Os pacientes que usam lítio (Li) para tratamento do transtorno bipolar freqüentemente apresentam poliúria e deficiência de concentração urinária, sintomas do Diabetes Insipidus nefrogênico (DIN). Animais tratados com Li apresentam baixos níveis de produção de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) em resposta ao hormônio antidiurético (HAD). O Sildenafil (Sil), um inibidor da fosfodiesterase 5 (PDE5), eleva os níveis intracelulares de guanosina monofosfato cíclico (GMPc), levando a inserção de aquaporina 2 (AQP2) na membrana plasmática das células do ducto coletor. Portanto, inibidores de PDE podem promover a inserção de AQP2 na membrana plasmática mesmo sem a ativação do receptor de HAD, indicando a participação de uma via alternativa mediada pelo GMPc. Nós investigamos o efeito do Sil na expressão renal das proteínas de membrana AQP2, UT-A1, NKCC2, NHE3, P-ENaC em ratos com DIN induzido pelo Li. Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: grupo controle, recebendo dieta alimentar normal durante quatro semanas; grupo Li, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas; grupo Li + Sil, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas e 200 mg por quilo de dieta de Sil a partir da segunda semana; grupo Sil, recebendo dieta alimentar normal durante a primeira semana e a partir da segunda semana recebendo dieta normal com 200 mg de Sil por quilo de dieta. Os animais do grupo Li desenvolveram poliúria, diminuição da osmolalidade urinária e diminuição da expressão da AQP2. No grupo Li+Sil, o Sil foi capaz de reverter parcialmente a poliúria, diminuir o clearance de água livre, aumentar a osmolalidade urinária e aumentar a expressão da AQP2. A expressão de UTA1 foi completamente normalizada com o tratamento com Sil. A expressão das proteínas NKCC2 e NHE3 apresentaram-se aumentadas no grupo tratado com Li, e o Sil não foi capaz de reverter tal alteração. Além disso, o tratamento com Sil reverteu completamente o aumento da resistência vascular renal. Assim, concluímos que o tratamento com Sil em ratos com DIN melhora a poliúria, aumenta a smolalidade urinária e diminui o clearance de água livre pelo aumento da expressão de AQP2 e UT-A1. O tratamento com Sil pode ser benéfico para pacientes que sofrem com DIN induzida pelo Li. / Patients taking lithium to treat bipolar disorder often present polyuria and urinary concentrating defect. In addition, lithium-treated animals present lower cyclic adenosine monophosphate production in response to vasopressin. Sildenafil (Sil), a phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitor, elevates intracellular cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels, leading to plasma membrane accumulation of aquaporin 2 (AQP2). Therefore, PDE inhibitors might induce AQP2 membrane insertion even without vasopressin receptor activation by activating a parallel cGMP-mediated signal transduction pathway. We investigated the effect of sildenafil on renal expression of AQP2, UT-A1, sodium/hydrogen exchanger (NHE3), type 1 bumetanide-sensitive Na-K-2Cl cotransporter (NKCC2), and the epithelial sodium channel alpha subunit (P-ENaC). Wistar rats received lithium (40 mmol/kg food) or not for 4 weeks (Li or control), some rats also receiving sildenafil (200 mg/kg food) in weeks 2-4, with or without lithium (Li+Sil or Sil). In Li+Sil rats, urine output was markedly lower, as was water free clearance, whereas urine osmolality was higher. Semiquantitative immunoblotting revealed the following: AQP2 expression was partially normalized; UT-A1 expression was completely normalized; expression of NKCC2 and NHE3 was significantly higher in Li rats (although not significantly different between Li+Sil rats and Li rats); and P-ENaC protein expression was unaltered in all groups. Sildenafil treatment completely reversed the lithium-induced increase in renal vascular resistance. In conclusion, sildenafil treatment of lithium-induced nephrogenic diabetes insipidus (NDI) improves polyuria, increases urinary osmolality, and decreases free water clearance via upregulation of renal AQP2 and UT-A1. Sildenafil treatment could be beneficial in patients with lithium-induced NDI.

A micróglia é essencial para a homeostase do Sistema Nervoso Central (SNC), função neuro-imune inata, e exerce papel importante na neurodegeneração, envelhecimento cerebral e tumorigênese. Gliomas difusos são tumores cerebrais primários caracterizados por crescimento infiltrativo e altas taxas de heterogeneidade, o que torna a doença praticamente incurável. Avanços em análises genéticas caracterizaram alterações moleculares relacionadas ao tempo de sobrevida e à resposta clínica desses pacientes, especialmente em glioblastomas (GBM). No entanto, a tumorigenicidade dos gliomas não é controlada unicamente por suas alterações genéticas. As interações entre as células tumorais, a micróglia residente e os macrófagos/monócitos infiltrados desempenham um papel crucial na modulação do crescimento e agressividade do glioma. Neste estudo, analisamos o fenótipo de ativação da micróglia/macrófagos em gliomas, incluindo astrocitomas e oligodendroglimas de diferentes graus de malignidade, apresentamos o perfil de expressão gênica da população pura de micróglia cortical e do tecido cerebral total correspondente. Usando sequenciamento de DNA de alta performance, classificamos as amostras de GBM em Proneural, Clássico e Mesenquimal. Em seguida, avaliamos os status de ativação da micróglia/macrófagos dessas amostras. Apesar do alto grau de heterogeneidade, pudemos observar níveis mais altos dos marcadores mielóides (IBA1, CD11b and CD68) em tumores astrocíticos comparados a tumores de origem oligodendrocítica e ao tecido não-neoplásico. Marcadores de anti-inflamação, como CD163, foram mais abundantes em astrocitomas, bem como em GBMs do subtipo Mesenquimal e Clássico; enquanto que marcadores de pró-inflamação, como IL1-beta, mostraram uma expressão mais heterogênea entre as amostras. Em seguida, micróglia foi isolada de 25 amostras de córtex parietal provenientes de autópsia de indivíduos cognitivamente preservados e foi feito o RNA-seq. Os resultados foram comparados à micróglia de camundongo e a outras células mielóides. Boa parte dos genes expressos pela micróglia humana foram similares àqueles expressos pela micróglia murina, como CX3CR1, P2YR12 e ITGAM. Porém, foram identificados genes de característica imune, abundantemente expressos na micróglia humana e não identificados na micróglia de camundongos, como TLR, Fcy, receptores do tipo SIGLEC, e fatores de transcrição NLRC5 e CIITA. A comparação dos dados de expressão gênica da micróglia com monócitos e macrófagos identificou novos marcadores que distinguem a micróglia humana de outras células mielóides. Nossos dados sobre a micróglia em gliomas sugerem características de imunossupressão e de pró-crescimento em tumores de pior prognóstico, ligado a um fenótipo específico de ativação das células mielóides. Este é o primeiro estudo a identificar o transcriptoma da micróglia humana pura, demonstrando que ela é claramente diferente da micróglia murina e de outras