Orientador : Silvia das Graças Pompolo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T09:01:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_SoniaMariadaSilvaRocha_D.pdf: 3918889 bytes, checksum: 6f04545ad09274b3180ac5e58c80507b (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Das 13 espécies de Trypoxylon com número cromossômico conhecido, somente T. albitarse possui cromossomos B, os quais são totalmente heterocromáticos e podem apresentar-se em dois tipos morfológicamente distintos, um metacêntrico e um acrocêntrico. Ao longo dos últimos cinco anos (1996 a 2000), 1003 espécimens de T. albitarse provenientes de 692 ninhos foram estudados citogeneticamente com relação à ocorrência, distribuição, frequência e evolução de seus cromossomos B e muitos destes indivíduos foram submetidos às técnicas de hibridação in situ fluorescente (FISH) ou impregnação por nitrato de prata para localização dos genes ribossômicos e estudo dos nucléolos, respectivamente. Todos os espécimens analisados foram obtidos em diferentes populações naturais na Zona da Mata Mineira, das quais 11 estão localizadas no município de Viçosa (Amoras, Campus, Centro, Marrecos, Palmital, Paraíso, Silvestre, Vila Cristal, Vila Chaves, Fundão e Barrinha), duas no município de Cajuri (Cajuri e Arraial Paraguai), uma no município de Coimbra (Coimbra), uma no município de Porto Firme (Nova Ilha) e uma no município de Piranga (piranga). Com exceção da populaçao de "Centro", as oito primeiras populações de Viçosa e a população de Porto Firme foram amostradas em dois intervalos de tempo diferentes (1996-1998 e 1998-2002), enquanto as populações dos municípios de Cajuri, Coimbra e Piranga, assim como as populações viçosences de Fundao e Barrinha, foram estudadas apenas na segundo amostragem. Os resultados obtidos na primeira etapa de coletas revelaram que, em maior ou menor freqüência, todas as populações analisadas possuem cromossomos B. Entre as populações de Viçosa, a grande maioria das fêmeas e machos analisados portaram um cromos somo B por genoma haplóide, ou seja, a mesma dosagem dos cromossomos do complemento A. Por outro lado, na única população analisada em Porto Firme, somente 14.3% dos indivíduos apresentaram cromossomos B. Considerando que uma das principais características dos cromossomos B é seu modo de transmissão não-mendeliano, a possibilidade de que, em Viçosa, os cromos somos B de T. albitarse estivessem regularizando seu comportamento meiótico e, conseqüentemente, alcançando sua estabilização como um membro normal do complemento cromossômico, foi postulada. Na tentativa de testar esta hipótese, o processo de estabilização dos cromossomos B foi estatisticamente quantificado em todas as populações analisadas. Em Porto Firme, o índice de estabilização (SI) dos B foi bastante baixo, indicando uma invasão recente. Não obstante, em Viçosa, o SI foi igual a 100% em três diferentes populações, onde todos os indivíduos portavam um B por genoma haplóide e indicou uma forte tendência à estabilização dos B nas demais populações. Um estudo comparativo desses dados com os obtidos no seguinte período de amostragem forneceram evidências diretas do processo invasivo dos B em Porto Firme, onde a frequência de Bs aumentou drasticamente. Entretanto em Viçosa, a despeito do aumento em frequência do tipo metacêntrico e da significativa reduçao do tipo acrocêntrico em várias populações, a frequência geral de cromossomos B permaneceu estável. As novas populações analisadas, mostraram uma frequência de Bs e parametros de estabilidade semelhantes aos observados em Viçosa, indicando que se encontram em um estágio evolutivo similar, com a maioria dos indivíduos portando um cromos somo B por genoma haplóide e altos valores de SI. A técnica de FISH com sonda de rDNA não revelou a presença de genes ribossômicos nos cromos somos B, não obstante, demonstrou que, em T. albitarse, os genes ribossômicos estão localizados em toda extensão do braço heterocromático do cromossomo 14. Embora a técnica de impregnação por prata não tenha sido efetiva na localização cromossômica da NOR ativa, foi aplicada com bastante exito na quantificação da atividade nucleolar nos núcleos interfásicos de machos e fêmeas de T. albitarse, mostrando que, a despeito da grande variabilidade no tamanho do 'braço ribossômico' em machos e fêmeas dessa espécie, a atividade nuc1eolar é proporcional ao nível de ploidia dos indivíduos / Abstract: Among the 13 cytogenetica1ly analysed species of Trypoxylon genus, only T. albitarse possess B chromosomes. Two types morphologically distinct of B chromosomes have been found in this wasp, one metacentric and other acrocentric, which are totally heterochromatic. Over the last five years (1996 the 2000), 1003 specimens of T. albitarse obtained from 692 nests, had been cytogenetically studied with respect to the occurrence, distribution, frequency and evolution of its B chromosomes. Many of these individuals had been subjected to techniques of fluorescent in situ hybridisation (FISH) or silver nitrate staining for location of ribosomal genes and nucleoli, respectively. All analysed individuals were collected in different natural populations in the Zona da Mata Mineira (Minas Gerais State, Brazil), of which 11 are located in the city of Viçosa (Amoras, Campus, Centro, Marrecos, Palmital, Paraíso, Silvestre, Vila. Cristal, Villa Chaves, Fundão and Barrinha), two in the city of Cajuri (Cajuri and Arraial Paraguai), one in the city of Coimbra (Coimbra), one in the city of Porto Firme (Nova Ilha) and one in the city of Piranga (piranga). Besides the Centro population, the eight first populations from Viçosa and the population of Porto Firme were sampled twice (1996-1998 and 1998-2002), while the populations located in Cajuri, Coimbra and Piranga, as well as Fundao and Barrinha (Viçosa), were studied only included in the second sampling. The results observed in the first stage of collections have revealed that, although in different frequency, all analysed populations possess B chromosomes. Among the Viçosa's populations, most bore females and males carried a B chromosome per haploid genome, the same dosage of standard (A) chromosomes. On the other hand, in Porto Firme, only 14.3% of individuals carried B chromosomes. Because one of the most conspicuous features of B chromosomes is their non-mendelian transmission mode, we hypothesized that at least in Viçosa, the B chromosomes of T. albitarse were regularizing their meiotic behaviour and, consequently, reaching their stabilization as a normal member of the normal chromosomal complement. To test this hypothesis, the stabilization process of B chromosomes was statistically quantified in all populations. In Porto Firme, the stabilization index (SI) of the B was sufficiently low, indicating a recent invasion. On the other hand populations from Viçosa carried a B per haploid genome, the SI value was equal to 100% while the other populations indicated a strong trend toward the stabilization of B chromosomes. A comparative analysis performed with both set of data (obtained in the first and second period of sampling) had supplied direct evidences of the invasive process of B in Porto Firme, where the B frequency has increased significantly. However in Viçosa, in spite of the increase in the metacentric B frequency and the significant reduction, in some populations, in the acrocentric B frequency, the general frequency of B chromosomes remained stable. The additional populations sampled showed B frequency and stability parameters similar to these observed in the Viçosa region, indicating that they are in a similar evolutionary stage, with most individuals carrying one B per haploid genome and high SI values. Fluorescent in situ hybridization (FISH) showed all ribosomal genes located in the heterochromatic arm of chromosome 14. The silver impregnation method was successfully applied in the nuc1eolar activity quantification of interfasic nuc1ei in males and females of T. albitarse. These results suggested that, despite the great variability in the size of ribosomal arm in this species, nuc1eolar activity is adjusted to the ploidy level / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Shirlei Maria Recco-Pimentel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T18:27:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lourenco_LucianaBolsoni_M.pdf: 