L’étude qui suit est une caractérisation de certains mutants chez Saccharomyces cerevisiae qui augmentent le « shedding » de l’endopeptidase Yps1, localisée à la surface externe de la membrane plasmique, dans les radeaux lipidiques, via un ancrage GPI. Ces mutants relâchent une forme de plus haut poids moléculaire de Yps1p dans le milieu extracellulaire. L’objectif du projet était donc de caractériser 5 mutants selon plusieurs critères : la dépendance de l'activité de Yps1p pour son « shedding », l’association aux radeaux lipidiques, la composition des ancrages GPI et la présence de radeaux lipidiques. Notre étude a mis en évidence que le « shedding » des protéines GPI chez la levure ne dépend pas simplement de l'activité de Yps1p, mais que selon certaines conditions des phospholipases sont également impliquées. Ce mécanisme de clivage de protéines GPI par des phospholipases serait la conséquence du déclenchement d’une voie particulière de l’UPR.

Uma das razões que fazem de Saccharomyces cerevisiae um organismo modelo é o grau de conservação dos mecanismos celulares que existe entre esta levedura e eucariotos superiores. Porém, mesmo após 21 anos do seqüenciamento do seu genoma, ainda existem mais de 600 ORFs com função desconhecida. Neste trabalho, selecionamos quatro delas para o estudo detalhado. MRPL34 (YDR115w) está presente na subunidade maior do ribossomo mitocondrial de levedura e apresenta similaridade com o gene L34 de E. coli e MRP-L34 de humanos. O mutante Δmrpl34 apresenta DNA mitocondrial (mtDNA) instável e para estudá-lo foram gerados alelos sensíveis à temperatura (ts). Com os ensaios de síntese protéica mitocondrial in vivo foi possível identificar clara diminuição da síntese de proteínas do mutante condicional. Mrpl34p foi identificada no extrato ribossomal, conforme esperado. A desestruturação da subunidade maior do ribossomo mitocondrial, utilizando os mutantes ts, nos forneceu indícios sobre intermediários existentes no seu processo de montagem. Verificamos que a porção N-terminal da proteína é responsável pelo endereçamento à mitocôndria. YPR116w também apresenta alta instabilidade do DNA mitocondrial, desta forma, mutantes termossensíveis foram utilizados nos experimentos. Uma das estratégias utilizadas visou a busca de parceiros genéticos. Verificamos que ylr091wp aumenta a estabilidade do mtDNA de ts- ypr116w, sugerindo atividade supressora. Também averiguamos que o alelo ts-ypr16w apresenta menor quantidade de tRNA mitocondrial, através de ensaios de Northen blot. Duas das ORFs escolhidas (YDL119c e YOR022c) tiveram sua caracterização inicial publicada em 2016, refletindo a importância deste tipo de pesquisa. Vimos que a proteína codificada por YDL119c está localizada na membrana interna da mitocôndria e que o mutante Δyor022c apresenta quantidades reduzidas de cardiolipina, quando crescido à 37ºC. / One of the reasons that turn Saccharomyces cerevisiae a model organism is the degree of conservation of cellular mechanisms that exist between this yeast and higher eukaryotes. However, even after 21 years of sequencing their genome, there are still more than 600 ORFs with unknown function. In this work, we selected four of them for the detailed study. MRPL34 (YDR115w) is present in the major subunit of the yeast mitochondrial ribosome and bears similarity to the L34 gene of E. coli and MRP-L34 from humans. The Δ mrpl34 mutant shows unstable mitochondrial DNA (mtDNA) and to study it, temperature sensitive alleles (ts) were generated. With the mitochondrial protein synthesis assays in vivo, it was possible to identify a clear decrease in the protein synthesis of the conditional mutant. Mrpl34p was identified in the ribosomal extract as expected. The disassembly of the major subunit of the mitochondrial ribosome, using the ts mutants, provided us some clues about intermediates in its assembly process. We have verified that the N-terminal portion of the protein is responsible for addressing the mitochondria. YPR116w also shows high mitochondrial DNA instability, in this way, thermosensitive mutants were used in the experiments. One of the strategies used was the search for genetic partners. We verified that ylr091wp increases the stability of ts-ypr116w mtDNA, suggesting suppressor activity. We also found that the ts-ypr16w allele has a smaller amount of mitochondrial tRNA, through Northen blot assays. Two of the chosen ORFs (YDL119c and YOR022c) had their initial characterization published in 2016, reflecting the importance of this type of research. We have seen that the protein encoded by YDL119c is located on the inner membrane of the mitochondria and that the Δyor022c mutant presents reduced amounts of cardiolipin when grown at 37 ºC.