células mielóides. Esses resultados abrem portas para estudos de populações específicas de células mielóides em gliomas / Microglia are essential for central nervous system (CNS) homeostasis and innate neuroimmune function, and play important roles in neurodegeneration, brain aging and tumorigenesis. Diffuse gliomas are primary brain tumors characterized by infiltrative growth and high heterogeneity, which renders the disease mostly incurable. Advances in genetic analysis have characterized molecular alterations leading to impact on patients\' overall survival and clinical outcome, particularly in glioblastoma (GBM). However, glioma tumorigenicity is not controlled uniquely by its genetic alterations. The crosstalk between tumor cells, resident microglia and infiltrating monocytes/macrophages plays a crucial role in modulating glioma growth and aggressiveness. Here, we assess the activation status of microglia/macrophages in gliomas,including astrocytomas and oligodendrogliomas of different grades of malignancy, and present the gene expression profile of pure cortical human microglia and corresponding unsorted brain tissue. Using high-throughput DNA sequencing, we have classified GBM samples in Proneural, classical and mesenchymal. Next, we evaluated the activation status of microglia/macrophages within these samples. Despite the great heterogeneity, we observed higher levels of myeloid markers (IBA1, CD11b and CD68) in astrocytic tumors compared to oligodendrocytic ones and to non-neoplastic (NN) tissue. Anti-inflammation markers, such as CD163, are also more abundant in astrocytomas, as well as in the mesenchymal and classical GBM subtypes, while pro-inflammation markers, such as IL1-beta, show a more widespread expression throughout samples. Next, microglia were isolated from the parietal cortex of 25 autopsy samples of cognitively preserved humans and RNA sequenced. Overall, genes expressed by human microglia are similar to mouse microglia, such as CX3CR1, P2YR12, and ITGAM. Interestingly, a number of immune genes, not identified as mouse microglia signature genes, were abundantly expressed in human microglia, such as TLR, Fcy and SIGLEC receptors and NLRC5 and CIITA transcription factors. Comparison of microglia to monocyte and macrophage expression data underscored the CNS-specific functions of microglia and new markers were identified that distinguish human microglia from other myeloid cells. Our glioma-related data suggests an immune-suppressive and growth supportive characteristic for tumors with worse clinical outcome, linked to an activation profile of myeloid cells. This data is the first comprehensive pure human microglia gene expression profile; human microglia clearly differ from mouse microglia and other myeloid cells. These results will help further studies focusing on pure myeloid cells populations in glioma

A parede celular vegetal, estrutura essencial para as plantas, é extremamente importante para a economia humana, já que apresenta diversas utilidades, como por exemplo, fabricação de papel, fibras de vestuário, construção civil, entre outras. A maior parte da parede celular vegetal primária (aproximadamente 90%), é formada por polissacarídeos como celulose, hemiceluloses e pectinas. Os monossacarídeos, unidades formadoras dos polissacarídeos, são sintetizados, nas plantas, a partir de diferentes açúcares nucleotídeos, sendo que, o suprimento desses, pode afetar a biossíntese dos polissacarídeos da parede celular. Visando analisar o impacto da alteração do fluxo metabólico do carbono na composição da parede celular, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo alterar a composição dos polissacarídeos da parede celular de Nicotiana tabcum, através da modulação da expressão do gene uxs, responsável pela codificação da enzima UDP-D-glucuronato descarboxilase (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) que converte UDP-D-glucuronato em UDP-D-xilose, importante açúcar nucleotídeo, precursor do monossacarídeo xilose. Para isso, após a clonagem do gene uxs de ervilha, foram obtidas plantas transgênicas de tabaco superexpressando esse gene. Diversas análises foram realizadas para determinação da composição química da parede celular primária e secundária dessas plantas. Pela análise de FTIR da parede celular primária, verificou-se que três linhagens transgênicas apresentaram espectrotipos consistentes, indicando uma redução na quantidade de pectinas e ligações ésteres carboxílica nessas linhagens transgênicas. Apesar de não terem sido detectadas alterações na proporção dos monossacarídeos ramnose, xilose, arabinose, manose e galactose, e na quantidade de celulose, na parede celular primária das plantas transgênicas, foram observadas diferenças na proporção de galactose não esterificada, nas linhagens que apresentaram espectrotipo. Com relação à parede celular secundária, observou-se que algumas linhagens transgênicas apresentaram maior concentração de lignina solúvel relacionada a uma redução no conteúdo de lignina insolúvel. / The plant cell wall is not only an essential structure for plants, but also an extremely important raw material in human economy. The plant cell wall has diverse utilities, for example, papermaking, textile fiber, civil construction. Polysaccharides, such as cellulose, hemicelluloses and pectins, are the major components of the primary plant cell wall (approximately 90%). These polysaccharides are formed by monosaccharides, which are synthesized in the plant from different nucleotide sugars. The suppliment of the nucleotide sugars can affect plant cell wall polysaccharides biosynthesis. Aiming at analyzing the impact of the alteration in the metabolic carbon flux on cell wall composition, the objective of this research project was to alterate the plant cell wall polysaccharides composition by the modulation of the uxs gene. This gene encodes the UDP-D-glucuronic acid decarboxylase enzyme (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) that promotes the conversion of UDP-D-glucuronic acid to UDP-D-xylose, an important sugar nucleotide precursor of xylose monosaccharide. To achieve this goal, the pea uxs gene was cloned and transgenic tobacco plants overexpressing this gene were obtained. Several analyses were performed to determinate the primary and secondary cell wall composition of those transgenic plants. The primary cell wall analysis by FTIR identified three transgenic lines that show different spectrotypes compared to wild type and those transgenic spectrotypes had the same features. The results indicate a reduction of pectin and ester carbonyl binding in the transgenic plants. No alterations were detected in the monosaccharide (rhamnose, xylose, arabinose, manose and galactose) proportions and the amount of cellulose in the primary cell wall of the transgenic plants. Nevertheless, differences in the proportion of unesterified galactose were observed in the same transgenic lines that showed spectrotypes. With regard to secondary cell wall, some transgenic lines showed an increase in soluble lignin which is related to a reduction in insoluble lignin.