5059026 bytes, checksum: 948a2fa57b0e7f0d6ab3080a3ff34b34 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Foram analisados citogeneticamente sessenta e um espécimes de Physalaemus petersi e sete de Edalorhina perezi (Leptodactylidae, Anura), provenientes do Estado do Acre, Brasil, com o intuito de contribuir para as investigações sobre possíveis relações filogenéticas entre esses dois gêneros neotropicais. As preparações cromossômicas foram obtidas de suspensões de células intestinais e de testículo e foram coradas convencionalmente com Giemsa ou submetidas aos métodos Ag-NOR e de bandamento C. A análise morfométrica dos cromossomos de vinte e nove metáfases mitóticas, obtidas dos sete espécimes de Edalorhina perezi coletados (duas fêmeas e cinco machos), mostrou que todos esses indivíduos apresentam 2n=22. Os onze pares cromossômicos são homomórficos, sendo seis metacêntricos (pares 1, 5, 6, 9, 10 e 11), quatro submetacêntricos (pares 2, 4, 7 e 8) e um subacrocêntrico (par 3). Foi detectado apenas um par de NOR por genoma diplóide, localizado no braço longo dos cromossomos do par 8, nas preparações cromossômicas de seis indivíduos, tratadas pelo método Ag-NOR. A técnica de bandamento C, aplicada ao material referente a dois desses indivíduos, evidenciou que essa NOR é circundada por blocos de heterocromatina constitutiva, também presentes no centrômero de todos os cromossomos. Bandas heterocromáticas menos nítidas foram detectadas no braço curto dos cromossomos do par 1 e no braço longo dos cromossomos do par 2. A análise da meiose de dois machos detectou cadeias de bivalentes interligados em espermatócitos I, aparentemente formadas por três grandes pares cromossômicos, sugerindo a presença de translocações heterozigotas múltiplas. Embora todos os espécimes de Physalaemus petersi estudados apresentem 2n=22, dois cariótipos distintos foram encontrados dentre eles, o que sugere uma reavaliação desse táxon. O cariótipo mais comum é formado por quatro pares cromossômicos metacêntricos (1, 5, 6 e 10), quatro submetacêntricos (2, 4, 7 e 9), dois subacrocêntricos (3 e 8) e um par de cromossomos sexuais XXIXY, como mostrou a análise morfométrica de vinte e seis metáfases de dez indivíduos. Dentre o grupo de indivíduos portadores desse cariótipo foi observada grande variabilidade interindividual no padrão de distribuição de NOR e de segmentos heterocromáticos. A análise de bivalentes de espermatócitos na primeira divisão da meiose mostrou que pares cromossômicos heterozigotos para segmentos heterocromáticos nãocentroméricos não apresentam quiasma nessas regiões cromossômicas. O outro cariótipo foi observado em apenas 3 machos da Reserva Extrativista do Alto Juruá, cujo canto também difere daquele apresentado pelos demais exemplares de Physalaemus petersi. Esse cariótipo é composto por seis pares cromossômicos metacêntricos (2, 3, 4, 7, 8 e 10), dois submetacêntricos (5 e 9), dois subacrocêntricos (1 e 6) e um par heteromórfico, formado por um cromossomo submetacêntrico e um metacêntrico. A relação desse par heteromórfico com a determinação do sexo não pode ser elucidado, visto que nenhuma fêmea com esse cariótipo foi analisada. O método Ag-NOR permitiu observar dois padrões de distribuição de NOR, que envolvem dois pares cromossômicos (8 e 9). O bandamento C realizado no material obtido de um desses espécimes evidenciou a presença de heterocromatina constitutiva em todos os centrômeros desse cariótipo e nos telômeros dos cromossomos dos pares 4 e 8 e em um dos telômeros de um cromossomo 9. Configurações meióticas multivalentes foram observadas em exemplares de P. petersi dos dois grupos cariotípicos encontrados, sugerindo a participação de translocações na evolução desses cariótipos. Esse tipo de rearranjo pode estar envolvido, inclusive, na formação dos diferentes padrões de distribuição de NORs e bandas heterocromáticas / Abstract: Sixty one specimens of Physalaemus petersi and seven of Edalorhina perezi (Leptodactylidae, Anura) from Acre State, Brazil, were studied, to contribute to phylogenetic relationship studies between these two neotropical genera. Chromosome preparations were obtained from cellular suspensions of testis and intestinal epithelium. These cytological preparations were conventionally stained by Giemsa or submitted to Ag-NOR and C-banding techniques. Morphometric analyses of twenty nine mitotic metaphases chromosomes from the specimens of E. perezi (two females and five males), showed that ali these individuais present 2n=22. The eleven chromosome pairs of this karyotype are homomorphic, being six metacentric (pairs 1, 5, 6, 9, 10 and 11), four submetacentric (pairs 2, 4, 7 and 8) and one subacrocentric (pair 3). Only one pair of NOR per diploid genome of chromosome preparations obtained from six specimens was detected and this was located interstitially in the long arm of pair 8. The C-banding techniques, applied to cells from two of these specimens, showed that this NOR is surrounded by constitutive heterochromatin blocks, also present at the centromere of ali the chromosomes. Gray heterochromatic bands were detected in the short arm of chromosome pair 1 and in the long arm of pair 2. Analyses of meiotic chromosomes of two males detected multivalent chains in spermatocytes I, apparently formed by three long chromosome pairs, indicating the ocurrence of heterozygous translocations in this karyotype. Ali the specimens of P. petersi studied present 2n=22, but two distinct karyotypes were detected among them. These findings suggest a re-evaluation of the taxon P. petersi. The most commom karyotype presents four metacentric (1, 5, 6 and 10), four submetacentric (2, 4, 7 and 9), two subacrocentric chromosome pair (3 and 8) and one pair of sex chromosomes xx/XY. Among the groups of specimens with this kind of karyotype, a big interindividual variability of NOR and heterochromatic band patterns was observed. The analysis of spermatocytes I bivalents showed that chromosome pairs which are heterozygous to non-centromeric heterochromatic bands do not present chiasma at these chromosome regions. The other karyotype was observed in only three males, whose call also differs from that of most commom specimens of P. petersi. This karyotype is formed by six metacentric (2, 3, 4, 7, 8 and 10), two submetacentric (5 and 9), two subacrocentric (1 and 6) and one heteromorphic chromosome pairo The relation of this pair with sex determination could not be elucidated, because no female with this karyotype was found. The Ag-NOR method showed two patterns of NOR distribution, which involve two chromosome pairs (8 and 9). The Cbanding technique applied to material obtained from one of these specimens showed the presence of constitutive heterochromatin at ali the centromeres of this karyotype, in the telomeres of the chromosomes of the pairs 4 and 8 and at one of the telomeres of one pair 9 chromosomes. Multivalent configurations were observed in meiotic prophase I of both karyological groups of P. petersi, suggesting the involvement of translocations in the evolution of these karyotypes. This kind of rearrangement can be involved in the origin of different NOR patterns and heterochromatic band distribution / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Konradin Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-21T22:13:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Neder_Fatima_M.pdf: 6673289 bytes, checksum: 387ff07bef49552d9e818ac22bbe569d (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: As regiões organizadoras do nucléolo (NORs) são áreas de DNA extra ou intranucleolares, contendo genes que codificam o RNA ribossomal. Estas regiões têm grande afinidade com a prata, em virtude da presença de proteínas não- histonas associadas ao RNA ribossomal e, por isso, são chamadas de AgNORs. o estudo das AgNORs tem sido utilizado predominantemente para avaliar proliferação celular, distinguir tumores malignos, de benignos, e como indicador prognóstico em neoplasias. Entretanto, a grande variedade de métodos utilizados para medir ou contar AgNORs, nos diferentes estudos, toma dificil a comparação de resultados. A escassez de trabalhos que avaliem a morfologia e a evolução das AgNORs em tecidos normais em desenvolvimento, e a falta de estudos ultra-estruturais