O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da suplementação de levedura autolisada de Saccharomyces cerevisiae fornecida em duas diferentes inclusões em dietas para frangos de corte como alternativa a um antimicrobiano sobre desempenho zootécnico e avaliação do sistema imune intestinal pela realização da enumeração bacteriana, citometria de fluxo e expressão intestinal de genes ligados à resposta imune intestinal. Neste estudo foram utilizados 1260 pintos de corte machos de um dia de idade da linhagem ROSS AP95&reg; em um experimento de 1 a 35 dias de idade alojados em galpão climatizado com cama de casa de arroz nova. O experimento foi realizado em delineamento inteiramente aleatorizado, com 4 tratamentos e 7 repetições, com 45 aves por boxe. Os tratamentos utilizados foram: T1: ração basal e sem aditivo - controle negativo; T2: ração basal suplementada com 55 ppm de bacitracina de zinco - controle positivo; T3: controle negativo + 2 kg/t de levedura autolisada; T4: controle negativo + 4 kg/t de levedura autolisada. As dietas foram à base de milho e farelo de soja, sendo adicionados às rações 5% de farelo de trigo e 5% de farinha de penas e vísceras (sem tratamento prévio) com objetivo de impor um desafio nutricional aos animais. Ainda visando estimular imunologicamente os animais, aos 7 dias de idade, todas as aves foram desafiadas via ocular com uma vacina viva contendo oocistos de Eimeria sp. na dose recomendada pelo fabricante. Aos 8 dias de idade e 21 dias de idade, uma ave de cada unidade experimental, sem jejum prévio, teve sangue coletado e foi sacrificada para coleta de conteúdo intestinal ileal e cecal para realização da emumeração bacteriana de Enterococus sp., Escherichia coli e Lactobacillus sp., e para a coleta do segmento ileal para avaliar a expressão gênica intestinal de Claudin-1, IL-1&beta;, IL-4, TLR4 e MUC-2 através da PCR em tempo real. Em relação ao desempenho das aves, o tratamento T3 propiciou melhor conversão alimentar em relação a T1 até os 21 dias de idade. Para o período cumulativo, o tratamento T4 propiciou conversão alimentar semelhante ao T2, sendo esta variável melhor para estes tratamentos em relação ao controle negativo. Na enumeração de bactérias no íleo, aos 8 dias de idade, os tratamentos T3 e T4 modularam de forma distinta a contagem de Enterococus sp., e para o gênero Lactobacillus sp., ambos os grupos de levedura apresentaram menor contagem em contraste com o controle positivo. No conteúdo do ceco foi encontrado um menor número de E. coli para os animais grupo T3, diferentemente para o T2 que propiciou maior contagem. Aos 21 dias de idade, foi encontrado diferença na enumeração do gênero Enterococus sp. ileal, cuja contagem foi menor para o T2 em relação ao T1. Na na análise de citometria de fluxo, tendências foram observadas aos 8 dias de idade para o percentual de linfócitos T auxiliares (P=0,16) e para o percentual de linfócitos B (P=0,12) havendo redução com a suplementação de levedura autolisada. A mesma tendência (P=0,19) foi observada aos 21 dias de idade para a contagem de células T citóxicos. Sobre a PCR em tempo real, não foram detectadas diferenças para a expressão de Claudin-1. T2 e T4 propiciaram aumento da expressão gênica de IL-1&beta; aos 21 dias de idade em relação ao controle negativo, sendo que T2 também promoveu aumento de TLR-4 aos 8 dias de idade. Tendências foram observadas com a maior expressão de IL-4 (P=0,06) aos 21 dias de idade pelo T2 e aumento na expressão de MUC-2 (P=0,09) pelo T4 aos 8 dias de idade. Os diferentes padrões de ativação ou não de citocinas revela uma estimulação da via Th2 pelo controle positivo (aumento de IL-1&beta; e IL-4) e da via Th17 pelo tratamento suplementado com 4 kg/t de levedura autolisada (aumento de IL-1&beta;). / The objective of this study was to evaluate the effects of a Saccharomyces cerevisiae autolyzed yeast supplementation in substitution of AGP in broiler diets on performance and immune system (on two different feed inclusions for broilers diets in replacing AGP on broiler performance and evaluation of immune system trough bacterial enumeration, flux citometry and intestinal gene expression. For that, 1260 one-day-old male Ross AP95 chicks were raised from 1 to 35 days of age in a poultry house with new rice husk as litter. The experiment was arranged in a completely randomized design with 4 treatments and 7 replications, with 45 birds per pen. The treatments were: T1: basal diet and no additive - negative control; T2: basal diet supplemented with 55 ppm of zinc bacitracin - positive