Os pacientes que usam lítio (Li) para tratamento do transtorno bipolar frequentemente apresentam poliúria e deficiência de concentração urinária, sintomas do Diabetes Insipidus Nefrogênico (DIN). Animais tratados com Li apresentam baixos níveis de produção de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) em resposta ao hormônio antidiurético (HAD). O Sildenafil (Sil), um inibidor da fosfodiesterase 5 (PDE5), eleva os níveis intracelulares de guanosina monofosfato cíclico (GMPc), levando a inserção de aquaporina 2 (AQP2) na membrana plasmática das células do ducto coletor. Portanto, inibidores de PDE podem promover a inserção de AQP2 na membrana plasmática mesmo sem a ativação do receptor de HAD, indicando a participação de uma via alternativa mediada pelo GMPc. Nós investigamos as vias de ação do Sil no tratamento da DIN induzida pelo Li. Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: grupo controle, recebendo dieta alimentar normal durante quatro semanas; grupo Li, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas; grupo Li + Sil, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas e 200 mg por quilo de dieta de Sil a partir da segunda semana; grupo Sil, recebendo dieta alimentar normal durante a primeira semana e a partir da segunda semana recebendo dieta normal com 200 mg de Sil por quilo de dieta. Os animais do grupo Li desenvolveram poliúria, diminuição da osmolalidade urinária e diminuição da expressão da AQP2 tanto na fração citoplasmática como de membrana celular e o Sil reverteu essas alterações. Demonstramos ainda que a concentração de GMPc intracelular estava aumentada nos túbulos papilares tratados com Sil. Observamos que a provável via de fosforilação da AQP2 induzida pelo GMPc é pela PKA. Além disso, o tratamento com Sil aumenta a expressão de pCreb, fator de transcrição para ativação do gene da AQP2. Observamos ainda que o Li diminui a expressão de eNOS e o tratamento com Sil normaliza essa diminuição. Assim, concluímos que o tratamento com Sil em ratos com DIN melhora a poliúria aumentando a produção e a inserção de AQP2. O tratamento com Sil pode ser benéfico para pacientes que sofrem com DIN induzido pelo Li / Patients taking lithium to treat bipolar disorder often present polyuria and urinary concentrating defect. In addition, lithium-treated animals present lower cyclic adenosine monophosphate production in response to vasopressin. Sildenafil (Sil), a phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitor, elevates intracellular cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels, leading to plasma membrane accumulation of aquaporin 2 (AQP2). Therefore, PDE inhibitors might induce AQP2 membrane insertion even without vasopressin receptor activation by activating a parallel cGMP-mediated signal transduction pathway. We investigated Sil pathways of action in rats with lithium-induced nephrogenic Diabetes Insipidus (NDI). Wistar rats received lithium (40 mmol/kg food) or not for 4 weeks (Li or control), some rats also receiving sildenafil (200 mg/kg food) in weeks 2-4, with or without lithium (Li+Sil orSil). Animals in Li group developed polyuria, decreased urinary osmolality and decreased expression of AQP2 in both the cytoplasmic fraction and the cell membrane and Sil reversed these changes. We also demonstrated that intracellular cGMP concentration was increased in papillary tubules treated with Sil. We found that PKA may be involved in the pathway of cGMP induced AQP2 phosphorylation. In addition, Sil treatment increases Creb phosphorylation. Creb phosphorylation, acts as AQP2 gene transcription factor. We also observed that Li decreases eNOS expression and treatment with Sil normalizes this alteration. We conclude that Sil treatment improves polyuria by increasing production and insertion of AQP2. Sil treatment may be beneficial to patients suffering from induced DIN Li

INTRODUÇÃO: Na última década surgiu uma nova técnica, o sequenciamento de nova geração, que, contrário ao método tradicional de Sanger, permite o sequenciamento em paralelo e em larga escala de múltiplos genes, ou até mesmo todos os genes humanos, a menor custo e com uma análise mais acelerada. Essa técnica possibilitou a descoberta de novos genes responsáveis por diversas doenças mendelianas, sendo rapidamente incorporada no contexto clínico. OBJETIVOS: comparar os resultados das técnicas de Sanger e sequenciamento de nova geração em amostras controle; introduzir a técnica de sequenciamento de nova geração no contexto clínico nas casuísticas de doenças ósseas genéticas e RASopatias; avaliar a sensibilidade diagnóstica desta técnica em amostras sem dados clínicos fornecidos. MÉTODOS: o sequenciamento de nova geração (sob a forma de um painel de genes customizado ou do exoma) foi realizado em amostras com mutações identificadas previamente por Sanger e em dois grupos de doenças mendelianas, 144 pacientes com doenças ósseas e 79 com RASopatias, além de 90 amostras sem dados clínicos conhecidos (45 casos e 45 controles). A técnica de Sanger foi aplicada em 29 amostras de doenças ósseas e em 81 amostras para confirmação de variantes identificadas pelo sequenciamento de nova geração. RESULTADOS: A sensibilidade da técnica de sequenciamento de nova geração foi estimada em 95,92% e a especificidade em 98,77%. Na casuística de doenças ósseas, a sensibilidade diagnóstica das amostras sequenciadas por Sanger foi de 69% (20/29), por painel customizado, 60% (75/125) e por exoma, 63% (12/19). Na casuística de RASopatias, a sensibilidade diagnóstica através do exoma foi de 46% (36/79). Como resultado deste trabalho, dois genes novos associados a RASopatias (LZTR1 e SOS2) e um associado a uma displasia esquelética (PCYT1A) foram identificados. Na análise das amostras sem conhecimento prévio da hipótese clínica foi obtida uma sensibilidade diagnóstica de 46,67% (21/45), mas que chegou a 73,08% (14/26) para as hipóteses de erros inatos do metabolismo. CONCLUSÕES: Foi demonstrado que a sensibilidade e a especificidade da técnica do sequenciamento de nova geração são altas e correspondentes a valores encontrados por outros grupos na literatura. Essa técnica foi considerada apropriada não apenas no contexto de pesquisa, demonstrado aqui pela descoberta de três novos genes associados a doenças mendelianas, como também para análises clínicas. Neste estudo a técnica foi aplicada com sucesso no contexto clínico, seja pelo painel customizado, seja pelo exoma, com uma positividade semelhante à encontrada pela técnica de Sanger. Mesmo na análise de amostras sem história clínica prévia foi possível identificar variantes patogênicas em quase metade dos casos, e numa porcentagem ainda maior quando a doença era um erro inato do metabolismo. Essa sensibilidade é comparável à obtida pela espectroscopia de massas em Tandem aplicada à triagem de múltiplas condições simultaneamente, o que sugere que a técnica do