A osteoporose é uma doença de alta prevalência na população geral, e a ocorrência de fraturas se associa a grande morbi-mortalidade e impacto econômico. Na maioria dos indivíduos afetados, a osteoporose tem etiologia multifatorial, com herdabilidade estimada entre 50 e 85%, atribuível a um conjunto de variantes genéticas de pequeno efeito individual. Raramente, há casos de osteoporose associada a síndromes monogênicas, decorrentes de defeitos genéticos de grande impacto. Postula-se que indivíduos com quadros extremos de osteoporose não sindrômica possam ter causa genética mono- ou oligogênica, atribuível a variantes de impacto intermediário sobre o fenótipo, ainda pouco reconhecidas. Nos últimos anos, o avanço das tecnologias de sequenciamento permitiu o reconhecimento de novos genes associados à fragilidade óssea e atualmente possibilita a análise simultânea de múltiplos genes. Neste contexto, os objetivos deste projeto de pesquisa foram: 1) buscar genes candidatos para fragilidade óssea previamente associados a doenças Mendelianas com alto impacto na resistência óssea, fenótipos extremos de osteoporose e estudos de associação genética em escala genômica (GWAS) para osteoporose; e 2) pesquisar a presença de variantes alélicas patogênicas nestes genes candidatos em indivíduos com osteoporose grave, familiar ou idiopática. A partir de revisão sistemática, 128 genes candidatos foram selecionados para compor um painel de sequenciamento paralelo em larga escala. O sequenciamento incluiu todos os éxons e 25 pares de bases das junções íntron-éxon. Foram consideradas variantes genéticas de interesse aquelas raras (frequência alélica < 1%) e com predição de alto impacto sobre a proteína codificada. Trinta e sete indivíduos (7 famílias e 21 casos isolados) foram selecionados seguindo critérios clínicos, laboratoriais e densitométricos restritivos, excluindo-se pacientes com causas secundárias de osteoporose. A coorte foi composta por homens em 54%, a mediana de idade ao diagnóstico foi 44 anos e 86% tinham histórico de fratura. Dentre os 28 casos índices, foram identificadas 33 variantes de interesse. Após análise de segregação familiar, foi possível excluir patogenicidade de cinco destas variantes, restando 28 variantes potencialmente patogênicas, presentes em 71% da coorte. Todas as variantes foram encontradas em heterozigose, sendo 26 variantes de ponto não-sinônimas, uma deleção de 9 pares de bases, e uma grande deleção envolvendo o único éxon codificador do gene candidato GPR68. Foi encontrada uma associação de variantes em genes diferentes em 21% da coorte, incluindo uma mulher jovem com osteoporose grave e variantes em WNT1, PLS3 e NOTCH2. A análise de segregação familiar neste caso sugeriu um efeito patogênico aditivo das variantes. Vinte e cinco porcento das variantes potencialmente patogênicas foram identificadas em genes candidatos bem estabelecidos (WNT1, PLS3, COL1A1, COL1A2), e 57% se localizam em novos genes candidatos identificados inicialmente por GWAS, como NBR1 e GPR68, também associados à alteração da remodelação óssea em modelos animais. Os resultados deste trabalho dão relevância a novos genes na fisiologia da resistência óssea e indicam um papel proeminente de interações digênicas/oligogênicas em casos de osteoporose grave, familiar ou idiopática. O reconhecimento de novas vias associadas à fragilidade óssea pode levar ao desenvolvimento de novos tratamentos, e a identificação de variantes patogênicas associadas à osteoporose pode, futuramente, permitir um manejo clínico personalizado de pacientes e seus familiares / Osteoporosis is a highly prevalent disorder resulting in fragility fractures and incurring in great morbi-mortality and economic burden. In most cases, osteoporosis has a multifactorial etiology, with an estimated heritability of 50-85% attributable to a combination of several low-impact genetic variants. Rarely, cases of syndromic osteoporosis due to high-impact genetic defects are seen. It is therefore hypothesized that severe/idiopathic cases of otherwise inconspicuous osteoporosis may have a monoor oligogenic etiology due to genetic variants with an intermediate effect. During the past years, advances in molecular sequencing have revealed novel candidate genes for bone fragility, and have enabled simultaneous sequencing of multiple genes. In this context, the objectives of this research project were: 1) to identify candidate genes for bone fragility, as previously reported in association to Mendelian disorders with high impact on bone resistance, idiopathic or familial osteoporosis, and genome-wide association studies (GWAS) for bone mineral density and fragility fractures; and 2) to perform molecular analysis of these candidate genes in patients with severe, familial or idiopathic osteoporosis. Through a systematic review, 128 candidate genes were identified and included in a panel for massively parallel sequencing. Coding regions and 25-bp boundaries were captured and sequenced. Rare variants (allele frequency < 1%), with a predicted high impact on protein function were initially selected as variants of interest. Thirty-seven subjects (21 sporadic cases and 7 families) were included according to stringent criteria based on clinical and densitometric evaluation, excluding individuals with secondary osteoporosis. Males represented 54% of the cohort, median age at diagnosis was 44 years, and 84% of subjects had a history of fractures. Thirtythree variants of interest were identified initially. After familial segregation analysis, 5 variants were considered as benign in regard to bone fragility, resulting in 28 potentially pathogenic variants, all heterozygous, present in 71% of the cohort. Of these variants, 26 were nonsynonymous, there was one 9-bp deletion and one large deletion involving the only coding exon of candidate gene GPR68. An association of two or more variants in different genes was present in 21% of the cohort, including a young woman with severe osteoporosis and variants in WNT1, PLS3 and NOTCH2. Familial segregation in this case suggested an additive pathogenic effect of these variants. Twenty-five percent of potentially pathogenic variants were identified in well-established candidate genes (WNT1, PLS3, COL1A1, COL1A2), and 57% located to novel candidate genes initially identified by GWAS, such as NBR1 and GPR68, which have been previously associated to changes in bone remodeling in mouse models. These results support the involvement of GWAS genes in the pathophysyiology of osteoporosis, and indicate a prominent role for digenic/oligogenic interactions in cases of severe, familial or idiopathic osteoporosis. Recognition of new molecular pathways in the determination of bone fragility may lead to the development of new drugs, and the identification of pathogenic variants associated to osteoporosis may allow individualized clinical management of patients and their relatives