sobre estas regiões, que poderiam contribuir para uma padronização de sua contagem, estimulou-nos a essa pesquisa.. O tecido escolhido para o estudo foi o do miocárdio de ratos em desenvolvimento intra e extra-uterino. Utilizamos o ventrículo esquerdo do coração de 95 ratos, entre o 16Q dias após a concepção e 60Q dias pós-parto, subdivididos em dois grupos: a) 16, 19 e 21 dias de vida pré-natal e b) 1,5, 8, 21 e 60 dias de vida pós-natal. Para o estudo em microscopia óptica (M. O.) utilizamos 74 animais e, para a microscopia eletrônica (M.E.), 21. O material para M. O. foi fixado em formalina tamponada 10% durante 1 hora e incluído em parafina. Os cortes de 31lm foram desparafinados e corados pela técnica de AgNOR, descrita por CROCKER & NAR (1987). Como não encontramos na literatura uma técnica para evidenciar as estruturas das AgNORs em microscopia eletrônica, desenvolvemos um procedimento novo, empiricamente, no qual não utilizamos tetróxido de ósmio, acetato de uranila e citrato de chumbo, com o intuito de assegurarmos que qualquer precipitação elétron-densa poderia ser atribuída a prata. As AgNORs foram subdivididas em "clusters" (que correspondem ao nucléolo) e pontos ("dots"). O estudo ultra-estrutural mostrou que, o "cluster" é constituído por um conjunto de precipitações de prata, interligadas entre si por faixas mais claras, dentro de uma matriz pouco elétron-densa. O "dot" é apenas uma precipitação escura, sem matriz. A partir destas observações, adotamos o critério de contar o cluster (nucléolo) como uma unidade, visto que a contagem individual de precipitações de prata, dentro dele, pareceunos pouco reproduzível e arbitrária. Os cardiomiócitos dos ratos fetais (16, 19 e 21 dias) e com 1,5 dias após o nascimento apresentaram um índice maior de "clusters" de AgNORs de grande tamanho, quando comparados com os de animais de 8, 21 e 60 dias após o nascimento. Esta diferença provavelmente está relacionada à atividade proliferativa da célula, que é maior na vida intra-uterina. O aparecimento de maior quantidade de "dots", nos animais com 60 dias de vida após o nascimento, foi interpretado como provável indicador de nova síntese protéica, necessária para o complexo miofibrilar. Qualitativamente, entre as idades de 16, 19 e 21 dias de vida intra-uterina e 1,5 dias pós-natal e entre 8, 21 e 60 dias após o nascimento, dificilmente conseguimos distinguir diferenças na estrutura morfológica dos "clusters" das AgNORs. Podemos observar diferenças em relação ao tamanho dos "clusters" das AgNORs, em todas as idades, com análise quantitativa. Em determinados núcleos dos cardiomiócitos, encontramos duas, três ou mais AgNORs alinhadas, o que chamamos de fenômeno de alinhamento. Nas idades de 1<6, 19 e 21 dias de vida intra-uterina e 1,5 pós-natal foi encontrada uma baixa porcentagem das AgNORs alinhadas, enquanto nos núcleos dos animais com 8, 21 e 60 dias ap'os o nascimento, o alinhamento das AgNORs apresentou maior freqüência e quantidade. A análise discriminante mostrou, para a separação das idades, que: a. os números dos núcleos com alinhamento das AgNORs, têm, em geral, importância maior que os números médios das AgNORs (57,3). b. dentro das variáveis que dependem do tamanho das AgNORs, as precipitações maiores que 2 J.1m são as mais importantes (36,5). Os dados morfométricos das AgNORs permitiram a determinação exata da idade do animal em 79,7% dos casos / Abstract: Nuc1eolar organizing regions (NORs) are areas of extra or intranuc1eolar DNA which harbor genes coding for ribosomal RNA. NORs have intense affinity for silver, which stains dots in the acrocentric chromosomes 13, 14, 15,20 and 21. These are called argyrophilic NORs or AgNORs. This is due to the presence of non-histone proteins associated to ribosomal RNA recently transcribed from DNA. Currently, the AgNOR technique is being employed in the evaluation of cellular proliferation, in distinguishing benign from malignant tumors and as an indicator of prognosis in malignant neoplasms. There has been considerable controversy in the criteria for measuring or counting AgNORs, making comparison of results from different authors often difficult. In an attempt to help define criteria for AgNOR measuring in light microscopy, we developed a technique for examining AgNORs in electron microscopy. A normal tissue, the rat heart left ventric1e in the fetal and postnatal periods as used. A total of95 animais were studied at the following ages: 16, 19 and 21 pre-natal days; 1, 5, 8,21 and 60 days after birth. For light microscopy 74 animais were used, and 21 for electron microscopy. For light microscopy, material was fixed in 10% buffered formalin for one hour, dehydrated and c1eared as usual and embedded in paraffin. Three f..lm sections were stained for AgNORs by the technique ofCrock~r & Nar (1987), slightly modified. As no EM technique for AgNORs was found in the literature, we developed the following procedure empirically: tissue was fixed in Karnovsky' s solution for one 110ur, followed by a quick rinse (3-5 seconds) in ethanol-acetic acid and incubated for 30 minutes in a solution containing 1 volume of 2% gelatine dissolved in 1 % formic acid and 2 volumes of 50% aqueous silver nitrate. Solution was prepared and Millipore filtered just before use. Tissue blocks were then dehydrated in ascending alcohols and embedded in Araldite. We avoided using osmium tetroxide, uranyl acetate or lead citrate to ensure that any electrondense precipitations could be reliably attributed to silver. EM revealed that an AgNOR c1uster is formed by a group of silver precipitations intermingled with lighter strands and embedded in electronlucent matrix. The clusters correspond to the nucleolus itself. An AgNOR dot is a single dark precipitation containing no matrix. Based on these observations, we adopted the criterion of counting a cluster (a nucleolus) as a single unit, since the counting of individual silver precipitations within a cluster proved unreliable and somewhat arbitrary. Exaroination of cardiomyocytes disclosed that large AgNOR clusters were more numerous in rats at 16, 19 and 21 prenatal days and 1,5 days postnatally than in animaIs at 8,21 and 60 days after birth. This difference was interpreted as probably related to a higher proliferative activity of the celIs in intrauterine life. At 60 days there was a high number of dots. This finding was thought to be a likely indicator of new protein synthesis necessary for the formation of the myofibrillary complexo On a qualitative basis, the morphological appearance of the clusters was extremely similar, if not indistinguishable, for the ages 16, 19 and 21 prenatal days and 1,5 days postnatalIy. The saroe occurred for animaIs aged 8, 21 and 60 days postnatalIy. However it was possible to distinguish clearly between these two groups on cluster morphology alone. On the other hand, inside each group quantitative analysis showed significant differences between alI ages. In some cardiomyocyte nuclei we found three or more AgNORs on a straight line, which we designated as the aIignment phenomenon. In animaIs with ages 16, 19 and 21 prenatal days and 1,5 days postnatalIy the number ofsuch lined up AgNORs was smalI, while in those of later ages the phenomenon w~ observed with higher frequency. Discriminating analysis showed that animais of different ages could be separated using morphometric data of AgNORs in 79,7 % of cases. For this effe~ the numbers of nuclei with AgNOR aIignment has a higher importance than the average AgNOR counting.IIIAmong the variables depending on the size of the AgNORs, precipitations larger than 2 I-l are most important. The high percentage of right results in age discrimination demonstrates that the technique here described is reliable and reproducible for morphometric evaluation of AgNORs / Mestrado / Anatomia Patologica / Mestre em Ciências