sequenciamento de nova geração poderá ser incorporada ao programa de triagem neonatal no futuro, ampliando o emprego de testes genéticos em complementaridade aos testes bioquímicos tradicionais / INTRODUCTION: In the last decade a new technique, the next generation sequencing, has emerged, which, contrary to the traditional Sanger method, performs parallel and high-throughput sequencing of multiple genes, or even all human genes, at a lower cost and with a faster analysis. This technique allowed the discovery of new genes responsible for several Mendelian diseases and has been quickly incorporated into the clinical context. OBJECTIVES: to compare the results of Sanger technique and next generation sequencing in control samples; to apply the next generation sequencing technique in the clinical practice to the cases of genetic skeletal disorders and RASopathies; to evaluate the diagnostic yield of this technique in samples without clinical data provided. METHODS: Next generation sequencing (in the form of a customized gene panel or exome) was performed in samples with mutations previously identified by Sanger sequencing and in two groups of Mendelian diseases, 144 patients with skeletal disorders and 79 patients with RASopathies, besides 90 samples with unknown clinical data (45 cases and 45 controls). The Sanger technique was applied in 29 samples of skeletal disorders and in 81 samples for confirmation of variants identified by next generation sequencing. RESULTS: The sensitivity of the next generation sequencing technique was estimated at 95.92% and the specificity at 98.77%. In the case of skeletal disorders, the diagnostic yield of the samples sequenced by Sanger was 69% (20/29), by customized panel, 60% (75/125), and by exome, 63% (12/19). In the individuals with RASopathies, the diagnostic yield through exome sequencing was 46% (36/79). As a result of this study, two new genes associated with RASopathies (LZTR1 and SOS2) and one associated with a skeletal dysplasia (PCYT1A) were identified. In the analysis of the samples without previous knowledge of the clinical hypothesis, a total diagnostic yield of 46.67% (21/45) was obtained, but it was up to 73.08% (14/26) in the group with hypothesis of inborn errors of metabolism. CONCLUSIONS: It was demonstrated that the sensitivity and specificity of the next generation sequencing technique are high and are similar to values found by other groups in the literature. The technique was considered appropriate not only for research, as demonstrated here by the identification of three new genes associated to Mendelian diseases, but also for clinical analysis. In this study the technique was successfully applied in the clinical context, both by customized panel and by exome, with positivity similar to that obtained by the Sanger technique. Even in the analysis of samples with no previous clinical history, it was possible to identify pathogenic variants in almost half of the cases, and an even greater percentage was obtained when the disease was an inborn error of metabolism. This sensitivity is comparable to that obtained by Tandem mass spectroscopy applied to multi-condition screening, suggesting that the next generation sequencing technique may be incorporated in the future into the neonatal screening program, increasing the use of genetic testing in complementarity to the biochemical tests

Os distúrbios do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal são doenças genéticas heterogêneas. Os testes genéticos que utilizam o sequenciamento de genes candidatos pelo método de Sanger é efetivo para o diagnóstico etiológico em menos de 40% desses pacientes. O sequenciamento de nova geração é uma ferramenta eficaz no diagnóstico de pacientes com DDSs. No presente estudo, utilizamos o sequenciamento exômico paralelo em larga escala (SEPLE) para identificar variantes alélicas potencialmente causadoras dos DDSs. Pacientes com síndrome de regressão testicular embrionária (SRTE) familial, membros de duas famílias brasileiras não relacionadas (família 1: dois irmãos afetados e pais não afetados e família 2: indivíduo índice, irmã não afetada e sobrinho afetado, filho da irmã do índice) foram selecionados inicialmente. Estes pacientes apresentavam micropenis, testículos ausentes ou disgenéticos e ausência de útero. O DNA genômico foi extraído de leucócitos de sangue periférico e o SEPLE foi realizado usando a plataforma Illumina-HiSeq-2500. Uma nova variante em heterozigose, c.923C > T, (p.Arg308Gln), no DHX37 foi identificada em todos os membros afetados das duas famílias brasileiras. O sequenciamento por Sanger confirmou a presença da variante em todos os afetados, no pai não afetado da F1 e na mãe não afetada do F2. A presença de efeito fundador da variante nestas duas famílias foi excluído, através da análise de 29 marcadores localizados no cromossomo 12q. Trinta e cinco pacientes com 46, XY DDS por anormalidades do desenvolvimento gonadal (6 com SRTE e 29 com disgenesia gonadal) esporádicos foram incluídos na pesquisa de variantes no DHX37 por Sanger ou por painel de genes candidatos (Plataforma Illumina-HiSeq-2500). As variantes c.923C > T, (p.Arg308Gln) em heterozigose e a variante c.451G > A, (p.Arg151Trp) em homozigose foram identificadas no DHX37 em dois pacientes com SRTE esporádicos. As variantes c.142C > T (p.Ala48Thr) e c.2020G > A (p.Arg674Trp) foram identificadas em heterozigose em dois pacientes esporádicos com disgenesia gonadal (DG). De acordo com o American College of Medical Genetics e Genomics guideline (ACMG), as variantes foram classificadas como provavelmente patogênicas (p.Arg308Gln e p.Arg674Trp), variante de significância clínica incerta (p.Arg151Trp) e variante benigna (p.Ala48Thr). Três variantes identificadas no DHX37 eram causadoras de doença em mais de três das ferramentas de previsão in silico utilizadas. Nenhuma das novas variantes no DHX37 foi encontrada nas bases de dados da população disponíveis (EXAC, 1000GENOME, ESP6500, gnomAD e abraOM) com uma frequência maior do que 0,01%. O padrão de metilação da região promotora do DHX37 dos membros afetados e não afetados das famílias 1 e 2 e controles femininos e masculino foi analisado utilizando o ensaio Infinium Methylation EPIC BeadChip (Illumina). Um sítio CpG hipometilado na região promotora do DHX37 foi observado apenas no pai da F1 quando comparado com as amostras dos filhos afetados, membros da F2 e controles. A análise imuno-histoquímica do padrão de expressão da proteína DHX37 foi realizada em amostras de testículos de oito indivíduos com diferentes idades cronológicas. Esta analise revelou que no tecido testicular de recém-nascidos, indivíduos em idade puberal e adultos, o DHX37 estava expresso em células germinativas em diferentes estágios de maturação (presentes nas espermatogonias, espermatócitos e espermátides e ausente nos espermatozoides). Este achado sugere que a proteína