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2016-08-08T14:06:04Z No. of bitstreams: 1 arturenemarialinocarmo.pdf: 9897809 bytes, checksum: 80040aff8b9e00693411113ba82ed918 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-08-08T14:10:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 arturenemarialinocarmo.pdf: 9897809 bytes, checksum: 80040aff8b9e00693411113ba82ed918 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-08T14:10:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arturenemarialinocarmo.pdf: 9897809 bytes, checksum: 80040aff8b9e00693411113ba82ed918 (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / A tese de doutorado intitulada Síntese de Derivados Aminoquinolínicos e Nucleotídeos Não-Naturais, Potenciais Agentes Antiparasitários e Antibacterianos está apresentada em dois capítulos que descrevem a síntese de substâncias com potencial atividade antiparasitária e antibacteriana. Foram obtidos 46 compostos nesse trabalho, 31 compostos do capítulo 1, sendo 15 inéditos, e o restante foi desenvolvido durante a realização do capítulo 2, sendo 8 inéditos. O capítulo 1 apresenta a síntese de derivados quinolínicos funcionalizados usando a reação do tipo “click” para obtenção dos conjugados aminoquinolina/ácido cólico. Inicialmente é apresentada a obtenção dos derivados aminoquinolinas, aminoalcinoquinolinas e aminodialcinoquinolinas, estes dois últimos foram usados na reação do tipo “click” para obtenção dos derivados triazólicos, alguns também foram utilizados como ligantes na síntese de complexos de Pt (II). Um estudo da relação estrutura/atividade dos compostos sintetizados foi realizado, permitindo a verificação da importância biológica dos compostos. O segundo capítulo envolveu a síntese de derivados nucleotídicos não- naturais em que o grupo fosfato é substituído por um triazol e foi realizado no Instituto de Química Molecular de Reims na Universidade de Reims Champagne-Ardenne CNRS sob a coordenação da professora Dra. Pascale Clivio, / The doctoral thesis entitled “Synthesis of Derivatives Aminoquinolínicos and Non-Natural Nucleotides, Potential Antiparasitic and Antibacterial Agents” is presented in two chapters that describe the synthesis of substances with potential antibacterial and antiparasitic activity. 46 compounds were obtained in this work, Chapter 1 31 compounds, including 16 unpublished, and the remainder was developed during the course of Chapter 2, and 8 unpublished. Chapter 1 presents the synthesis of functionalized quinoline using the click reaction to obtain the conjugated aminoquinoline/cholic acid. Initially it is presented to obtain the derivatives aminokynolines, and aminoalkynoquinolines aminodialkynoquinolines, these two latter were functionalized using reaction type click to prepare the triazoles, some have also been used as binders in the synthesis of platinum (II) complexes. A study of the structure/activity of the synthesized compounds was performed by allowing verification of the biological importance of the compounds. The second chapter involved the synthesis of non-natural nucleotide in which the phosphate group is replaced by a triazole and was conducted at the Institute of Molecular Chemistry of the University of Reims Champagne-Ardenne Reims CNRS under the supervision of Professor Dr. Pascale Clivio,

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-06-22T11:07:10Z No. of bitstreams: 1 michelledelimadetoni.pdf: 1224744 bytes, checksum: a3734f99b34853e12e12fb5964be66e5 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:20:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 michelledelimadetoni.pdf: 1224744 bytes, checksum: a3734f99b34853e12e12fb5964be66e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:20:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 michelledelimadetoni.pdf: 1224744 bytes, checksum: a3734f99b34853e12e12fb5964be66e5 (MD5) Previous issue date: 2009-03-06 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Calliandra brevipes apresenta uma galha globosa (GG) e uma fusiforme (GF), induzidas por Tanaostigmodes mecanga e T. ringueleti, respectivamente. As variações sazonais no conteúdo fenólico de ambas as galhas, de caule e folha não galhados (CS e FS, respectivamente) foram analisadas durante 12 meses. O perfil de variação do teor fenólico nos tecidos galhados e não galhados de C. brevipes foi similar ao longo do período analisado, apresentando-se fortemente influenciado pelas variações na precipitação pluviométrica, ocorrendo maior acúmulo fenólico quando o vegetal estava sob estresse hídrico. Os conteúdos fenólicos de ambas as galhas foram similares e, no período de drásticas mudanças na precipitação pluviométrica, estes sofreram alterações significativamente menores do que as sofridas pelos tecidos não galhados, sugerindo que as duas espécies de Tanaostigmodes modulam o conteúdo fenólico no tecido galhado de maneira similar. Assim, notou-se que as alterações no conteúdo fenólico podem estar primariamente associadas às mudanças pluviométricas, constituindo uma defesa direta contra o estresse hídrico. Na triagem de metabólitos secundários, flavonóides, cumarinas e taninos foram detectados em tecidos galhados e não galhados de C. brevipes. Saponinas foram encontradas somente em amostras de tecidos não galhado, mostrando que as galhas apresentam menor toxicidade para o herbívoro. Triterpenóides foram encontrados em GG e esteróides em GF, sugerindo que cada galhador explora diferencialmente o metabolismo do