O núcleo é uma estrutura organizada e possui verdadeiras organelas nucleares. Entre elas, estão os nucléolos e os corpúsculos de Cajal (CBs). Estes compartimentos nucleares são estruturas dinâmicas, mantidos pela associação de macromoléculas envolvidas na expressão gênica que interagem entre si delimitando-as. A principal proteína encontrada nos CBs é a p-80-coilin e, portanto, o principal epítopo capaz de marcar essas estruturas. Suas funções específicas ainda tem sido alvo de estudo. Existe uma proteína em comum a ambas as estruturas, a fibrilarina que participa no processamento de rRNA. Estes corpúsculos já foram descritos na periferia dos nucléolos ou mesmo fisicamente ligados a ele. Acredita-se que os corpúsculos de Cajal participem da síntese de rRNA, maturação, transporte e associação das subunidades ribossômicas.Diante esta relação, este trabalho visa estudar a inter-relação entre estas estruturas em células normais e as respectivas linhagens de células tumorais em cultura antes e após tratamentos com actinomicina D. Esta droga se usada em baixas concentrações, bloqueia a transcrição dos genes que foram decodificados pela RNA polimerase I e II, e -amanitin, por sua vez bloqueia a transcrição de genes decodificado pela RNA polimerase II . Além disso, também visa investigar uma relação entre a proliferação das linhagens estudadas e freqüência dos corpúsculos de Cajal nas células controle e tratadas. O microscópio confocal de varredura a laser permitiu o estudo dessas estruturas em preparações imunofluorescência fornecendo uma análise tridimensional destas estruturas quando utilizados anticorpos específicos. Linhagens de células que apresentaram um crescimento mais lento foram aquelas que tinham uma maior freqüência de corpúsculos por núcleo. Por outro lado, aquelas que apresentaram um crescimento mais intenso, foram aquelas que apresentaram maior variação no número de corpúsculos por núcleo. Após o tratamento com inibidores de síntese de RNA, tanto os corpúsculos de Cajal quanto os nucléolos, apresentaram alterações morfológicas, às vezes apresentando um grande acúmulo na região dos corpúsculos ou desorganizando os nucléolos. Mudanças no tamanho e forma também puderam ser destacadas. / The nucleus is a structure that has sub-compartments which can be called nuclear organelles. Among them, may be cited the nucleoli and the Cajal bodies (CBs). These nuclear compartments are dynamic structures, maintained by association and stock of macromolecules involved in gene expression. The main protein found in the CB is a p-80-coilin and therefore the main epitope able to label these structures. Their functions are still to be clarified. There is a protein in common to the nucleolus and Cajal bodies, the fibrillarin that takes part in the processing of rRNA. The CBs can be found at the periphery of the nucleoli or even physically connected to them. It is believed that the CBs may have role in the synthesis of rRNA and maturation, transport and association of ribosome subunits. In view of this relationship between Cajal bodies and nucleoli, this work aims to study the interrelationship between these structures in normal cells and their respective tumor cell line in culture before and after treatments with actinomycin D, which in low concentrations, blocks the transcription of genes that were decoded by the RNA polymerase I and II and -amanitin, which is responsible for blocking the transcription of genes decoded by the RNA polymerase II and find out a relationship between cell proliferation and Cajal bodies frequencies in control and treated cells. The confocal microscope of laser scanning enabled the study of these structures in preparations immunofluorescent providing a three-dimensional analysis of these structures when used specific antibodies before and after treatment. Cell lines that shown low cell grow, appears to have lass CB/ nucleus in the other hand, cell lines that have fastest grow shown nuclei with more Cajal bodies frequencies and more variation in the number of Cajal/nucleus After treatment with inhibitors, both Cajal bodies as nucleoli, made quite clear morphological changes, sometimes giving large accumulation of proteins in organelles and sometimes appeared disorganized in the nucleoplasm. Changes in the size and shape were also highlighted. The tumor cell lines also showed changes compared to their normal cell type.

O núcleo é uma estrutura organizada e possui verdadeiras organelas nucleares. Entre elas, estão os nucléolos e os corpúsculos de Cajal (CBs). Estes compartimentos nucleares são estruturas dinâmicas, mantidos pela associação de macromoléculas envolvidas na expressão gênica que interagem entre si delimitando-as. A principal proteína encontrada nos CBs é a p-80-coilin e, portanto, o principal epítopo capaz de marcar essas estruturas. Suas funções específicas ainda tem sido alvo de estudo. Existe uma proteína em comum a ambas as estruturas, a fibrilarina que participa no processamento de rRNA. Estes corpúsculos já foram descritos na periferia dos nucléolos ou mesmo fisicamente ligados a ele. Acredita-se que os corpúsculos de Cajal participem da síntese de rRNA, maturação, transporte e associação das subunidades ribossômicas.Diante esta relação, este trabalho visa estudar a inter-relação entre estas estruturas em células normais e as respectivas linhagens de células tumorais em cultura antes e após tratamentos com actinomicina D. Esta droga se usada em baixas concentrações, bloqueia a transcrição dos genes que foram decodificados pela RNA polimerase I e II, e -amanitin, por sua vez bloqueia a transcrição de genes decodificado pela RNA polimerase II . Além disso, também visa investigar uma relação entre a proliferação das linhagens estudadas e freqüência dos corpúsculos de Cajal nas células controle e tratadas. O microscópio confocal de varredura a laser permitiu o estudo dessas estruturas em preparações imunofluorescência fornecendo uma análise tridimensional destas estruturas quando utilizados anticorpos específicos. Linhagens de células que apresentaram um crescimento mais lento foram aquelas que tinham uma maior freqüência de corpúsculos por núcleo. Por outro lado, aquelas que apresentaram um crescimento mais intenso, foram aquelas que apresentaram maior variação no número de corpúsculos por núcleo. Após o tratamento com inibidores de síntese de RNA, tanto os corpúsculos de Cajal quanto os nucléolos, apresentaram alterações morfológicas, às vezes apresentando um grande acúmulo na região dos corpúsculos ou desorganizando os nucléolos. Mudanças no tamanho e forma também puderam ser destacadas. / The nucleus is a structure that has sub-compartments which can be called nuclear organelles. Among them, may be cited the nucleoli and the Cajal bodies (CBs). These nuclear compartments are dynamic structures, maintained by association and stock of macromolecules involved in gene expression. The main protein found in the CB is a p-80-coilin and therefore the main epitope able to label these structures. Their functions are still to be clarified. There is a protein in common to the nucleolus and Cajal bodies, the fibrillarin that takes part in the processing of rRNA. The CBs can be found at the periphery of the nucleoli or even physically connected to them. It is believed that the CBs may have role in the synthesis of rRNA and maturation, transport and association of ribosome subunits. In view of this relationship between Cajal bodies and nucleoli, this work aims to study the interrelationship between these structures in normal cells and their respective tumor cell line in culture before and after treatments with actinomycin D, which in low concentrations, blocks the transcription of genes that were decoded by the RNA polymerase I and II and -amanitin, which is responsible for blocking the transcription of genes decoded by the RNA polymerase II and find out a relationship between cell proliferation and Cajal bodies frequencies in control and treated cells. The confocal microscope of laser scanning enabled the study of these structures in preparations immunofluorescent providing a three-dimensional analysis of these structures when used specific antibodies before and after treatment. Cell lines that shown low cell grow, appears to have lass CB/ nucleus in the other hand, cell lines that have fastest grow shown nuclei with more Cajal bodies frequencies and more variation in the number of Cajal/nucleus After treatment with inhibitors, both Cajal bodies as nucleoli, made quite clear morphological changes, sometimes giving large accumulation of proteins in organelles and sometimes appeared disorganized in the nucleoplasm. Changes in the size and shape were also highlighted. The tumor cell lines also showed changes compared to their normal cell type.