control; T3: negative control + 2 kg/t of autolyzed yeast; T4: negative control + 4 kg/t of autolyzed yeast. The corn-soybean meal based diets contained 5% wheat bran and 5% poultry by-product meal (with no previous treatment) in order to impose a nutritional challenge to the animals. To impose a further immunological challenge, at 7 days of age, all the birds were eye drop-vaccinated with live vaccine containing Eimeira sp. oocysts at the manufacturer recommended dosis. At 8 and 21 days of age, one chick per experimental unit, with no fasting, had the blood collected and was sacrificed for sampling the ileal and cecal intestinal contents for enumeration of Enterococus sp., Escherichia coli and Lactobacillus sp. Also, the ileal segment was sampled for intestinal gene expression of Claudin-1, IL-1&beta;, IL-4, TLR4 e MUC-2 by RNA extraction through real time PCR. For the performance results at 21 days of age, T3 had the same feed conversion rate of T1. For the cumulative grow-out, T4 had the same feed conversion rate as T2, being this variable better for the aforementioned tretaments in comparison to negative control. For ileal bacterial enumeration, at 8 days of age, T3 and T4 modulated distinctly the enumeration of Enterococus sp., and reduced the counts of Lactobacillus sp. in comparison to the positive control. In the cecal contents, the enumeration for E. coli was the lowest for T3, differing from the positive control. At 21 days of age, there was a difference in ileal Enterococus sp., with higher counts for T2 relative to T1. In the flux citometry, tendencies were observed at 8 days of age for T helper cells (P=0,16) and for B cells (P=0,12), which were reduced in the autolyzed yeast treatments. The same tendency (p=0.19) was seen at 21 days of age for T activated cytotoxic cells. For the real time PCR, there was no difference in the expression of Claudin-1 (P<0,05). T2 and T4 promoted upregulation of IL-1&beta; at 21 days of age (P<0,05) in comparison to the negative control; additionally, the antibiotic tretatment also upregulated the expression of TLR-4 at 8 days of age (P<0,05). Tendencies were observed as upregulation of IL-4 (P=0,06) at 21 days of age by positive control and upregulation of MUC-2 (P=0,09) by the treatment with 4 kg/t of autolyzed yeast at 8 days of age. The different profiles in activating or not cytokines reveals a stimulation of Th2 pathway for the positive control (upregulation of IL-1&beta; and IL-4) and Th17 pathway for the treatment supplemented with 4 kg/t of autolyzed yeast (upregulation of IL-1&beta;).

Microrganismos geneticamente modificados (OGMs), obtidos através das técnicas de biologia molecular são amplamente utilizados para as mais diversas finalidades, atingindo o ambiente, solo, águas, animais e até mesmo o Homem. Contudo, o comportamento e o destino destes microrganismos no ambiente, depois que sua função tenha sido completada, e onde estes não podem ser controlados, tem sido objeto de preocupação. Para diminuir os riscos potenciais associados à liberação (acidental ou intencional) dos OGMs no ambiente pesquisadores desenvolveram sistemas de contenção de microrganismos geneticamente engenheirados, baseados na clonagem de genes que codificam proteínas tóxicas, sob regulação de promotores indutíveis (para revisão ver Molin et aI., 1993). Estes sistemas permitem o controle da morte celular em tempo pré-determinado, com a indução do promotor que regula o gene que codifica a proteína tóxica. Contudo, embora as leveduras sejam tão importantes e úteis quanto as bactérias, não existem sistemas suicidas usados para contenção destes microrganismos. No presente trabalho, construímos um sistema suicida para a levedura Saccharomyces cerevisiae o qual apresenta o gene da nuclease de Serratia marcescens clonado sob controle do promotor ADH2GAPDH, que é reprimido por glicose. Desde que a nuclease é capaz de destruir DNA e RNA, tal sistema não permitirá que o material genético do OGM em questão, seja transferido para outros microrganismos, após a morte celular. A atividade da nuclease foi detectada in vivo, através da diminuição da viabilidade dos transformantes de levedura, após o consumo da glicose. Quando leveduras mutantes rad52 foram usadas como células hospedeiras, o efeito letal do plasmídeo foi dramaticamente aumentado. Por outro lado, a atividade da nuclease produzida nos tranformantes de levedura foi analisada in vitro, através da incubação de extratos celulares com DNA plasmidiano mostrando a completa degradação deste em gel de agarose. Além disso, em ensaio de microcosmos, a