DHX37 pode ter um papel no processo de desenvolvimento das células germinativas. O DHX37 (12q24.31) codifica uma proteína DEAH (Asp-Glu-Ala-His) que pertence às famílias RNA helicases cujos membros estão envolvidos em quase todos os processos relacionados ao RNA, bem como ao controle do crescimento, proliferação e processos de diferenciação celular. Pacientes descritos com deleções na região 12q24.31, que contém o DHX37, apresentavam características sindrômicas e anormalidades genitais, como hipospadias ou micropenis. A presença de anormalidades genitais nestes pacientes reforça a hipótese de que o DHX37 está envolvido na etiologia dos DDSs 46,XY. Em conclusão, identificamos fortes evidências de um novo gene, o DHX37, envolvido no processo de desenvolvimento e manutenção das gônadas masculinas. Estudos complementares serão necessários para esclarecer o papel exato do DHX37 nas redes reguladoras de genes que controlam o desenvolvimento sexual humano / 46,XY disorders of sex development (DSD) associated with abnormalities of gonadal development are heterogeneous genetic diseases. Genetics testing using Sanger sequencing of candidate genes is effective for diagnosis in less than 40% of these patients. Next-generation sequencing has been a powerful genetic diagnostic tool in the investigation of DSD patients. In the present study, we used the whole exome sequencing (WES) to identify potentially DSD-causing allelic variants. Patients with familial embryonic testicular regression syndrome (ETRS) of two non-related Brazilian families (Family 1 (F1)- two affected brothers and the unaffected parents; Family 2 (F2)- index patient, his unaffected sister and an affected nephew, the son of the index\'s sister) were initially selected. The patients had micropenis, absent or dysgenetic testes and no uterus. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leucocytes and WES was performed using the Illumina-HiSeq-2500 platform. A novel heterozygous variant, c.923C > T, (p.Arg308Gln), in the DHX37 gene was identified in all affected members of the two Brazilian families and in F1\'s father. Sanger sequencing confirmed the presence of the variant in the all of the affected members and in F1\'s father and in F2\'s mother. The presence of a founder effect in these families was investigated using 29 markers located on chromosome 12q and was ruled out. Thirty-five additional patients with sporadic 46,XY DSD associated with abnormalities of gonadal development (6 with ETRS and 29 with gonadal dysgenesis) were screened for variants in this novel candidate gene using Sanger or NGS-based targeted sequencing panel of DSD candidate genes (Illumina-HiSeq-2500 platform). The heterozygous variant c.923C > T (p.Arg308Gln) and the homozygous variant c.451G>A, (p.Arg151Trp) in the DHX37 were identified in two sporadic SRTE patients. The heterozygous variants c.142C > T (p.Ala48Thr) and c.2020G > A (p.Arg674Trp) were identified in two sporadic 46,XY gonadal dysgenesis (GD) patients. According to the American College of Medical Genetics and Genomics guidelines (ACMG) the variants were classified as likely pathogenic (p.Arg308Gln, p.Arg674Trp), variant of uncertain clinical significance (p.Arg151Trp and) and benign variant (p.Ala48Thr); and all three of them were disease causing in more than three of the in silico prediction tools used. None of the novel DHX37 variants identified were found in the available population databases (EXAC, 1000GENOME, ESP6500, gnomAD and abraOM) in more than 0.01%. Segregation analysis of DHX37 allelic variants was performed in 5 families and resulted in the autosomal dominant with incomplete penetrance and recessive inheritance patterns. DNA methylation pattern of the DHX37 promotor region of F1 and F2\'s affected and unaffected members and gender-matched controls was analyzed using the Infinium Methylation EPIC BeadChip (Illumina). One hypomethylated CpG site in the promoter region of the DHX37 was only observed in F1\'s father compared with the affected siblings, F2\'s members and controls. Immunohistochemical analysis of DHX37 protein expression pattern was performed on testis samples of eight individuals with different chronological ages. This analysis revealed that in the testicular tissue of newborns, pubertal and adults, the DHX37 was expressed in different stages of germ cells maturation (present in spermatogonia, spermatocytes and spermatids and absent in spermatozoa). This finding suggests that DHX37 protein might have a role in the process of germ-cells development. The DHX37 (12q24.31) encodes a DEAH (AspGlu- Ala-His) protein of the RNA helicase families, whose members are involved in almost all RNA-related process such as the control of cell growth, proliferation and differentiation processes. Previously described patients with 12q 24.31 deletions, which contains DHX37, showed syndromic features and genital abnormalities as hypospadias or micropenis. This phenotype reinforces the hypothesis that DHX37 is involved in the etiology of disorders in male sex development. In conclusion, a novel gene, the DHX37, involved in the process of development and maintenance of male gonads was identified. Further studies will be necessary to clarify the exact role of the DHX37 in the gene regulatory networks controlling human sex development

Introdução: A miopatia centronuclear é uma doença muscular congênita com apresentação clínica heterogênea, caracterizada histologicamente pela proeminência de fibras musculares com núcleos centralizados. Três formas são reconhecidas: neonatal grave, com herança ligada ao X e envolvimento do gene MTM1; autossômica dominante, com início geralmente tardio e curso mais leve, associada a mutações no gene DNM2; e autossômica recessiva, com gravidade intermediária entre as outras formas e envolvimento dos genes BIN1, RYR1 ou TTN. Apesar da identificação dos principais genes responsáveis pela doença, os métodos usuais de diagnóstico genético não encontram mutações em cerca da metade dos casos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi a caracterização clínica, histológica e molecular de pacientes brasileiros portadores de miopatia centronuclear. Métodos: Laudos de dois bancos de biópsia muscular foram usados para identificar pacientes com diagnóstico de miopatia centronuclear nos últimos dez anos. As lâminas das biópsias foram revisadas e analisadas, e as famílias correspondentes convocadas para aplicação de protocolo clínico e coleta de sangue periférico para extração de DNA genômico. As famílias foram estudadas para os genes conhecidos por sequenciamento Sanger, MLPA, painel de genes implicados em doenças neuromusculares ou sequenciamento de exoma. Resultados: Foram convocados 24 pacientes provenientes de 21 famílias, em 16 das quais foi possível estabelecer o diagnóstico molecular. As 7 famílias com a forma neonatal grave constituíam um grupo homogêneo clínica e