O nucléolo é uma organela nuclear responsável pela produção dos ribossomos, através das Regiões Organizadoras do Nucléolo (NORs). Espécies que possuem mais de um par de cromossomos contendo NORs terão, obrigatoriamente, pelo menos um par ativo, sendo as demais NORs funcionais de acordo com a demanda celular. O mecanismo de compensação de dose é visualizado e bem estabelecido em híbridos interespecíficos, conhecido como dominância nucleolar, com a inativação de NORs de um dos parentais por outras homeólogas ativas que as dominam. A arquitetura da cromatina nas NORs e o controle da sua expressão foram estudados com o objetivo de se entender os mecanismos envolvidos no fenômeno da dominância nucleolar em espécies diplóides que possuem múltiplas NORs. A espécie modelo utilizada neste estudo foi Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae), caracterizada por conter 2n=2x=16, e NORs no braço curto do cromossomo 1, sendo este o principal organizador do nucléolo, e no braço longo do cromossomo 4 adjacente à heterocromatina centromérica, sendo este um sítio adicional (sítio menor) e de expressão facultativa, previamente determinada. Nas raízes de C. juncea sincronizadas, observou-se que a nucleologênese tem seu início durante o final da telófase, em que os 4 sítios de genes ribossomais podem ter atividade e formar até 4 nucléolos, os quais tendem a se fundir durante a interfase. A Hibridação in situ fluorescente (FISH) permitiu estudos da arquitetura da cromatina, com a visualização dos territórios cromossômicos, onde a cromatina não está organizada de forma aleatória dentro do núcleo, e consequentemente o rDNA 45S dentro do nucléolo. Observou-se também que todos os sítios de rDNA 45S possuem diferença no tamanho do arranjo repetitivo. Assim sendo, a hierarquia de dominância está de acordo com o tamanho de cada arranjo (sítio), e estes são ativados de acordo com a demanda celular. As análises das modificações nas histonas mostraram que a H3K9Met1 apresentou marcas fracas no nucléolo, enquanto no restante da cromatina nuclear sua marcação foi intensa. Já a H3K9Met2 apresentou marcação fortemente associada à cromatina presente no nucléolo, com alguns pequenos pontos heterocromáticos dispersos no núcleo. Pela observação entende-se que ambas metilações controlam diferentes tipos de heterocromatinas, ou seja, a H3K9Met2 controla principalmente heterocromatinas associadas aos genes ribossomais, e a H3K9Met controla heterocromatinas não associadas ao rDNA. O rDNA é hiperacetilado dentro do nucléolo para a H3K14. Não foi observada marcação nucleolar para H4K8ac, mas pôde ser observadas regiões hiperacetiladas em outras regiões da cromatina. A metilação do DNA esteve diretamente associada à diferentes níveis de organização da cromatina das NORs. As heterocromatinas adjacentes ao nucléolo apareceram fortemente metiladas, enquanto a cromatina distendida dentro do nucléolo apresentou marcação dispersa, com algumas regiões mais fortemente marcadas, onde a cromatina apresentava-se mais condensada e provavelmente não associados com a cromatina ativa. As fibras estendidas permitiram uma análise de alta resolução, onde foi possível observar que regiões não metiladas apareciam intercaladas entre grandes regiões fortemente metiladas, sugerindo que estas regiões hipometiladas estão, possivelmente, associadas com as alças de transcrição dentro do nucléolo. 12 Esses resultados contribuem para o entendimento sobre o controle genético e epigenético na arquitetura da cromatina ribossomal, bem como seu controle na expressão dos genes ribossomais no genoma das plantas. / The nucleolus is a nuclear organelle responsible for the ribosomes production, by Nucleolus Organizer Regions (NORs). Species presenting more than one chromosome pair with NORs should present, one pair expressing the genes, at least; while the other pairs expressing their genes accordingly to cellular demand. Dosage compensation mechanism is visualized and well established of interspecific hybrids as a well-described phenomena named nucleolar dominance, where a NOR from one parental could lead to inactivation of a NOR from the other parental which is dominated. The chromatin architecture and expression of the NORs were studied to address the mechanism involved in the nucleolar dominance of diploid species containing multiple sites of 45S rDNA. The model species used in the present study was the crop Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae) characterized by 2n=2x=16 chromosomes, being the main NOR mapped into chromosome 1 short arm and presenting an additional site (minor site) in the chromosome 4 long arm adjacent to a centromeric heterochromatin and facultatively expressed. Synchronized meristematic root tip cells determined to nucleologenesis starts during the late-telophase, often expressing every ribosomal gene sites, when up to four nucleoli could be observed and these become merged during interphases. FISH allowed nucleolar chromatin architecture be accessed revealing distinct chromosomal domains (territories), suggesting a non-random distribution of the 45S rDNA, even between homologous chromosomes, into the nucleolus. The 45S rDNA sites from both chromosome pairs 1 and 4 of C. juncea showed differences in their array sizes. The differences in the 45S rDNA array sizes and the order of loci expression suggest a hierarchy of dominance, a feature of nucleolar dominance; being the small RONs activated only on demand. Immunodetection of histone modifications showed different patterns to methylation distribution across the chromatin as a whole; where H3K9Met1 was found mainly distributed along the nuclear chromatin without an evident signal into nucleolus, while H3K9Met2 was detected as conspicuous dots in the nuclear chromatin and highly accumulated into the nucleolus. The results indicate different control on heterochromatin establishment and maintenance, being the modifications specific to certain chromosomal regions. Indeed, H3K9Met is a key component in the nucleolus chromatin architecture and expression. The chromatin inside the nucleolus showed a high accumulation of H3K14ac, with a weak fluorescent signal along the nucleus; on the other hand H4K8ac showed a strong signal homogenously distributed across the nuclear chromatin, but without evident signals inside the nucleolus. DNA methylation was directly associated with different levels of chromatin organization of the NORs. The heterochromatic regions associated to RON are highly methylated, while the chromatin inside the nucleolus showed weaker signals, with some bright spots probably in condensed regions and related to chromatin inactivity. Extended DNA fiber allowed a higher resolution mapping that revealed long methylated regions intermingled by nomethylated ones, being the last probably associated to transcriptional loops of rRNA genes into the nucleolus. The results presented herein contributes to a better understand about the nucleolar chromatin architecture and the genetic and epigenetic control of the ribosomal genes expression on plant genomes.