hospedeiro. Adicionalmente, o conteúdo de flavonóides e a atividade antioxidante também estavam diferenciados em ambas as galhas, sendo maiores na galha fusiforme. Na análise cromatográfica e densitométrica de carboidratos, GG e GF apresentaram conteúdos de sacarose, glicose e frutose maiores do que os encontrados em tecidos não galhados, 1,5-3 vezes e 2 vezes, respectivamente. A análise de saponinas e carboidratos evidenciou que ambas as galhas apresentam menor toxicidade e constituem uma fonte mais nutritiva para o herbívoro do que o tecido não galhado. O fracionamento e a análise densitométrica de proteínas, detectou polipeptídeos comuns a ambas as galhas (80, 69, 61, 52, 32 kDa) provavelmente essenciais para a organização básica desta neoformação, bem como específicos a cada uma (galha globosa: 97, 75, 34 kDa; galha fusiforme: 40, 33 kDa) que podem estar associadas aos distintos morfotipos e suas vias metabólicas. Em conjunto, a análise de proteínas, flavonóides e a atividade antioxidante mostram que cada galhador manipula o hospedeiro de maneira peculiar, mesmo quando duas espécies galhadoras filogeneticamente tão próximas parasitam um hospedeiro comum. Quanto à análise fosfohidrolítica, CS hidrolisou igualmente ATP, ADP, UDP ou GDP. Na GG, o UDP, GDP, e ADP foram hidrolisados aproximadamente 1,5-3 vezes mais do que no CS, já o AMP foi 10 vezes mais hidrolisado na GG. Em conjunto, estes dados confirmam que este tecido exacerba os mecanismos capazes de hidrolisar nucleotídeos, possivelmente devido sua maior atividade metabólica. Atividades ADPásica e UDPásica de CS e GG foram 10-32% estimuladas por 5 mM de Ca2+, e inibidas pela adição de 5 mM EDTA ou EGTA (88 a 100%), confirmando a dependência destas atividades à cátions bivalentes. Uma pequena inibição por ortovanadato foi detectada sugerindo a presença de P-ATPases, enquanto azida sódica, DCCD e bafilomicina não inibiram significativamente a atividade ATPásica. Uma apirase de 75 kDa foi identificada em CS e GG de C. brevipes, e provavelmente contribuiu com a atividade fosfohidrolítica observada. Foi constatada a presença de apirase e de atividade ADPásica nas células nutritivas que delineiam a câmara larvar por microscopia de imunofluorescência e citoquímica, respectivamente. A alta atividade apirásica na galha globosa de C. brevipes pode estar associada à biossíntese de carboidratos, recuperação de nucleosídeos e/ou proliferação celular, contribuindo assim, para a nutrição e sobrevivência do galhador. / Calliandra brevipes presents globose (GG) and fusiform galls (GF) induced by Tanaostigmodes mecanga and T. ringueleti, respectively. The seasonal changes in phenolic content of both galls, and in non-galled stem and leaf were analyzed over one year. The phenolic variation profile of galled or non-galled tissues of C. brevipes was similar during the analyzed period, but it is strongly influenced by the variations in the pluviometric levels increasing during hydric stress. The phenolic levels were in similar amounts between the two galls and, in the period of drastic changes in pluviometric levels, the alterations were significantly higher in non-galled tissues when compared to the galled tissues, suggesting that the two distinct species of Tanaostigmodes manipulate the phenolic level in a similar way. Therefore, the alterations in phenolic contents could be primarily associated to the pluviometric changes, constituting a direct defense against the hydric stress. The phytochemical screening showed the presence of flavonoids, coumarins and tannins in galled and non-galled samples. Saponins were found only in non-galled samples, suggesting that the galled tissues are less toxic to the herbivory. Triterpenoids were detected in GG, but not in GF, suggesting that each inducer explore in a different way the plant metabolism. In addition, flavonoids content and antioxidant activity were differentiated in both galls, being significantly higher in fusiform gall. Chromatographic and densitometric analyses showed that GG and GF present sucrose, glucose and fructose contents 1.5-3 and 2 times higher, respectively than those found in non galled tissue. The secondary metabolites and carbohydrate analyses evidenced that both galls tissues are less toxic and constitute a better nutrient source for the herbivory than the non-galled tissues. Protein fractionation and densitometric analysis showed common polypeptides to both galls (80, 69, 61, 52, 32 kDa) possibly essentials for their basic neoformations, and specific polypeptides in either globose (globose: 97, 75, 34 kDa) or fusiform gall (40, 33 kDa), which could be associated to the different gall morphotypes and their metabolic pathways. Together, the protein, flavonoid and antioxidant analyses showed that each inducer, although closer phylogenetically, manipulate the host by specific pathways in the same plant. Phosphohydrolitic analysis showed that CS equally hydrolyzed either ATP, ADP, UDP or GDP. In GG, the UDP, GDP, and ADP were hydrolyzed approximately 1.5-3 folds higher than that found in CS. AMP hydrolyzes was 10 folds higher in GG confirming that this tissue increase their mechanisms capable of hydrolyzing nucleotides. ADPase and UDPase activities from CS and GG were 10-32% stimulated by 5 mM calcium, and inhibited by the addition of 5 mM EDTA or EGTA (88 to 100%), thus confirming the divalent cation dependence. Little ATPase inhibition by orthovanadate was detected suggesting the presence of a P-type ATPase, while sodium azide, dicyclohexylcarbodiimide, and bafilomycin did not affect significantly the ATPase activity. A band of 75 kDa was recognized by polyclonal anti-potato apyrase antibodies in CS or GG, confirming the presence of an apyrase in Calliandra brevipes. By immunofluorescence microscopy, using anti-potato apyrase antibodies, and by cytochemical techniques, using ADP as substrate, the apyrase was located on the external surface and inside of the nutritive cells that compose the central chamber. The high apyrase activity in globose gall of C. brevipes could be participating in carbohydrate biosynthesis, in the salvage pathway of nucleosides and/or cell proliferation, for the feeding and survival of the insect.

