the present finding according to physiological and physiopathological roles of endothelial nitridergic system. This analysis point melatonin modulation of constitutive nitric oxide synthase activity as a putative mechanism for explaining melatonin control of vascular tone.

A melatonina é produzida pela glândula pineal somente durante o escuro e atinge rapidamente a circulação, além disso, outros tecidos e células são capazes de produzir melatonina. As células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes alvos para as ações da melatonina. O entendimento dos mecanismos de ação pelos quais a melatonina desenvolve seus efeitos sobre as células endoteliais, possibilitaria o uso desta indolamina e de seus análogos como uma importante ferramenta farmacológica. No presente trabalho, demonstramos que a melatonina em concentrações compatíveis com as encontradas na circulação durante o pico noturno de produção pela pineal, atua sobre as células endoteliais inibindo a produção de NO proveniente da enzima constitutiva (eNOS), enquanto altas concentrações de melatonina, que podem ser atingidas por exemplo pela produção por células imunocompetentes ativadas, inibem a produção induzida de NO mediada pela iNOS. A melatonina (1 nM) inibe a produção constitutiva de NO induzida por agonistas que atuam através da ativação de receptores acoplados à proteína G (histamina, carbacol e ATP/P2Y), e este efeito deve-se à inibição do aumento de [Ca2+]i por liberação de estoques intracelulares, sendo independente da ativação de receptores de melatonina. A melatonina inibe os efeitos decorrentes da produção de NO induzida por bradicinina como a produção de GMPc por células endoteliais e a vasodilatação de arteríolas \"in vivo\". A melatonina inibe a produção de NO induzida por LPS também de maneira independente da ativação de seus receptores, porém, em concentrações muito maiores (1-10 µM) do que a necessária para inibir a produção constitutiva. Estes efeitos devem-se à inibição da expressão da enzima iNOS por impedir a translocação do NF-kB ao núcleo. A vasodilatação de aortas induzida por LPS também é inibida por melatonina. Podemos concluir até o momento que as células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes sensores para as ações da melatonina e podem auxiliar no melhor entendimento do conceito \"eixo imune-pineal\". Os estudos sobre os mecanismos pelos quais a melatonina atua em condições fisiológicas e fisiopatológicas são essenciais para se conhecer o potencial terapêutico da melatonina. / Melatonin, the darkness hormone, produced at night by the pineal gland, is also synthesized in a non-rhythmic manner by other cells. Pineal and extra-pineal melatonin reaches endothelial layer, and the understanding of its mechanism of action will improve the possibilities of using this indolamine and derivates as pharmacological tools. Here we showed that melatonin, in concentrations compatible to nocturnal melatonin surge impairs the activity of eNOS, while much higher concentrations, which can be attained by activated immune competent cells, impair the induction of iNOS synthesis. As a consequence of inhibiting eNOS we showed that melatonin inhibits vasodilation of the microcirculation induced by bradykinin. The inhibitory effect of melatonin is observed only when eNOS is activated by triggering G protein-coupled receptors (bradykinin B2, muscarinic and P2Y purine receptors). Activation of eNOS by calcium-channel operated receptors (P2X) is not blocked by melatonin. Inhibition of the transcription of iNOS results in inhibition of the LPS-induced vasodilation of rat aorta. As a matter of fact, here we show that LPS effect is dependent on the endothelial layer. The mechanism of action of melatonin in inhibiting iNOS transcription is due to block of the NF-kB pathway. Our work contributed to unravel the role of endothelium cells as targets for melatonin and as a key player in the \"immune-pineal axis\". The understanding of the concentrations ranges reached by endogenous production, i.e., the discrimination between the levels achieved during physiological and physiopathological responses, are essential for using these substances as analogous therapeutical tools.