histologicamente, e mutações novas e conhecidas foram encontradas no gene MTM1 em 6 destas. Dois meninos deste grupo, com evolução estável, tiveram óbito súbito por choque hipovolêmico subsequente a rompimento de cisto hepático. O gene MTM1 também foi implicado em uma menina portadora manifestante, com quadro mais leve, na forma de uma macrodeleção em heterozigose, detectada por MPLA. Duas famílias em cuja histologia foram encontradas fibras com aspecto em \"roda de carroça\" apresentaram mutações no gene DNM2, uma das quais, p.Phe372Cys, nunca havia sido descrita. Em 7 famílias, o gene RYR1 foi o responsável, em todas sob a forma de heterozigose composta, com 14 mutações, das quais 13 novas, encontradas ao longo de todo o gene. Este grupo, apesar de heterogêneo clinicamente, apresentou em comum a presença de falhas focais na atividade oxidativa das fibras musculares na maioria dos indivíduos. O gene TTN está provavelmente implicado em uma família com um único afetado, no qual o sequenciamento de exoma mostrou mutação nula em heterozigose composta. Nesta coorte de pacientes brasileiros, não houve famílias com alterações no gene BIN1, e três famílias seguem sem diagnóstico molecular, com prováveis novos genes implicados. Conclusões: Os achados clínicos e histológicos de pacientes brasileiros com miopatia centronuclear seguem os padrões descritos na literatura, e em conjunto podem direcionar o estudo molecular adequado. Nesta coorte de pacientes, o gene RYR1, estudado por sequenciamento de alto débito de exoma, foi o mais frequentemente acometido, sugerindo que sua implicação na miopatia centronuclear vem sendo subestimada. Novas mutações encontradas nos genes MTM1, DNM2 e RYR1 contribuíram para confirmar regiões de patogenicidade e ampliar o espectro de alterações nestes genes / Introduction: Centronuclear myopathy is a heterogeneous congenital muscle disease, characterized by the prominence of centralized nuclei in muscle fibers. Three disease forms are recognized: a severe neonatal, X-linked form caused by mutations in the MTM1 gene; an autosomal dominant, late-onset milder form, associated to the DNM2 gene; and an autosomal recessive form, with intermediate severity, so far with the BIN1, RYR1 or TTN genes implicated. In spite of the identification of these genes, usual molecular diagnostic methods don\'t yield a molecular diagnosis in about half of cases. Objetives: The aim of this work was to study clinical, histological, and molecular aspects of centronuclear myopathy Brazilian patients. Methods: Reports taken from two muscle biopsy banks were used to identify centronuclear myopathy patients in the last ten years. Biopsy slides were reviewed and analyzed, and corresponding families recruited to apply a clinical protocol and to draw peripheral blood to extract genomic DNA. Families were studied for known genes via Sanger sequencing, MLPA, panel of genes implicated in neuromuscular diseases, or exome sequencing. Results: Twentyfour patients out of 21 families were recruited, and in 16 families molecular diagnosis was established. The 7 families with the severe neonatal form amounted to a clinically and histologically homogeneous group, and mutations, both known and novel, were found in the MTM1 gene in 6 of these. Two boys of this group, with a stable course, died suddenly of hypovolemic shock due to a hepatic cyst rupture. The MTM1 gene was also implicated in the case of a mild manifesting carrier girl with a heterozygous macrodeletion detected via MLPA. Two families whose histology contained fibers with a \"spoke of wheels\" aspect had mutations in the DNM2 gene, one of which, p.Phe372Cys, had never been described. In 7 families, the RYR1 gene was the culprit, in all of them in a compound heterozygous state, with 14 mutations, 13 of which novel, found throughout the length of the gene. This group, despite clinically heterogeneous, had in common the presence of focal disruptions in the oxidative activity of muscle fibers in the majority of individuals. The TTN gene is probably implicated in a family with a single affected, whose exome sequencing showed compound heterozygous null mutations. In this cohort of Brazilian patients, no family was found to have alterations in the BIN1 gene, and three families remain without molecular diagnosis, with probable new implicated genes. Conclusions: Clinical and histological findings of Brazilian patients with centronuclear myopathy follow patterns already described in the literature, and taken as a whole can direct the adequate molecular study. In this patient cohort, the RYR1 gene, sequenced though hight-throughput techniques, was the most frequently involved, suggesting that its implication in centronuclear myopathy is underestimated. Novel mutations found in the MTM1, DNM2 and RYR1 genes contributed to confirm pathogenic regions and expand the spectrum of alterations in these genes

Rearranjos genômicos são alterações estruturais na molécula de DNA e podem ser a causa de inúmeras doenças genéticas. O mecanismo gerador dessas alterações é bem variável. Ele pode ser recorrente, por intermédio de low copy repeats (LCRs), resultando num rearranjo causado por recombinação homóloga não-alélica (NAHR), ou não recorrente, ou seja, sem intermédio de um hotspot. Dentre os mecanismo não recorrentes temos: a junção das extremidades não-homólogas (NHEJ - non-homologous end joining) e a junção mediada por micro-homologia (MMEJ - microhomology-mediated end joining), a replicação em série por deslizamento (SRS), a SRS induzida por quebra (BISRS), a replicação induzida pela quebra de DNA por homologia (MMBIR - microhomology-mediated break induced replication), o enrolamento da forquilha de replicação e mudança de molde de DNA (FoSTeS - fork stalling and template switching). A análise dos pontos de quebra dos rearranjos genômicos pode fornecer informações importantes para uma maior compreensão da arquitetura genômica e seu papel na geração das anormalidades estruturais. O objetivo deste trabalho foi sequenciar os pontos de quebra genômicos a fim de identificar o mecanismo formador das alterações encontradas. Para isso, investigamos o panorama estrutural de 10 pacientes por sequenciamento por meio de linked reads (10X Genomics) e sequenciamos os pontos de quebra previamente identificados por array CytoSNP-12 (Illumina) de 12 pacientes com rearranjos genômicos estruturais por utilizando a captura por Nextera Rapid Capture (Illumina). A investigação por linked reads revelou rearranjos estruturais em 5 pacientes, destacando translocações encontradas em dois pacientes, impossíveis de serem detectadas por metodologias de sequenciamento que não envolva long reads. Foi possível sugerir os mecanismos causadores dessas alterações como NHEJ. O sequenciamento após a captura por Nextera foi capaz de identificar elementos que permitiram definir o mecanismo em três pacientes (NAHR E FoSTeS/MMBIR) e