Orientadores: Laura Maria Mariscal Ottoboni, Renato Vicentini dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T09:49:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_LeticiaBianca_M.pdf: 1491955 bytes, checksum: 27250de5b6befc98f75efec2d387c23d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A mineração é um importante setor econômico brasileiro que envolve grande concentração de capital e está em constante crescimento. A drenagem de mina é a principal perturbação ambiental causada pelas diferentes etapas de mineração e compromete a qualidade do solo, da água superficial e subterrânea e, consequentemente, toda a biodiversidade. A drenagem consiste em uma solução percolante rica em metais pesados, ferro e enxofre. Apesar de suas caracteristicas extremas, a drenagem de mina fornece um ambiente favorável para o crescimento de diversos micro-organismos os quais podem ser usados em tecnologias como a biorremediação, a biolixiviação e outras aplicações. Neste trabalho, foi realizado o pirosequenciamento do gene rRNA 16S de seis amostras de solo em um canal de drenagem neutra de mina e seis amostras de solo ao lado do canal para avaliar diferenças na composição, estrutura e diversidade das comunidades bacterianas desses ambientes na mina de cobre do Sossego, Brasil. Os parâmetros químicos, as análises de similaridade ANOSIM, escalonamento multidimensional não métrico (MDS) e a comparação entre os índices de diversidade revelaram uma diferença entre as amostras de solo e drenagem em termos de composição e estrutura da comunidade, mas não em riqueza de espécies. Análises estatísticas mostraram que o filo Deinococcus/Thermus, especialmente o gênero Meiothermus, foi em grande parte responsável pelas diferenças entre as comunidades, e foi positivamente associado com a presença de cobre e outros metais pesados nas amostras ambientais. Outros parâmetros importantes que influenciaram a diversidade e composição bacteriana foram os elementos potássio, sódio, níquel e zinco, bem como o pH. Análises estatísticas e da microbiota núcleo da comunidade bacteriana da drenagem revelaram que a comunidade variou ao longo do canal de escoamento em estrutura e diversidade de espécies. A comunidade da drenagem apresentou uma OTU (Unidade Taxonômica Operacional) generalista, identificada como Meiothermus e nenhuma OTU especialista foi encontrada. A microbiota da drenagem é basicamente formada por bactérias heterotróficas, com gupos resistentes a metais e à sal e com potencial para a degradação de diversos compostos xenobióticos, além de apresentar grupos bacterianos ainda pouco caracterizados. A comunidade bacteriana do solo, assim como a comunidade da drenagem, também variou ao longo do canal. Foram encontradas duas OTUs generalistas e duas OTUs especialistas. A microbiota do solo é basicamente formada por bactérias heterotróficas, com alguns grupos resistentes a metais. No entanto, grande parte da microbiota núcleo desse ambiente permanece pouco caracterizada. Os resultados obtidos contribuem para a compreensão da diversidade bacteriana em solos impactados por drenagem neutra de mina, e demonstram que os metais pesados têm um papel importante na formação da comunidade microbiana nesse tipo de ambiente / Abstract: Mining is an important and constantly growing Brazilian economic sector that involves large investiments. Mine drainage is an important environmental disturbance caused by the different steps of the mining and compromises the quality of soil, surface water, and underground water bodies, hence affecting the biodiversity. Mine drainage consists in a percolating solution that is rich in heavy metals, iron and sulfur. Despite the extreme characteristics, the mine drainage provides a favorable environment for many microorganisms that can be used in bioremediation, bioleaching and others applications. In this work, a pyrosequencing approach of the 16S rRNA gene, of six soil samples from a neutral drainage channel and six soil samples next to the channel, was used to evaluate differences in composition, structure, and diversity of bacterial communities at the Sossego¿s copper mine in Brazil. The chemical parameters, the analyses of similarity ANOSIM, non-metric multidimensional scaling and the comparison of the diversity indices revealed differences between the drainage and the soil samples in composition and structure of the microbial community, but not in their species richness. The statistical analysis showed that the phylum Deinococcus/Thermus, especially the Meiothermus genus, was in large part responsible for the differences observed between the communities, and was positively associated with the presence of copper and other heavy metals in the environmental samples. Other important parameters that influenced the bacterial diversity and composition were the elements potassium, sodium, nickel and zinc, as well as the pH. Statistical analysis of the Shannon index and the analysis of the core microbiota of the drainage¿s bacterial community revealed that it changed along the flow channel in structure and diversity. The community of the drainage presented one generalist OTU (Operational Taxonomic Unit), identified as Meiothermus and no specialist OTU was founded. The microbiota of the drainage was basically formed by heterotrophic bacteria, with groups resistant to metals and salt and with the potential for degradation of a large number of xenobiotic compounds. Bacterial groups poorly characterized were also identified. Analyses of the soil samples revealed a heterogeneous bacterial community. Two generalist OTUs and two specialist OTUs were found. The soil microbiota was basically formed by heterotrophic bacteria, with some groups resistant to metals, however, much of the core microbiota of that environment remains poorly characterized. These findings contribute to the understanding of bacterial diversity in soils impacted by neutral mine drainage, and demonstrate that heavy metals