viabilidade das leveduras portadoras do plasmídeo suicida no ambiente diminuiu drasticamente quando comparada com células controles. Estes resultados mostram que a nuclease de Serratía marcescens é expressa de forma ativa em S. cerevísíae sendo capaz de evitar a permanência dos transformantes de leveduras no ambiente, em laboratório, ou em condições simulando o ambiente, sem a necessidade de um indutor adicional. / Genetic Engineered Microorganisms (GEMs), obtained by molecular biology techniques, are becoming of widespread use for different purposes thus reaching the environment, including soil, water, plants, animais and Man. However, the behavior and fate of these microorganisms after their function has been completed in environments where they cannot be physically contained is a matter of concern. To minimize the potential risks associated with the release (deliberate or accidental) of GEMs in the environment, researchers have developed biological containment systems for bacteria which are based on the cloning of genes coding for toxic proteins, under the regulation of regulatable promoters (for review, see Molin et al., 1993). Such suicide systems allow the predetermined control of cell death from the moment the promoter of the killer gene is switched on. However, even if yeasts are as useful and important in biotechnological processes as bacteria, there is no suicide system described so far for the containment of these microorganisms. In the present work, we constructed a suicide system for the yeast Saccharomyces cerevisiae, consisting of the Serratia marcescens nuclease gene, cloned under the control of the yeast AOH2GAPOH promoter, which is repressed by glucose. Since this nuclease is able to destroy DNA and RNA, such suicide system does not allow the genetic material of the GEM to be transferred to other microorganisms upon cell death. The nuclease activity in S. cerevisiae was detected in vivo, through the decrease in cell viability of the yeast transformants, upon glucose consumption. When yeast rad52 mutants were used as the host cells, the lethal effect of the suicide plasmid was dramatically increased. On the other hand, the activity of the nuclease produced in yeast transformants was analyzed in vitro, by incubation of cell-free extracts with plasmid DNA, showing complete degradation on agarose gels. Furthermore, in microcosmos assays, the viability of the yeast cells carrying the suicide plasmid decreased drastically when compared to control cells. These results showed that the S. marcescens nuclease is expressed in an active form in S. cerevisiae, being able to avoid the maintenance of the yeast transformants, either in the laboratory, or in conditions simulating the environment, without the need of adding any inducer.

O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito protetivo da adição de biomassa de Saccharomyces cerevisiae (SC) residual, obtida da fermentação alcoólica de cana e cerveja contra a passagem de aflatoxina M1 para o leite. Para tanto, foi realizado ensaio preliminar in vitro de remoção de AFB1 em solução tampão fosfato pelas diferentes fontes de biomassa de SC (levedura de cana-de-açúcar seca e inativada, LCSI; levedura autolizada, LA; parede celular, PC; e co-produto de cervejaria parcialmente desidratado, CCPD), em temperatura ambiente pelos tempos de contato de 05, 10, 20 e 30 min. O ensaio in vivo foi realizado por meio de 20 vacas multíparas da raça holandesa que foram selecionadas em estágio médio de lactação. O delineamento experimental consistiu em dez tratamentos, um controle negativo, um controle positivo e dois tratamentos (com e sem inclusão de AFB1) para cada uma das quatro diferentes fontes de SC, durante um período de 10 dias para avaliar a produção e a composição do leite, escore de condição corporal e bioquímica sérica. A análise de amostras de leite para quantificação de AFM1 foi realizada empregando-se coluna de imunoafinidade para purificação associada a CLAE acoplada a espectrômetro de massa triplo quadrupolo. O valor do limite de quantificação de AFM1 foi 0,5 &micro;g kg-1. Amostras de ração foram analisadas para quantificação de AFB1 por meio de coluna de imunoafinidade para purificação associada a CLAE. O valor do limite de quantificação de AFB1 foi de 0,5 &micro;g.kg-1. Através do estudo in vitro foi possível observar que a viabilidade celular não é pré requisito para adsorção e que o tempo de incubação não interfere na capacidade de adsorção de AFB1. No estudo in vivo, não foi observado efeito da AFB1 e nem das diferentes fontes de biomassa