O nucléolo é uma organela subnuclear formada pela atividade transcricional dos genes ribossomais 18S-5.8S-26S (rDNA 45S) e consequente biogênese dos ribossomos. A atividade destes genes resulta na região organizadora do nucléolo (NOR), na forma de uma constrição secundária em cromossomos metafásicos. As constrições secundárias se condensam progressivamente durante a mitose e se descondensam ao final da telófase quando a reestruturação do nucléolo se inicia. Genomas que apresentam mais de um locus de rDNA 45S deve apresentar, obrigatoriamente, pelo menos um par de NORs, enquanto os demais loci poderão ou não serem expressos. O controle da expressão dos genes ribossomais e a formação da cromatina nucleolar são modulados por eventos epigenéticos. Embora alguns pontos sobre o funcionamento dos genes ribossomais e a formação do nucléolo estejam bem estabelecidos, questões como o padrão de condensação da cromatina nucleolar durante a mitose, o padrão de funcionamento de sítios adicionais de genes ribossomais, o papel das modificações epigenéticas na dinâmica da cromatina nucleolar e na expressão do rDNA 45S e o mecanismo de herança dos genes ativos, permanecem abertas. A espécie Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae), com 2n=2x=16 cromossomos, que possui um locus de rDNA 45S no braço curto do cromossomo 1, que sempre forma constrição secundária, e um sítio adicional com atividade facultativa no braço curto do cromossomo 4, é um excelente modelo para o estudo destas questões. No contexto apresentado, foram estudadas a dinâmica de condensação das NORs durante o ciclo celular e sua correlação com a atividade dos genes ribossomais, incluindo o locus adicional, e ainda o papel da metilação da citosina do DNA durante estes processos. Os resultados demonstram que a cromatina da região organizadora do nucléolo segrega em um estado descondensado durante a mitose, na forma de constrição secundária, ou seja, tal estrutura não se condensa durante a metáfase e não volta a se distender no início da telófase. Aparentemente, o que causa correlações equivocadas entre a atividade nucleolar e a observação morfológica da constrição secundária na metáfase é a contração forçada da cromatina da NOR causada por agentes antimitogênicos. Este modelo de segregação em um estado aberto pode ser explicado pela descrição de diversas proteínas que permanecem diretamente ligadas ou indiretamente associadas à região da NOR durante a mitose, funcionando como uma barreira física para a compactação. Ambos os sítios, principais e adicionais, do rDNA 45S presentes em Crotalaria juncea apresentam atividade transcricional, embora o locus do cromossomo 4 mostre atividade facultativa. Ao contrário do que foi anteriormente proposto, uma vez ativo, o locus adicional permanece descondensado durante todo o ciclo mitótico, seguindo o mesmo comportamento dos sítios principais. As constrições secundárias e a cromatina nucleolar são hipermetiladas em nível citológico, independentemente de sua atividade. A aparente hipometilação observada no rDNA 45S em cromossomos mitóticos e núcleos interfásicos se deve ao menor grau de compactação da região organizadora do nucléolo e, consequentemente, à baixa densidade de cromatina. / The nucleolus is a subnuclear organelle formed as a result of transcriptional activity of ribosomal RNA genes 18S-5.8S-26S (45S rDNA) and subsequent ribosome biogenesis. This activity forms the nucleolar organizing region (NOR) as a secondary constriction in metaphase chromosomes. The secondary constrictions progressively condense during mitosis and decondense at the end of telophase, when nucleoli start to reassemble. Genomes presenting more than one 45S rDNA locus must have at least one pair of NOR bearing chromosomes, while other loci may be expressed or not. Ribosomal gene expression and nucleolar chromatin assembly are modulated by specific epigenetic events. Although some topics related to rDNA gene activity and nucleolus formation are well understood, questions such as the behavior of nucleolar chromatin condensation during mitosis, standard functions associated with rDNA additional sites, role of epigenetic modifications in nucleolar chromatin and 45S rDNA expression processes, and inheritance mechanism of active genes, remain to be solved. Crotalaria juncea (Leguminosae - Papilionoideae) has 2n=2x=16 chromosomes and carries a 45S rDNA locus at the short arm of chromosome 1, always presenting a secondary constriction, and an additional site with facultative activity at the short arm of chromosome 4, being an excellent model to resolve these questions. Thus, this study aimed to study NOR condensation dynamics during the cell cycle and its correlation with ribosomal gene activity, including the additional locus, while analyzing the role of rDNA cytosine methylation during this process. The results show that NOR chromatin segregate in a decondensed way throughout mitosis, as a secondary constriction. In other words, this structure does not condense during metaphase and the NOR is not reassembled at the beginning of telophase. Misinterpretations relating nucleolar activity with morphological observations of secondary constrictions, appear to be induced by the artificial contraction of NOR chromatin caused by antimitotic drugs. This segregation model in an open state may be supported by strong diversity of proteins that are maintained attached to NORs during mitosis, serving as a physic barrier for condensation. Both principal and additional 45S rDNA sites of C. juncea are transcriptionally active, although the additional locus in chromosome 4 presented facultative activity depending upon ribosomal request. Unlike what was previously proposed, once the additional site is activated, it remains in an open configuration throughout the cell cycle, similarly to principal site behavior. Secondary constrictions and nucleolar chromatin are hypermethylated at cytological level, regardless of their activity. The seeming hipomethylated state of 45S rDNA in interphase nucleus and mitotic chromosomes is due to a lower compaction level of nucleolar organizing regions and subsequent low chromatin density.