play an important role in shaping the microbial community in mine environments / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de níveis de nucleotídeos nas dietas de leitões recém-desmamados sobre o desempenho, a morfometria de órgãos e a histologia do epitélio intestinal. Foram utilizados 144 leitões desmamados aos 21 dias de idade e com peso médio inicial de 5,80 ± 0,16 kg em um experimento inteiramente ao acaso, com seis tratamentos, seis repetições por tratamento e quatro animais por baia (unidade experimental). Os tratamentos foram: Am (antimicrobiano) dieta basal com inclusão de 40 ppm de sulfato de colistina, assim como dieta basal com 0, 150, 300, 450 e 600 ppm de nucleotídeos. Ao final do experimento, foi abatido um animal de cada baia para coleta das amostras para avaliação da morfometria de órgãos e da histologia do epitélio intestinal. No período de 1 a 14 dias de experimentação, houve piora linear (P<0,01) das variáveis de desempenho, enquanto que no período total de 34 dias, houve redução linear (P=0,03) do peso final dos animais com o aumento dos níveis de nucleotídeos na dieta. Os leitões alimentados com a dieta com o antibiótico colistina apresentaram maior (P<0,01) comprimento do intestino delgado e menor (P<0,01) relação altura de vilosidade:profundidade de cripta (AV:PC) no duodeno do que aqueles que receberam nucleotídeos. Foi observado, também, aumento linear (P<0,01) no peso relativo do baço, assim como redução linear (P<0,01) da relação AV:PC e redução linear (P<0,01) da profundidade de cripta no duodeno dos animais em função da adição de nucleotídeos na dieta. Assim, embora os níveis de até 600 ppm de nucleotídeos em dietas complexas de leitões recém-desmamados não tenham proporcionado melhora no desempenho, eles acarretaram benefícios à morfometria de órgãos e à histologia do epitélio intestinal dos animais. / The purpose of this work was to evaluate the effects of dietary nucleotide levels on performance, organs morphometry and intestinal histology of weanling pigs. One hundred and forty-four pigs weaned at 21 days of age and 5.80 ± .16 kg initial live weight were used a completely randomized design experiment with six treatments, six replications per treatment and four animals per pen (experimental unit). The treatments were: Am antimicrobial: basal diet with 40 ppm of colistin sulfate and basal diet with 0, 150, 300, 450 and 600 ppm of nucleotides. At the end of experimental period, an animal of each pen was slaughtered to evaluate of organs morphometry and intestinal epithelium histology. For the 1 to 14 days of experimental period, dietary nucleotides depressed linearly (P<.01) performance traits, while for the total experimental period of 34 days linear reduction of final live weight (P=.03) was observed with added nucleotides. Pigs fed diet with colistin showed greater (P<.01) length of small intestine and lower (P<.01) villus height:crypt depth ratio (AV:PC) of duodenum than those fed nucleotides. Also, a linear increase (P<.01) of relative weight of spleen, as well as a linear reduction (P<.01) of AV:PC and linear reduction (P<.01) of crypt depth of duodenum were observed with added dietary nucleotides. Therefore, although added nucleotides up to 600 ppm in complex diet did not improve performance, they showed some beneficial effects on organs morphometry and intestinal epithelium histology of weanling pigs.

O Vírus Respiratório Sincicial Humano (HRSV) é considerado o principal causador de doenças agudas do trato respiratório inferior durante a infância, sendo o principal responsável por um elevado índice de hospitalização de crianças com até cinco anos de idade. Possui distribuição mundial, podendo acometer todas as faixas etárias, entretanto as crianças de 6 semanas a 9 meses são as que desenvolvem problemas mais sérios, como pneumonia e bronquiolite. A epidemia de HRSV apresenta uma sazonalidade bem clara, ocorrendo anualmente no período de outono tardio, inverno ou início da primavera, mas não durante o verão. No presente estudo foi realizada a análise da região G2 da glicoproteína G do HRSV. Um total de 44 amostras positivas para o HRSV do Hospital Universitário (HU) da Universidade de São Paulo (USP), nos anos de 2007-2008, foram seqüenciadas e posteriormente analisadas, sendo então comparadas com seqüências obtidas do NCBI/GeneBank. A análise filogenética mostrou que os genótipos GA2 e GA5, do grupo A, foram os predominantes nos anos de 2007 e 2008, alternando o padrão verificado nos anos anteriores, onde os genótipos do grupo B foram altamente predominantes. A comparação das mutações sinônimas e não sinônimas mostrou uma grande evidência de seleção positiva nos genótipos GA2 e GA5 do grupo A. / Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV) is considered the most common cause of lower respiratory tract disease in infants and young children and are the main guilty for the elevated children hospitalizations rate under 5 years of age. The HRSV has a world-wide distribution, being able to attack all the ages however the 6 weeks to 9 months children of are the ones that develop more serious problems as pneumonia and bronquiolite. The HRSV outbreak presents a well defined season, occurring annually in the delayed falls period, winter or springs beginning, but not during the summer. In the present study, we performed a phylogenetic analysis from G2 region of HRSV G glycoprotein. Forty four samples positive for HRSV from University Hospital (UH) of University of Sao Paulo (USP) in 2007-2008, were submitted to sequencing by PCR and compared with GenBank sequences. Phylogenetic analysis revealed that HRSV group A genotypes GA2 and GA5 was the predominant in 2007-2008, alternating the standard verified in the previous years, where the group B genotypes had been highly predominant. Comparison of the synonymous/nonsynonymous mutation ratios showed greater evidence for positive selection pressure for group A genotypes GA2 and GA5.