sugerir em mais dois pacientes (NHEJ). Com a estratégia utilizada foi possível sequenciar pontos de quebra por meio do flanqueamento das regiões identificadas por array, identificar os elementos genômicos presentes nos pontos de quebra e os mecanismos formadores dessas alterações / Genomic rearrangements are structural changes in the DNA molecule and can be the cause of numerous genetic diseases. The mechanisms that generate these alterations can occur in different ways. It can be recurrent, mediated by low copy repeats (LCRs), resulting in a rearrangement cause by non-alellic homologue recombination (NAHR), or non-recurrent, without a hotspot. Among non-recurrent mechanisms there are: non-homologous end joining (NHEJ), microhomology-mediated end joining (MMEJ), serial replication slippage (SRS), break-induced serial replication slippage (BISRS), microhomology-mediated break induced replication (MMBIR) and fork stalling and template switching (FoSTeS). Analysis of the breakpoints of genomic rearrangements may provide important information for a better understanding of genomic architecture and its role in generating structural abnormalities. The aim of this work was to sequence the genomic breakpoints in order to identify the mechanism that formed the alterations found. To do this, we investigated the genomic structure of 10 patients by linked reads (10X Genomics) sequencing and sequenced the breakpoints previously identified by Illumina CytoSNP-12 array of 12 patients with structural genomic imbalances by using Nextera Rapid Capture (Illumina). The research by linked reads revealed structural rearrangements in 5 patients, highlighting translocations found in two patients, impossible to be detected by sequencing methodologies that did not involve long reads. It was possible to suggest the mechanisms causing these changes as NHEJ. The sequencing after capture by Nextera was able to identify elements that allowed us to determine the formation mechanism in three patients (NAHR and FoSTeS / MMBIR) and to suggest in two patients (NHEJ). With the approach employed here, it was possible to sequencing breakpoints by flanking the regions identified by array, identifying the genomic elements present at breakpoints and the formation mechanisms of the alterations

Introdução: O diabetes monogênico corresponde de 1% a 2% de todos os casos de diabetes mellitus, sendo causado por variantes em um único gene. Dentre esses, o mais comum é o MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young), havendo, porém, diversas formas mais raras, como diabetes neonatal e sindrômico que podem estar associadas a outras comorbidades além do diabetes, bem como às lipodistrofias hereditárias. O diagnóstico genético permite a adequação do tratamento, seguimento clínico e aconselhamento familiar. Objetivos: (1) desenvolver e implantar um painel customizado de sequenciamento em larga escala para o diagnóstico genético-molecular das formas raras de diabetes monogênico e lipodistrofias hereditárias; (2) estabelecer o diagnóstico genético de casos com suspeita clínica; (3) realizar a correlação genótipo-fenótipo. Métodos: Os pacientes foram selecionados de acordo com os critérios de inclusão para cada tipo de diabetes monogênico raro. A pesquisa genética dos casos-índice foi feita por sequenciamento em larga escala. A segregação familiar e confirmação dos achados foram feitas pelo método de Sanger. A análise de bioinformática foi realizada considerando o tipo de variante, frequência em bancos de dados populacionais, predição in silico e segregação familiar. Resultados: Foram analisados 42 casos, sendo que em 23 foram encontradas variantes candidatas: 6/16 com diagnóstico de diabetes neonatal, 2/2 com quadro clínico de Síndrome de Wolfram, 11/11 com suspeita de lipodistrofia congênita generalizada, 4/13 com lipodistrofia parcial familiar. Conclusões: Um painel customizado de sequenciamento em larga escala permitiu o diagnóstico genético-molecular de diabetes monogênico, com positividade de 22/42 casos analisados, sendo possível realizar a correlação genótipofenótipo. O diagnóstico genético possibilitou o aprimoramento do seguimento clínico dos pacientes e suas famílias. Permitiu, ainda, aumentar o número de diagnósticos de casos anteriormente subdiagnosticados / Introduction: Monogenic Diabetes accounts for 1 to 2% of all cases of diabetes mellitus. It is caused for variants in a single gene. Among these, the most common is MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young), but there are several other rare forms, which may be associated with other comorbidities besides diabetes. Genetic diagnosis can lead to appropriate treatment and follow-up, besides and family counseling. Objectives: (1) to develop a customized targeted massively parallel sequencing panel to sequence the rare types of monogenic diabetes; (2) To establish the genetic diagnosis of probands with clinical suspicion of monogenic diabetes; (3) To correlate their phenotype with genetic findings, leading to a better understanding of rare monogenic diabetes subtypes. Methods: Patients were selected according to the inclusion criteria for each type of rare monogenic diabetes. Genetic research of index cases was done by massively parallel sequencing. Family segregation and confirmation of the variants findings were done by Sanger method. Bioinformatics analysis was performed considering the type of variant, frequency in population databases, in silico prediction and family segregation. Results: We analyzed a total of 42 cases. We found 22 candidate causal variants: 6/16 in probands with Neonatal Diabetes, 2/2 with Wolfram Syndrome, 11/11 with suspected Generalized Congenital Lipodystrophy, and 4/13 with Familial Partial Lipodystrophy. Conclusions: A customized targeted massively parallel sequencing panel allowed genetic diagnosis of rare types of monogenic diabetes, with a positivity of 23/42 cases analyzed, being possible to perform the genotype-phenotype correlation. The genetic diagnosis allowed the improvement of the clinical follow-up of the patients and their families. It also increased the number of diagnoses of previously underdiagnosed cases