O nucléolo é uma organela nuclear responsável pela produção dos ribossomos, através das Regiões Organizadoras do Nucléolo (NORs). Espécies que possuem mais de um par de cromossomos contendo NORs terão, obrigatoriamente, pelo menos um par ativo, sendo as demais NORs funcionais de acordo com a demanda celular. O mecanismo de compensação de dose é visualizado e bem estabelecido em híbridos interespecíficos, conhecido como dominância nucleolar, com a inativação de NORs de um dos parentais por outras homeólogas ativas que as dominam. A arquitetura da cromatina nas NORs e o controle da sua expressão foram estudados com o objetivo de se entender os mecanismos envolvidos no fenômeno da dominância nucleolar em espécies diplóides que possuem múltiplas NORs. A espécie modelo utilizada neste estudo foi Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae), caracterizada por conter 2n=2x=16, e NORs no braço curto do cromossomo 1, sendo este o principal organizador do nucléolo, e no braço longo do cromossomo 4 adjacente à heterocromatina centromérica, sendo este um sítio adicional (sítio menor) e de expressão facultativa, previamente determinada. Nas raízes de C. juncea sincronizadas, observou-se que a nucleologênese tem seu início durante o final da telófase, em que os 4 sítios de genes ribossomais podem ter atividade e formar até 4 nucléolos, os quais tendem a se fundir durante a interfase. A Hibridação in situ fluorescente (FISH) permitiu estudos da arquitetura da cromatina, com a visualização dos territórios cromossômicos, onde a cromatina não está organizada de forma aleatória dentro do núcleo, e consequentemente o rDNA 45S dentro do nucléolo. Observou-se também que todos os sítios de rDNA 45S possuem diferença no tamanho do arranjo repetitivo. Assim sendo, a hierarquia de dominância está de acordo com o tamanho de cada arranjo (sítio), e estes são ativados de acordo com a demanda celular. As análises das modificações nas histonas mostraram que a H3K9Met1 apresentou marcas fracas no nucléolo, enquanto no restante da cromatina nuclear sua marcação foi intensa. Já a H3K9Met2 apresentou marcação fortemente associada à cromatina presente no nucléolo, com alguns pequenos pontos heterocromáticos dispersos no núcleo. Pela observação entende-se que ambas metilações controlam diferentes tipos de heterocromatinas, ou seja, a H3K9Met2 controla principalmente heterocromatinas associadas aos genes ribossomais, e a H3K9Met controla heterocromatinas não associadas ao rDNA. O rDNA é hiperacetilado dentro do nucléolo para a H3K14. Não foi observada marcação nucleolar para H4K8ac, mas pôde ser observadas regiões hiperacetiladas em outras regiões da cromatina. A metilação do DNA esteve diretamente associada à diferentes níveis de organização da cromatina das NORs. As heterocromatinas adjacentes ao nucléolo apareceram fortemente metiladas, enquanto a cromatina distendida dentro do nucléolo apresentou marcação dispersa, com algumas regiões mais fortemente marcadas, onde a cromatina apresentava-se mais condensada e provavelmente não associados com a cromatina ativa. As fibras estendidas permitiram uma análise de alta resolução, onde foi possível observar que regiões não metiladas apareciam intercaladas entre grandes regiões fortemente metiladas, sugerindo que estas regiões hipometiladas estão, possivelmente, associadas com as alças de transcrição dentro do nucléolo. 12 Esses resultados contribuem para o entendimento sobre o controle genético e epigenético na arquitetura da cromatina ribossomal, bem como seu controle na expressão dos genes ribossomais no genoma das plantas. / The nucleolus is a nuclear organelle responsible for the ribosomes production, by Nucleolus Organizer Regions (NORs). Species presenting more than one chromosome pair with NORs should present, one pair expressing the genes, at least; while the other pairs expressing their genes accordingly to cellular demand. Dosage compensation mechanism is visualized and well established of interspecific hybrids as a well-described phenomena named nucleolar dominance, where a NOR from one parental could lead to inactivation of a NOR from the other parental which is dominated. The chromatin architecture and expression of the NORs were studied to address the mechanism involved in the nucleolar dominance of diploid species containing multiple sites of 45S rDNA. The model species used in the present study was the crop Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae) characterized by 2n=2x=16 chromosomes, being the main NOR mapped into chromosome 1 short arm and presenting an additional site (minor site) in the chromosome 4 long arm adjacent to a centromeric heterochromatin and facultatively expressed. Synchronized meristematic root tip cells determined to nucleologenesis starts during the late-telophase, often expressing every ribosomal gene sites, when up to four nucleoli could be observed and these become merged during interphases. FISH allowed nucleolar chromatin architecture be accessed revealing distinct chromosomal domains (territories), suggesting a non-random distribution of the 45S rDNA, even between homologous chromosomes, into the nucleolus. The 45S rDNA sites from both chromosome pairs 1 and 4 of C. juncea showed differences in their array sizes. The differences in the 45S rDNA array sizes and the order of loci expression suggest a hierarchy of dominance, a feature of nucleolar dominance; being the small RONs activated only on demand. Immunodetection of histone modifications showed different patterns to methylation distribution across the chromatin as a whole; where H3K9Met1 was found mainly distributed along the nuclear chromatin without an evident signal into nucleolus, while H3K9Met2 was detected as conspicuous dots in the nuclear chromatin and highly accumulated into the nucleolus. The results indicate different control on heterochromatin establishment and maintenance, being the modifications specific to certain chromosomal regions. Indeed, H3K9Met is a key component in the nucleolus chromatin architecture and expression. The chromatin inside the nucleolus showed a high accumulation of H3K14ac, with a weak fluorescent signal along the nucleus; on the other hand H4K8ac showed a strong signal homogenously distributed across the nuclear chromatin, but without evident signals inside the nucleolus. DNA methylation was directly associated with different levels of chromatin organization of the NORs. The heterochromatic regions associated to RON are highly methylated, while the chromatin inside the nucleolus showed weaker signals, with some bright spots probably in condensed regions and related to chromatin inactivity. Extended DNA fiber allowed a higher resolution mapping that revealed long methylated regions intermingled by nomethylated ones, being the last probably associated to transcriptional loops of rRNA genes into the nucleolus. The results presented herein contributes to a better understand about the nucleolar chromatin architecture and the genetic and epigenetic control of the ribosomal genes expression on plant genomes.