Introdução: A cardiomiopatia hipertrófica (CH) é uma doença cardíaca estrutural primária, caracterizada por hipertrofia do ventrículo esquerdo, sem dilatação, geralmente assimétrica e predominantemente septal. Na população geral a prevalência estimada da CH é de 0,2% (1:500), correspondendo a 0,5% de todas as cardiopatias. Atualmente estão descritas mais de 1400 mutações associadas à CH em 20 genes relacionados com os miofilamentos do sarcômero, o disco-Z e o transporte de cálcio, sendo que os três mais associados são os genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2, responsáveis por 50% do casos com diagnóstico molecular positivo no Brasil. Dessa forma, o advento de novas tecnologias de sequenciamento de DNA de alta performance promete revolucionar o diagnóstico molecular, tornando mais rápida e barata a identificação de alterações genéticas, impactando positivamente na custo-efetividade do manejo diagnóstico e terapêutico de pacientes e famílias com o diagnóstico de CH. Materiais e Métodos: Noventa e uma amostras de uma casuística de pacientes não relacionados, portadores de CH com diagnóstico molecular prévio para os 3 genes mais associados (19 positivas e 72 negativas) foram utilizadas juntamente com uma amostra referência do HapMap (NA12878) na validação de um pipeline proposto para a identificação de alterações genéticas em um painel com 74 genes associados à cardiomiopatias hereditárias, utilizando a plataforma Ion Torrent PGM. A etapa de chamada de variantes foi testada em dois limiares diferentes de cobertura de sequenciamento (30x e 10x) e três limiares de frequência de alelo variante (35%, 25% e 20%). A amostra NA12878 foi utilizada na aferição de valores de reprodutibilidade intra e inter-ensaio. As amostras da casuística de CH com diagnóstico molecular prévio negativo foram utilizadas na análise de ganho diagnóstico. Eram consideradas alterações potencialmente patogênicas aquelas que apresentassem associação prévia com CH ou classificação deletéria em dois de três algoritmos de predição de impacto funcional (PROVEAN, SIFT, PolyPhen2) e MAF<0,01, se disponível. Resultados: A plataforma de sequenciamento utilizada apresentou desempenho aceitável, gerando em média 165,9 ±13,1 Mb, com um valor médio de 146,9 ± 11,54 Mb acima de PhredQ>=20, por amostra. O valor médio de cobertura de sequenciamento por amostra foi de 250 ± 23,94x, com 95,2% das regiões alvo cobertas pelo menos 10x. A sensibilidade máxima observada para SNVs foi de 96,7% enquanto que para InDels foi 28,5%. Os valores de reprodutibilidade inter e intra-ensaio de 89,5% e 87,3%, respectivamente. Das 72 amostras negativas, 35 puderam ser reclassificadas como positivas, sendo que os dois genes com mais ocorrências de alterações genéticas foram FLNC e TRIM63, ambos já relacionados com CH. Vinte e duas amostras foram reclassificadas como inconclusivas e 15 permaneceram negativas. O ganho diagnóstico foi de 21,5%. Conclusões: A plataforma Ion Torrent PGM apresenta potencial no sequenciamento de genes relacionados à cardiomiopatias hereditárias e o pipeline validado mostrou valores analíticos praticáveis em uma rotina diagnóstica. A utilização do painel genético ampliado se mostrou viável na detecção de alterações genéticas, propiciando uma boa margem de ganho diagnóstico em comparação com o sequenciamento apenas dos três genes mais associados à CH / Introduction: Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a primary cardiac disease, mainly characterized by unexplained left ventricle hypertrophy, in the absence of dilatation, usually asymmetric and predominantly septal. The estimated prevalence is 1:500 individuals in the general population, corresponding for 0.5% of all cardiac diseases. Up to now, more than 1400 mutations are associated with HCM in 20 genes related with sarcomeric myofibrils, Z-disc and calcium homeostasis, wherein the 3 most associated genes are MYH7, MYBPC3 and TNNT2, accounting for 50% of cases with positive molecular diagnostics in Brazil. Thus, the advent of new high throughput DNA sequencing technologies promise to revolutionize the use of molecular diagnostics, turning the identification of genetic mutations in a fast and cheap practice, increasing the cost-effectiveness of diagnostic and treatment of patients and families with HCM. Materials and Methods: Ninety one samples from an HCM casuistic of unrelated individuals with previous molecular diagnostics for the three most HCM-associated genes (19 positives and 72 negatives) were processed along with a reference HapMap sample (NA12878) in the validation process of a pipeline proposed for the detection of genetic alterations in a genetic panel composed of 74 genes associated with inherited cardiomyopathies, using Ion Torrent PGM platform. The variant call step was tested for two cutoffs of sequencing coverage (30x and 10x) and three cutoffs of variant allele frequency (35%, 25% and 20%). The sample NA12878 was used in the assessment of intra and inter-assay reproducibility. Negative samples from the HCM casuistic were used in the assessment of diagnostic yield. Variants were considered potentially pathogenic if previously described as associated with HCM or if presenting a deleterious score in at least two of three impact prediction algorithms tested (PROVEAN, SIFT and PolyPhen-2) and MAF < 0.01, if available. Results: The chosen next-generation sequencing platform presented an acceptable performance, with a mean throughput of 165,9 ±13,1 Mb, with a mean value of 146,9 ± 11,54 Mb above PhredQ >= 20. Mean sequencing coverage was 250 ± 23,94x, wherein 95.2% of target bases were covered at least 10x. Maximum achieved sensitivity for SNVs was 96.7% while for InDels was 28.5%. Both values of inter and intra-assay reproducibility were 89.5% and 87.3%, respectively. Of all 72 negative samples, 35 were reclassified as positive with the two most frequently mutated genes being FLNC and TRIM63, both already associated with HCM. Twenty two samples were reclassified as inconclusive and 15 remained negatives. Diagnostic yield was 21.5%. Conclusions: Ion Torrent PGM platform presented a feasible potential for the sequencing of inherited cardiomyopathies-associated genes and the designed pipeline presented reliable analytical values for diagnostic use. The expanded panel proved to be a good strategy for the detection of genetic alteration providing a good value of diagnostic yield in comparison with the sequencing of the three most HCM-associated genes alone