Estudos de gêmeos e famílias demonstram que os transtornos do espectro do autismo (TEA) apresentam um grande componente genético (~50%), porém sua etiologia ainda é desconhecida, possivelmente devido aos TEA serem caracterizados como doenças complexas, poligênicas e multifatoriais. Recentemente, variações no número de cópias (CNVs, do inglês Copy Number Variations) e mutações pontuais (SNV, do inglês Single Nucleotide Variant) raras, de novo e herdadas foram associadas com TEA, sugerindo novos loci e genes candidatos. No entanto, a grande maioria das alterações descritas são individuais, de forma que analises por agrupamento das mesmas em genes, e busca de funções biológicas ou vias hiper-representadas tem sido uma abordagem para a compreensão dos possíveis mecanismos etiopatológicos dos TEA. Como os TEA são muito heterogêneos clinicamente o uso de endofenótipos específicos para agrupamento das alterações gênicas pode auxiliar a discriminação de vias e processos biológicos relacionados a dimensões fenotípicas. Considerando os estudos realizados em autismo, e a natureza das variações comuns e raras, nesse trabalho foi realizado o sequenciamento do exoma de 1 família de dois irmãos com TEA sindrômico (sequenciamento piloto) e 18 trios de casos esporádicos de TEA, em busca alterações muito raras e/ou de novo com provável impacto funcional nos pacientes; Além disso, foi analisado se existe diferença entre as vias biológicas hiper-representadas de redes gênicas crescidas a partir dos genes que apresentavam variações raras e de novo, comparando pacientes de TEA com: (1) pouca ou nenhuma comunicação, chamados de não verbais e (2) média a boa comunicação, chamados de verbais. No sequenciamento piloto da família dos irmãos com TEA sindrômico, encontramos 1 duplicação em 4p16.3 e 1 deleção em 8p23.3, em ambos os irmãos; alterações estas encontradas em estudos previos em pacientes com características sindrômicas e TEA; na análise de SNVs e Indels foi encontrada 1 variação de novo e 117 variações não-sinônimas raras herdadas de um dos pais na irmã e 150 variações não-sinônimas raras herdadas de um dos pais no irmão; a análise de vias revelou que os genes com as mutações pontuais raras estavam hiper-representados em regiões cromossômicas diferentes em cada irmão (no cromossomo 1 na paciente do sexo feminino e no cromossomo 16 no paciente do sexo masculino), o que pode estar relacionado às diferenças fenotípicas por eles apresentadas. No sequenciamento do exoma dos trios foram encontradas alterações de novo em 9 dos pacientes: 1 CNV de novo (deleção) de 1,5Mb na região 3q29, região previamente associada com síndrome e transtornos do desenvolvimento; e 8 genes alterados por mutações pontuais de novo, dos quais um dele é o GABBR2, que apresenta evidência de associação com TEA. A análise de vias e redes das variantes herdadas raras, mostrou que muitos dos genes relacionados aos dois grupos verbais e não verbais são genes já associados com TEA ou que apresentam interação com aqueles genes associados ao TEA. As analises de vias e redes precisam ser replicadas em amostras maiores, mas com nossos resultados preliminares podemos perceber que nosso estudo contribui com alterações em genes de vias relacionadas a neurogênese e sinaptogênese, independentemente do fenótipo, que possam refletir um conjunto de genes específicos e ou numero de alterações relacionadas a gravidade do TEA / Studies of twins and families have shown that autism spectrum disorders (ASD) are highly heritable (~50%), but its etiology is still unknown, possibly because it is a very heterogeneous phenotype and have multiple genes involved in its development, what characterizes a complex disease such as ASD. Recently, copy number variations (CNVs) and point mutations (SNVs) rare, inherited e de novo, were associated with ASD, suggesting new candidate genes and loci. Because they are very rare, the vast majority of the changes described are individual, so the analysis of different variations grouped by genes and searching for biological functions or hyper represented pathways has been an approach for understanding possible pathogenic mechanisms of ASD. As ASD is clinically very heterogeneous, the use of endophenotypes, specific grouping of genomic changes can help discriminating pathways and biological processes related to phenotypic dimensions. Considering the studies in autism, and the nature of common and rare variants, we sequenced all exons (exome) of 1 family with syndromic ASD (pilot sequencing) and 18 trios of sporadic ASD cases to search for de novo and rare variations with probable functional impact on Brazilian patients; Also, we analyzed whether there is a difference in the enrichment of biological pathways of gene networks from the list of genes affected with de novo and rare deleterious variants in two groups of ASD patients: (1) cases with little or no communication, called nonverbal and (2) cases with average to good communication, called verbal. In the pilot exome sequencing (ASD syndromic family), we found a duplication in 4p16.3 and a deletion in 8p23.3 in both siblings, alterations that were found in patients with syndromes and ASD in previously studies; the analysis of SNVs showed 1 variation de novo and 117 nonsynonymous rare variations inherited from only 1 of the parents in the female sibling, and 150 nonsynonymous rare variations inherited from only 1 of the parents in the male sibling; Pathway analysis revealed enrichment differences of chromosomal regions for each sibling (chromosome 1 for the female patient and chromosome 16 for the male patient), what may be related to their phenotypic differences. In the exome sequencing of trios, as expected, it was found de novo variation in 9 of the patients: 1 de novo CNV (deletion) of 1.5 Mb in the region 29 of the long arm of chromosome 3, a region previously associated with syndrome and developmental disorders; and 8 genes altered by de novo variations, one of those is in the GABBR2, gene with previous evidence of association with ASD. The pathways and networks analysis of rare inherited variants showed that many of the genes related to the two groups verbal and nonverbal are already associated with ASD or interacts with those genes associated with ASD. This pathway and gene network analyses need to be replicated in larger samples, but our preliminary results shows that our study contributes with variations in genes related to neurogenesis and synaptogenesis pathways, regardless of phenotype, with probable impact to specific genes that may be related to severity of clinical presentation