de SC sobre o escore de condição corporal, produção e composição do leite. A bioquímica sérica (AST, ALT e PT) avaliada foi similar entre os grupos não intoxicados e intoxicado com AFB1. Os tratamentos LA e PC apresentaram maior capacidade de adsorção de AFB1 em vacas leiteiras previamente intoxicadas. / The aim of this study was to evaluate the protective effect of adding residual biomass of Saccharomyces cerevisiae (SC), obtained from the fermentation of sugarcane and beer against aflatoxin M1 passage into milk. Therefore, preliminary in vitro test of AFB1 removal in phosphate buffer solution by SC different biomass sources (inactive dry yeast sugarcane, IDYS, autolyzed yeast, AY; cell wall, CW and co- brewery partially dehydrated product, CBPDP) at room temperature for contact times of 05, 10, 20 and 30 min was performed. The in vivo assays were performed using 20 multiparous Holstein cows that were selected in mid lactation stage. The experimental design consisted of ten treatments, a negative control, a positive control and two treatments (with and without inclusion of AFB1) for each of four different sources of SC, over a period of 10 days to evaluate the milk yield and composition, body condition score and serum biochemistry. Milk sample analysis for quantification of AFM1 were carried out using an immunoaffinity column for purification associated with HPLC coupled to triple quadrupole mass spectrometer. The limit of quantification for AFM1 was 0.5 &micro;g. kg-1. Feed samples were analyzed for AFB1 quantification by immunoaffinity purification column associated with HPLC. The limit of quantification for AFB1 was 0.5 &micro;g.kg-1. For in vitro study it was observed that the cell viability is not prerequisite for adsorption and the incubation time does not interfere with AFB1 adsorption capacity. For in vivo study, there was no effect of AFB1 nor the different SC biomass sources on body condition score, milk yield and composition. There was no significant difference between the originated AFB1 levels from food samples in different days of the experimental period. Serum biochemical (AST, ALT, TP) evaluated was similar between the control group and intoxicated with AFB1. The AY and CW treatments had higher adsorption capacity in dairy cows previously intoxicated.

Não consta resumo na publicação. / The biological value of the proteins of Saccharomyces cerevisiae grown in sugar cane molasses was studied in rats during 3 generations. The animals were fed two levels of yeast protein either 10% or 25% and compared with casein fed controls. In the first generation the PER and body weight were significantly lower for the animals receiving the yeast in their diet. In the 2rd and 3rd generation the growth was retarded even more in relation to what had been observed for the first one, specially at 10% protein level. A decreased male fertility was also observed at litter born from rats fed either 10% or 25% protein. The digestibility for casein was 90% and 80% for single cell protein.

As peroxirredoxinas (Prxs) são peroxidases dependentes de tiol que catalisam a redução de uma ampla variedade de hidroperóxidos. A atividade catalítica das Prxs é suportada por um resíduo de cisteína catalítico altamente conservado, cuja oxidação pelo hidroperóxido gera o ácido sulfênico (Cys-SOH). Prx1 de Saccharomyces cerevsiae é uma enzima mitocondrial que catalisa a redução do H2O2 gerado no interior da mitocôndria. O mecanismo de redução do ácido sulfênico de Prx1 é uma questão de debate, com a glutarredoxina 2 (Grx2), tiorredoxina 3 (Trx3), tiorredoxina redutase 2 (Trr2) e ascorbato sendo propostos como possíveis redutores. Para avaliar a importância fisiológica de Prx1 na manutenção da homeostase redox mitocondrial, nós investigamos os mecanismos de importação e processamento mitocondrial de Prx1 assim como os de seus possíveis redutores Trr2 e Trx3. Os ensaios de solubilidade e subfracionamento mitocondrial demonstram que Prx1, Trr2 e Trx3 co-localizam na matriz mitocondrial, associadas fracamente com a membrana mitocondrial interna. Além disso, Prx1 apresenta dupla localização, estando presente também no espaço intermembrana mitocondrial possivelmenete na forma solúvel. O mecanismo de importação de Prx1 para o espaço intermembrana envolve a liberação da proteína precursora no interior da bicamada lipídica da membrana interna em decorrência de uma pequena região hidrofóbica localizada imediatamente após a pressequência. Em seguida, a subunidade Imp2 do complexo proteico IMP catalisa a clivagem da região hidrofóbica liberando