O nucléolo é uma organela subnuclear formada pela atividade transcricional dos genes ribossomais 18S-5.8S-26S (rDNA 45S) e consequente biogênese dos ribossomos. A atividade destes genes resulta na região organizadora do nucléolo (NOR), na forma de uma constrição secundária em cromossomos metafásicos. As constrições secundárias se condensam progressivamente durante a mitose e se descondensam ao final da telófase quando a reestruturação do nucléolo se inicia. Genomas que apresentam mais de um locus de rDNA 45S deve apresentar, obrigatoriamente, pelo menos um par de NORs, enquanto os demais loci poderão ou não serem expressos. O controle da expressão dos genes ribossomais e a formação da cromatina nucleolar são modulados por eventos epigenéticos. Embora alguns pontos sobre o funcionamento dos genes ribossomais e a formação do nucléolo estejam bem estabelecidos, questões como o padrão de condensação da cromatina nucleolar durante a mitose, o padrão de funcionamento de sítios adicionais de genes ribossomais, o papel das modificações epigenéticas na dinâmica da cromatina nucleolar e na expressão do rDNA 45S e o mecanismo de herança dos genes ativos, permanecem abertas. A espécie Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae), com 2n=2x=16 cromossomos, que possui um locus de rDNA 45S no braço curto do cromossomo 1, que sempre forma constrição secundária, e um sítio adicional com atividade facultativa no braço curto do cromossomo 4, é um excelente modelo para o estudo destas questões. No contexto apresentado, foram estudadas a dinâmica de condensação das NORs durante o ciclo celular e sua correlação com a atividade dos genes ribossomais, incluindo o locus adicional, e ainda o papel da metilação da citosina do DNA durante estes processos. Os resultados demonstram que a cromatina da região organizadora do nucléolo segrega em um estado descondensado durante a mitose, na forma de constrição secundária, ou seja, tal estrutura não se condensa durante a metáfase e não volta a se distender no início da telófase. Aparentemente, o que causa correlações equivocadas entre a atividade nucleolar e a observação morfológica da constrição secundária na metáfase é a contração forçada da cromatina da NOR causada por agentes antimitogênicos. Este modelo de segregação em um estado aberto pode ser explicado pela descrição de diversas proteínas que permanecem diretamente ligadas ou indiretamente associadas à região da NOR durante a mitose, funcionando como uma barreira física para a compactação. Ambos os sítios, principais e adicionais, do rDNA 45S presentes em Crotalaria juncea apresentam atividade transcricional, embora o locus do cromossomo 4 mostre atividade facultativa. Ao contrário do que foi anteriormente proposto, uma vez ativo, o locus adicional permanece descondensado durante todo o ciclo mitótico, seguindo o mesmo comportamento dos sítios principais. As constrições secundárias e a cromatina nucleolar são hipermetiladas em nível citológico, independentemente de sua atividade. A aparente hipometilação observada no rDNA 45S em cromossomos mitóticos e núcleos interfásicos se deve ao menor grau de compactação da região organizadora do nucléolo e, consequentemente, à baixa densidade de cromatina. / The nucleolus is a subnuclear organelle formed as a result of transcriptional activity of ribosomal RNA genes 18S-5.8S-26S (45S rDNA) and subsequent ribosome biogenesis. This activity forms the nucleolar organizing region (NOR) as a secondary constriction in metaphase chromosomes. The secondary constrictions progressively condense during mitosis and decondense at the end of telophase, when nucleoli start to reassemble. Genomes presenting more than one 45S rDNA locus must have at least one pair of NOR bearing chromosomes, while other loci may be expressed or not. Ribosomal gene expression and nucleolar chromatin assembly are modulated by specific epigenetic events. Although some topics related to rDNA gene activity and nucleolus formation are well understood, questions such as the behavior of nucleolar chromatin condensation during mitosis, standard functions associated with rDNA additional sites, role of epigenetic modifications in nucleolar chromatin and 45S rDNA expression processes, and inheritance mechanism of active genes, remain to be solved. Crotalaria juncea (Leguminosae - Papilionoideae) has 2n=2x=16 chromosomes and carries a 45S rDNA locus at the short arm of chromosome 1, always presenting a secondary constriction, and an additional site with facultative activity at the short arm of chromosome 4, being an excellent model to resolve these questions. Thus, this study aimed to study NOR condensation dynamics during the cell cycle and its correlation with ribosomal gene activity, including the additional locus, while analyzing the role of rDNA cytosine methylation during this process. The results show that NOR chromatin segregate in a decondensed way throughout mitosis, as a secondary constriction. In other words, this structure does not condense during metaphase and the NOR is not reassembled at the beginning of telophase. Misinterpretations relating nucleolar activity with morphological observations of secondary constrictions, appear to be induced by the artificial contraction of NOR chromatin caused by antimitotic drugs. This segregation model in an open state may be supported by strong diversity of proteins that are maintained attached to NORs during mitosis, serving as a physic barrier for condensation. Both principal and additional 45S rDNA sites of C. juncea are transcriptionally active, although the additional locus in chromosome 4 presented facultative activity depending upon ribosomal request. Unlike what was previously proposed, once the additional site is activated, it remains in an open configuration throughout the cell cycle, similarly to principal site behavior. Secondary constrictions and nucleolar chromatin are hypermethylated at cytological level, regardless of their activity. The seeming hipomethylated state of 45S rDNA in interphase nucleus and mitotic chromosomes is due to a lower compaction level of nucleolar organizing regions and subsequent low chromatin density.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LeonardoGoll.pdf: 2578520 bytes, checksum: e4dc5f18aad72bd8d62d5803fed3c4ef (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / TheColeopterahave a large variationof the sex determinationsystem, being the Xypmechanism considered ancestorfor thisorder. The presenceof a argyrophilous material associated with thesexbivalent is described asresponsible formaintenance andassociation of thesechromosomes.However,there is no consensus in the literature about the nature ofthisargyrophilous material. In addition,few species have been studied using fluorescence in situhybridization (FISH) tothe location of the multigene families, which areuseful and can elucidate the variation in the karyotype and genomic organization of several species.To date,there is no cytogenetic analysis in the genus Lagria.Thus, theaim of this study was tocharacterizecytogeneticallyLagriavillosa, throughconventional andmolecularcytogenetics, forinvestigating the mechanism ofassociationofsex chromosomesXyp,through analysis of nature of argyrophilous material in the lumen of sex bivalent. Additionally, thechromosomalmapping of 5S rDNA multigene families, 18S rDNA and histone H3 genes in L. villosa, was carried out, and showing for the first timein Coleoptera, that genes 18S and 5S DNAs are interspersed. In addition, the analysis oftesticular cellsshowed 2n=18=16+Xypand formulameiotic 2n=8II+Xyp.In this workwe discuss thepossible mechanismsevolvingin the association ofXypsex chromosomes,where it is consideredthat the combination ofsynaptonemalcomplex proteinsmayparticipate in thecorrect segregationofchromosomes.In addition, the fiber-FISH technique with dual probes (18S and 5S) was used for better resolution mapping of these regions in L. villosa, showing that the two DNAs are closely interspersed with varying amounts of both classes of DNA. Association between the two rDNA families have been reported for other species and different hypotheses are raised about the functional organization in these families. / Os Coleoptera apresentam grande variação quanto aos sistemas de determinação sexual, sendo o mecanismo cromossômico do tipo Xyp considerado ancestral para esta ordem. A presença de uma substância argirofílica associada ao bivalente sexual é descrita como sendo a responsável pela manutenção e associação desses cromossomos, porém não existe um consenso na literatura sobre a natureza desse material. Além disso, poucas espécies têm sido analisadas utilizando a Hibridação in situ Fluorescente (FISH) para a localização das famílias multigênicas, as quaissão úteis marcadores e podem elucidar a variação do cariótipo e a organização genômica de diversas espécies.Até o presente momento, não existe análise citogenética em espécies do gênero Lagria. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi caracterizar citogeneticamente Lagria villosa, através da citogenética convencional e molecular, investigando o mecanismo de associação dos cromossomos sexuais Xyp, através da análise da natureza do material argirofílico presente no lúmen do bivalente sexual. Adicionalmente, realizou-se o mapeamento cromossômico das famílias multigênicasDNAr 5S, DNAr18S e genes de histona H3 em L. villosa, mostrando pela primeira vez uma associação intercalar dosgenes DNAs 5S e 18S em Coleoptera. Além disso, aanálise de células testiculares evidenciou 2n=18=16+Xype fórmula meiótica 2n=8II+Xyp.No presente trabalho são discutidos os possíveis mecanismos evolvidos na associação dos cromossomos sexuais Xyp, onde é considerado que a associação de proteínas do complexo sinaptonêmico pode participar da correta segregação desses cromossomos. Além disso, atécnica de fiber-FISH com dupla sonda (18S e 5S) foi utilizada para uma melhor resolução do mapeamento dessas regiões genômicas em L. villosa, mostrando que os dois DNAs estão intimamente intercalados com quantidades variáveis de ambas as classes de DNA. Associação entre as duas famílias DNArtem sido relatadopara outras espécies e diferentes hipóteses são levantadas sobre a organização funcional dessas famílias.