A síndrome de Bloom (SB) é uma síndrome de instabilidade cromossômica rara, transmitida por herança autossômica recessiva. Caracteriza-se por deficiência de crescimento pré e pós-natal, microcefalia, hipoplasia malar, eritema telangiectásico em face e comprometimento do sistema imunológico, entre outras manifestações clínicas. Os pacientes com SB apresentam predisposição aumentada para o desenvolvimento de neoplasias em idade precoce, sendo esta, a principal causa de óbito. Ao estudo citogenético observa-se aumento de quebras cromossômicas espontâneas e trocas entre cromátides irmãs (TCI), que são utilizadas como marcador diagnóstico para a SB. Além disso, a literatura mostra que a maioria dos pacientes também apresenta mutações no gene BLM, que estão relacionadas a defeitos no mecanismo de reparo do DNA. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos não são completamente compreendidos. Nesse sentido estudamos o transcriptoma de duas pacientes portadoras da síndrome de Bloom e de três controles utilizando a metodologia RNA-seq (Illumina, Inc., San Diego, CA). A análise de expressão diferencial revelou 216 genes diferencialmente expressos relacionados a vias relacionadas à resposta imune como replicação negativa da regulação da replicação do genoma viral, regulação positiva da proliferação de células B, via de sinalização mediada por interferon gama, ativação de células B, resposta a vírus, resposta imune adaptativa e processo efetor imune, e nenhuma diferença da expressão em genes de reparo de DNA. Concomitantemente, observamos a hiperexpressão do gene BLM para ambas as pacientes, contribuindo para a desestabilização de genes envolvidos em vias imunológicas, fenômeno também observado em alguns tumores. Dessa forma, sugerimos que a combinação de defeitos de proliferação linfocitária e defeitos de sinalização celular somados a outros, como perda celular e expressão alterada do gene BLM, podem contribuir diretamente para as principais características observadas na síndrome de Bloom, como a deficiência de crescimento e o elevado risco de câncer. Futuramente, o estudo do transcriptoma, aplicado a outros portadores da SB e outras síndromes de instabilidade, possibilitará uma análise mais acurada das interações gênicas relevantes para a desestabilização do genoma / Bloom Syndrome (BS) is a rare chromosome instability syndrome, with recessive autosomal inheritance. The main clinical manifestations are pre and postnatal growth deficiency, microcephaly, malar hypoplasia, telangiectasic facial erythema and compromised immune system, among others. Patients with BS present increased risk to the development of neoplasias at an early age, which is the main cause of death. Cytogenetic test is used as a diagnostic marker for BS since the patient\'s cells present increase in spontaneous chromosomal breaks and sister chromatid exchange (SCE). In addition, the literature reveals that most patients also present mutations in the BLM gene, which are related to defects in the DNA repair mechanism; however, it is still not completely understood. In this sense, we studied the transcriptome of two patients with Bloom\'s syndrome and three controls using the RNA-seq methodology (Illumina, Inc., San Diego, CA). Differential expression analysis revealed 216 differentially expressed genes related to immunological pathways such as: negative replication of the regulation of the viral genome replication, positive regulation of B cells proliferation, gama-interferon mediated signalization pathway, B cells activation, virus response, adaptive immune response and immune effector process, and absence of difference of DNA repair genes expression. At the same time, we observed the hyperexpression of the BLM gene for both patients contributing for the destabilization of genes involved in immunological pathways, a phenomenon also observed in some tumors. Thus, we suggest that the combination of lymphoid proliferation defects and cell signaling defects added to others such as cell loss and altered expression of the BLM gene may contribute directly to the main characteristics observed in Bloom\'s syndrome, such as growth failure and high risk of cancer. In the future, the study of the transcriptome applied to other BS carriers and other instability syndromes, will allow a more accurate analysis of the relevant gene interactions to the destabilization of the genome

INTRODUÇÃO: Na última década surgiu uma nova técnica, o sequenciamento de nova geração, que, contrário ao método tradicional de Sanger, permite o sequenciamento em paralelo e em larga escala de múltiplos genes, ou até mesmo todos os genes humanos, a menor custo e com uma análise mais acelerada. Essa técnica possibilitou a descoberta de novos genes responsáveis por diversas doenças mendelianas, sendo rapidamente incorporada no contexto clínico. OBJETIVOS: comparar os resultados das técnicas de Sanger e sequenciamento de nova geração em amostras controle; introduzir a técnica de sequenciamento de nova geração no contexto clínico nas casuísticas de doenças ósseas genéticas e RASopatias; avaliar a sensibilidade diagnóstica desta técnica em amostras sem dados clínicos fornecidos. MÉTODOS: o sequenciamento de nova geração (sob a forma de um painel de genes customizado ou do exoma) foi realizado em amostras com mutações identificadas previamente por Sanger e em dois grupos de doenças mendelianas, 144 pacientes com doenças ósseas e 79 com RASopatias, além de 90 amostras sem dados clínicos conhecidos (45 casos e 45 controles). A técnica de Sanger foi aplicada em 29 amostras de doenças ósseas e em 81 amostras para confirmação de variantes identificadas pelo sequenciamento de nova geração. RESULTADOS: A sensibilidade da técnica de sequenciamento de nova geração foi estimada em 95,92% e a especificidade em 98,77%. Na casuística de doenças ósseas, a sensibilidade diagnóstica das amostras sequenciadas por Sanger foi de 69% (20/29), por painel customizado, 60% (75/125) e por exoma, 63% (12/19). Na casuística de RASopatias, a sensibilidade diagnóstica através do exoma foi de 46% (36/79). Como resultado deste trabalho, dois genes novos associados a RASopatias (LZTR1 e SOS2) e um associado a uma displasia esquelética (PCYT1A) foram identificados. Na análise das amostras sem conhecimento prévio da hipótese clínica foi obtida uma sensibilidade diagnóstica de 46,67% (21/45), mas que chegou a 73,08% (14/26) para as hipóteses de erros inatos do metabolismo. CONCLUSÕES: Foi demonstrado que a sensibilidade e a especificidade da técnica do sequenciamento de nova geração são altas e correspondentes a valores encontrados por outros grupos na literatura. Essa técnica foi considerada apropriada não apenas no contexto de pesquisa, demonstrado aqui pela descoberta de três novos genes associados a doenças mendelianas, como também para análises clínicas. Neste estudo a técnica foi aplicada com sucesso no contexto clínico, seja pelo painel customizado, seja pelo exoma, com uma positividade semelhante à encontrada pela técnica de Sanger. Mesmo na análise de amostras sem história clínica prévia foi possível identificar variantes patogênicas em quase metade dos casos, e numa porcentagem ainda maior quando a doença era um erro inato do metabolismo. Essa sensibilidade é comparável à obtida pela espectroscopia de massas em Tandem aplicada à triagem de múltiplas condições simultaneamente, o que sugere que a técnica do sequenciamento de nova geração poderá ser incorporada ao programa de triagem neonatal no futuro, ampliando o emprego de testes genéticos em complementaridade aos testes bioquímicos tradicionais / INTRODUCTION: In the last decade a new technique, the next generation sequencing, has emerged, which, contrary to the traditional Sanger method, performs parallel and high-throughput sequencing of multiple genes, or even all human genes, at a lower cost and with a faster analysis. This technique allowed the discovery of new