Prx1 no espaço intermembrana. Durante a importação de Prx1 para a matriz mitocondrial, a enzima é clivada sequencialmente pelas proteases peptidase de processamento mitocondrial (MPP) e octapeptidil aminopeptidase 1 (Oct1). Oct1 catalisa a remoção de oito resíduos de aminoácidos da região N-terminal de Prx1. Esse processamento aumenta a estabilidade de Prx1 no interior da mitocôndria, mas não interfere na sua atividade peroxidásica in vitro. Apesar das enzimas Trr2 e Trx3 não serem clivadas por Oct1, a ausência de Oct1 causa eleavada instabilidade dessas proteínas. O processamento das Prxs por Oct1 parece ser um processo conservado visto que Oct1 de levedura é capaz de clivar a peroxirredoxina mitocondrial humana Prx3 expressa em S. cerevisiae. Estes resultados indicam o envolvimento de Oct1 no processamento das peroxirredoxinas, representando um sistema de controle de qualidade proteico que regula a homeostase das Prxs e, possivelmente, processos redox mitocondriais / Peroxiredoxins (Prxs) are thiol-dependent peroxidases that catalyze the reduction of a wide variety of hydroperoxides. The Prxs catalytic activity is provided by the presence of a highly conserved catalytic cysteine residue whose oxidation by hydroperoxide generates sulfenic acid (Cys-SOH). Saccharomyces cerevsiae Prx1 is a mitochondrial enzyme that catalyzes the reduction of the H2O2 generated endogenously by mitochondria. The mechanism of reduction of Prx harboring Cys-SOH is a matter of debate, with glutaredoxin 2 (GRX2), thioredoxin 3 (Trx3), thioredoxin reductase 2 (Trr2), and ascorbate being proposed as possible reducers. To assess the functional role of Prx1 in maintaining the mitochondrial redox homeostasis, we investigated its mechanisms of import and processing, as well as those ones involved with its possible reducers, Trr2 and Trx3. Assays of solubility and mitochondrial sub-fractionation show that Prx1, Trr2 and Trx3 co-localize in the mitochondrial matrix compartment, being marginally associated with the inner mitochondrial membrane. In addition, Prx1 show dual localization, being also present in the mitochondrial intermembrane space, possibly in their soluble form. The import mechanism of Prx1 to the intermembrane space involves the release of protein\'s precursor within the lipid bilayer of the inner membrane due to a small, hydrophobic region located downstream the presequence. Imp2 subunit of the IMP protein complex then catalyzes the cleavage of the hydrophobic region of Prx1, releasing it to the mitochondrial intermembrane space. During its import into the matrix, Prx1 is sequentially cleaved by the mitochondrial processing-peptidase protease (MPP) and by octapeptidil aminopeptidase 1 (Oct1). Oct1 catalyzes the cleavage of eight amino acid residues from the N-terminal region of Prx1. This process increases stability of Prx1 inside the mitochondria, but does not interfere in its peroxidase activity in vitro. Interestingly, absence of Oct1 causes high instability of Trr2 and Trx3, although these proteins are not cleaved by this protease. Remarkably, the processing of Prxs by Oct1 seems to be a conserved process since yeast Oct1 is able to cleave the human mitochondrial peroxiredoxin Prx3 expressed in S. cerevisiae. Altogether, these results indicate the involvement of Oct1 in the processing of peroxiredoxins, representing a protein quality control system that regulates the homeostasis of Prxs and, possibly, mitochondrial redox processes

O Experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a substituição parcial e total de plasma bovino por levedura hidrolisada na dieta de leitões desmamados no período de 21 a 47 dias de idade. Foram utilizados 1600 leitões da linhagem PIC, distribuídos em blocos ao acaso, com quatro tratamentos. As dietas foram divididas em quatro fases (pré-inicial I 22 a 28 dias; pré-inicial II 29 a 35 dias; inicial I - 36 a 47 dias e inicial II 48 a 63 dias). A inclusão percentual, Plasma: Levedura, nas dietas foi: T1 (6:0; 4:0; 2:0 e 0:0); T2 (3: 4; 2: 3; 1: 2 e 0: 0); T3 (1,5: 6; 1: 4,5; 0,5: 3 e 0: 0) e T4 (0: 8; 0: 6; 0: 4 e 0: 0). Cada tratamento teve 10 repetições (cinco de machos e cinco de fêmeas) totalizando 40 unidades experimentais com 40 animais cada. As variáveis zootécnicas avaliadas durante o período experimental foram: consumo de ração, ganho de peso, e conversão alimentar. Foram tomadas amostras de sangue de 5 animais por tratamento no dia de início do experimento, e de 10 animais por tratamento 25 dias depois. Foram quantificadas a IgA e a IgG. Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância ANOVA, utilizando-se o teste Tukey para comparação das médias ao nível de significância de 5% utilizando o pacote estatístico SAS. Não houve diferença estatística nas quantidades de Ig A e Ig G circulante, nem na variação destas imunoglobulinas no tempo, entre os tratamentos. Considerando a análise dos dados conclui-se que nas condições estudadas, a utilização da relação percentual de (1,5: 6; 1: 4,5; 0,5: 3 e 0: 0) de plasma: levedura hidrolisada resultou um maior consumo de ração e ganho de peso dos animais, em comparação às outras proporções, e consequentemente podendo trazer um maior lucro para o produtor / The experiment was performed with the objective of evaluating the partial and complete substitution of bovine plasma for hydrolyzed yeast in the diet of weaned piglets from 21 to 47 days old. 1600 piglets of PIC lineage were used and randomly distributed in blocks where they received four treatments. Their diets were divided into four phases (pre-initial I: 22 to 28 days; pre-initial II- 29 to 35 days; initial I- 36 to 47 days and initial II-48 to 63 days). The percentage inclusion Plasma:Yeast in the diets were: T1 (6:0; 4:0; 2:0 and 0:0); T2 (3: 4; 2: 3; 1: 2 and 0: 0); T3 (1.5: 6; 1: 4.5; 0.5: 3 and 0: 0) and T4 (0: 8; 0: 6; 0: 4 and 0: 0). Each treatment had 10 repetitions (five times with the males and five times with the females), totaling 40 experimental units with 40 animals each. Husbandry variables evaluated during the trial period were: feed intake, body weight gain and feed conversion. Blood samples of 5 animals per treatment were taken at the beginning of the experiment day, and 10 animals per treatment 25 days later. IgA and IgG were quantified. The data obtained were analyzed by ANOVA analysis of variance, using the Tukey test to compare means at the 5% significance level, using the statistical package SAS. There was no statistical difference in the quantities of Ig A and Ig G circulating, or the variation of these immunoglobulins in the time, between treatments. Considering the analysis of the data it was concluded that the conditions studied, the percentage utilization ratio of (1.5: 6; 1: 4.5: 0.5: 3 and 0: 0) plasma: hydrolyzed yeast resulted in a higher feed intake and weight gain of animals compared to other proportions, and consequently can bring higher profits to the producer

O etanol se consagrou como o principal biocombustível e o Brasil detém o processo mais econômico e ambientalmente adequando. O processo industrial brasileiro é único, pois utiliza o reciclo de células de leveduras na fermentação permitindo uma ótima velocidade de fermentação, porém o mesmo ato potencializa os efeitos tóxicos presentes no processo. O substrato de fermentação é composto pela mistura de caldo e melaço de cana-de-açúcar, porém a vantagem econômica do açúcar sobre o etanol faz com que o caldo seja priorizado para a produção de açúcar e o seu subproduto seja mais utilizado na fermentação, nesse caso o melaço. O melaço apresenta diversos compostos inibitórios como sulfitos, excesso de sais, fenóis, furfurais e metais. Devido à larga escala do processo, o substrato não pode ser esterilizado antes da fermentação, logo a presença de microrganismos contaminantes se torna um problema sempre presente. As bactérias contaminantes consomem o substrato e produzem substâncias tóxicas como ácidos orgânicos, fatos que prejudicam o rendimento fermentativo do processo. Quando se considera o longo período de reciclos (aproximadamente 250 dias por safra e pelo menos 2 ciclos por dia) a maioria das linhagens de leveduras empregadas não são capazes de perdurar no processo, seja pela toxicidade do processo e ou pela competição com contaminantes. Portanto há um esforço contínuo no sentido de se buscar novas linhagens mais aptas ao processo industrial. Para tal é imperiosa a disponibilidade de uma metodologia para simular o processo industrial de modo a permitir uma avaliação de pretensas linhagens quanto ao seu desempenho no processo industrial com reciclo de células. No presente trabalho é proposto um protocolo, simulando as várias condições estressantes de uma fermentação industrial com reutilização de células, para a avaliação de linhagens de levedura com diferentes capacidades de colonizarem as dornas de fermentação. Os resultados obtidos mostraram que o protocolo empregado foi capaz de reproduzir o comportamento fisiológico e tecnológico das linhagens quando submetidas no processo industrial, se constituindo numa ferramenta útil para a seleção de leveduras. / The ethanol became entrenched as