genes responsible for several Mendelian diseases and has been quickly incorporated into the clinical context. OBJECTIVES: to compare the results of Sanger technique and next generation sequencing in control samples; to apply the next generation sequencing technique in the clinical practice to the cases of genetic skeletal disorders and RASopathies; to evaluate the diagnostic yield of this technique in samples without clinical data provided. METHODS: Next generation sequencing (in the form of a customized gene panel or exome) was performed in samples with mutations previously identified by Sanger sequencing and in two groups of Mendelian diseases, 144 patients with skeletal disorders and 79 patients with RASopathies, besides 90 samples with unknown clinical data (45 cases and 45 controls). The Sanger technique was applied in 29 samples of skeletal disorders and in 81 samples for confirmation of variants identified by next generation sequencing. RESULTS: The sensitivity of the next generation sequencing technique was estimated at 95.92% and the specificity at 98.77%. In the case of skeletal disorders, the diagnostic yield of the samples sequenced by Sanger was 69% (20/29), by customized panel, 60% (75/125), and by exome, 63% (12/19). In the individuals with RASopathies, the diagnostic yield through exome sequencing was 46% (36/79). As a result of this study, two new genes associated with RASopathies (LZTR1 and SOS2) and one associated with a skeletal dysplasia (PCYT1A) were identified. In the analysis of the samples without previous knowledge of the clinical hypothesis, a total diagnostic yield of 46.67% (21/45) was obtained, but it was up to 73.08% (14/26) in the group with hypothesis of inborn errors of metabolism. CONCLUSIONS: It was demonstrated that the sensitivity and specificity of the next generation sequencing technique are high and are similar to values found by other groups in the literature. The technique was considered appropriate not only for research, as demonstrated here by the identification of three new genes associated to Mendelian diseases, but also for clinical analysis. In this study the technique was successfully applied in the clinical context, both by customized panel and by exome, with positivity similar to that obtained by the Sanger technique. Even in the analysis of samples with no previous clinical history, it was possible to identify pathogenic variants in almost half of the cases, and an even greater percentage was obtained when the disease was an inborn error of metabolism. This sensitivity is comparable to that obtained by Tandem mass spectroscopy applied to multi-condition screening, suggesting that the next generation sequencing technique may be incorporated in the future into the neonatal screening program, increasing the use of genetic testing in complementarity to the biochemical tests

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é uma doença geneticamente determinada, caracterizada por hipertrofia ventricular primária, com prevalência estimada de 0.2% na população geral. Qualquer portador tem 50% de chance de transmitir esta doença para seus filhos, o que torna cada vez mais relevante a importância do estudo genético dos indivíduos acometidos e de seus familiares. Já foram descritas diversas mutações genéticas causadoras de CMH, a maioria em genes que codificam proteínas do sarcômero, e algumas mutações mais raras em genes não sarcoméricos. O objetivo desse estudo é sequenciar as regiões exônicas de genes candidatos, incluindo os principais envolvidos na hipertrofia miocárdica, utilizando o sequenciamento de nova geração (Generation Sequencing); testar a aplicabilidade e viabilidade deste sistema para identificar mutações já confirmadas e propor as prováveis novas mutações causadoras de CMH. Métodos e resultados: 66 pacientes não aparentados portadores de CMH foram estudados e submetidos à coleta de sangue para obtenção do DNA para analisar as regiões exômicas de 82 genes candidatos, utilizando a plataforma MiSeq (Illumina). Identificou-se 99 mutações provavelmente patogênicas em 54 pacientes incluídos no estudo (81,8%) relacionadas ou não a CMH, e distribuídas em 42 genes diferentes. Destas mutações 27 já haviam sido publicadas, sendo que 17 delas descritas como causadoras de CMH. Em 28 pacientes (42,4%) identificou-se mutação nos três principais genes sarcoméricos relacionados à CMH (MYH7, MYBPC3, TNNT2). Encontrou-se também um grande número de variantes não sonôminas de efeito clínico incerto e algumas mutações relacionadas a outras enfermidades. Conclusão: a análise da sequencia dos exônos de genes candidatos, demonstrou ser uma técnica promissora para o diagnóstico genético de CMH de forma mais rápida e sensível. A quantidade de dados gerados é o um fator limitante até o momento, principalmente em doenças geneticamente complexas com envolvimento de diversos genes e com sistema de bioinformática limitado. / Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM) is a genetically determined disease, estimated prevalence of 0.2% in the general population. Any of its carriers has 50% likelihood to pass it on to their children, and that makes the genetic study of these individuals and their relatives even more relevant. There have been several studies describing genetic mutations that cause HCM - the vast majority in genes responsible for sarcomere protein coding - and other rarer mutations in non-sarcomeric genes. The aim of this research is study exonic areas of specific genes, including the most important ones related to myocardial hypertrophy, identifying the genetic mutations that have already been documented, and possible new pathogenic mutations, using the high throughput DNA sequencing (NGS); testing the pplicability and viability to identify HCM-causing mutations. Methods and results: 66 unrelated patients with CM were studied and subject to blood sample in order to extract their genomic DNA to analyze exomic regions of 82 candidates genes, using the high throughput sequencing technology on MiSeg (Illumina) platform. In this study we identified 99 possible damaging mutations in 54 patients (81.8%) that could be related or not to HCM, and distributed in 42 different genes. 27 of this variants have already been published, and 17 of them have been described as HCM causes. 42,4% of the patients (28 individuals) have genetic mutations in the three main sarcomeric genes related to HCM (MYH7, MYBPC3, TNNT2). We also identified a large number of non-synonymous variants of uncertain clinical significance and some mutations related to other diseases. Conclusion: The exome analysis in candidates genes using NGS has demonstrated to be promising for the genetic diagnosis of HCM, in a short time with sensivity. The amount of data obtained in a short period of time is the main limiting factor, especially for genetically complex diseases that involve multiple genes.