the main biofuel and Brazil owns the most economic and environmentally appropriate process. The Brazilian industrial process is unique, since it utilizes the yeast cell recycle, what allows a great fermentation velocity, but the same process enhances the toxics effects presents on the process. The fermentation subtract is composed by the mixture of sugar cane juice and molasses, however the economic advantages of the sugar over the ethanol makes that the juice get prioritized to the production of sugar and it\'s by-product, the molasses, go into the fermentation process. The molasses contain several toxic compounds, like sulfites, salts excess, phenols, furfural and metals. Due to the large scale of the process, the substrate cannot be sterilized before the fermentation and this cause the presence of contaminant microorganisms an always present problem. The contaminant bacteria consumes the substrate and produce toxics products like organic acids, facts that can hinder the yield of the fermentation process. When the long recycle period (approximately 250 days per season, with at least 2 cycles per day) is take in consideration, most of the yeast strains aren\'t capable to endure the process because of the toxicity of it and or by the competition with the contaminants. Therefore there is a continuous effort in the search of new strains best suited for the industrial process. To do so, it`s imperative the availability of a methodology that can simulate the industrial process and the alleged strains can be evaluated in terms of their performance in the industrial process with cell recycle. It`s proposed a protocol on this work, that simulates several stressful conditions of an industrial fermentation with cell recycle, to evaluate the yeast strains with different capabilities in colonize the fermentation tanks. The results indicate that the protocol utilized was capable of reproduce the physiological and technological behavior of the strains when they were submitted to the industrial process, making it a useful tool for yeast selection.

O exossomo é um complexo constituído por até 11 subunidades (Rrp4p, Rrp6p, Rrp40p, Rrp41p, Rrp42p, Rrp43p, Rrp44p, Rrp45p, Rrp46p, Csl4p, Mtr3p) que possui atividade exorribonucleolítica 3`&#8594;5` e está envolvido no processamento e degradação de vários tipos de RNAs na célula eucariótica. O complexo tem sido estudado em diversos organismos, como leveduras, insetos, plantas, humanos e também em várias espécies de archaea. Apesar da conservação da estrutura do exossomo ao longo da evolução e de oito subunidades do exossomo eucariótico apresentarem domínios de RNase, apenas duas proteínas, Rrp6p e Rrp44p têm atividade catalítica. A despeito da importância do exossomo para a célula, ainda não está claro o papel de cada subunidade na atividade do complexo. Neste trabalho foram utilizados mutantes da subunidade Rrp43p a fim de avaliar como mutações pontuais nesta subunidade afetam a montagem e estabilização do complexo do exossomo de Saccharomyces cerevisiae. Ensaios de purificação do exossomo com TAP-Rrp43p revelaram que os mutantes co-purificam Mtr3p e Rrp44p menos eficientemente. Além disso, os mutantes também apresentam atividade exorribonucleolítica 3`&#8594;5` reduzida, indicando que o defeito na montagem do complexo pode afetar a sua atividade enzimática. / The exosome is a protein complex comprised of up to eleven subunits (Rrp4p, Rrp6p, Rrp40p, Rrp41p, Rrp42p, Rrp43p, Rrp44p, Rrp45p, Rrp46p, Csl4p and Mtr3p) that has 3`&#8594;5` exoribonucleolytic activity and is involved in degradation and processing pathways of several kinds of RNA in eukaryotes. This complex has also been identified in several organisms, such as yeast, insects, plants, humans and also many species of archaea. Despite the overall structure conservation of the complex throughout evolution and eight of the eukaryotic exosome subunits displaying RNase domains, only two proteins, Rrp6p and Rrp44p have catalytic activity. Although the exosome has been shown to be involved in many different aspects of RNA metabolism, the role that each subunit plays in the activity of the complex has not yet been determined. In this work we used of TAP-purified exosome complexes to study the effect of Rrp43p mutations on the assembly and stabilization of the complex in Saccharomyces cerevisiae. Co-immunoprecipitation assays revealed that Rrp43p mutants co-purify Mtr3p and Rrp44p subunits less efficiently. Besides, Rrp43p mutants also present decreased activity, indicating that an assembly defect may affect its enzymatic activity