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This work was performed in the framework of two application-oriented research projects that focus on the generation and evaluation of fluorescent Saccharomyces (S.) cerevisiae-based sensor and reporter cells for white biotechnology as well as the extension of the conventional single-cell/single-construct principle of ordinary yeast biosensor approaches. Numerous products are currently generated by biotechnological processes which require continuous and precise process control and monitoring. These demands are only partially met by physical or physiochemical sensors since they measure parameters off-line or use surrogate parameters that consequently provide only indirect information about the actual process performance. Biosensors, in particular whole cell-based biosensors, have the unique potential to near-line and long-term monitor parameters such as nutrient availability during fermentation processes. Moreover, they allow for the assessment of an analyte’s biological relevance. Prototype yeast sensor and reporter strains derived from common laboratory strains were transformed with multicopy expression plasmids that mediate constitutive or inducible expression of a fluorescence reporter gene. Performance of these cells was examined by various qualitative and quantitative detection methods – representative of putative transducer technologies. Analyses were performed on the population level by microplate reader-based fluorometry and Western blot as well as on the single-cell level by fluorescence microscopy and flow cytometry. ‘Signature’ promoters that are activated or repressed during particular nutrient-limited growth conditions were selected in order to generate yeast nutrient sensor strains for monitoring the biological availability of nitrogen, phosphorus or sulphur. For each category, at least one promoter mediating at least threefold changed green fluorescence levels between sensor cells in non-limited and nutrient-limited conditions was identified. Sensor strains were evaluated in detail regarding sensitivity, analyte selectivity and the ability to restore basic fluorescence after shift from nutrient-limited to non-limited conditions (regeneration). The applicability for bioprocess monitoring purposes was tested by growth of yeast nutrient sensor cells in microalgae media and supernatants. Despite successful proof of principle, numerous challenges still need to be solved to realise prospective implementation in this field of white biotechnology. The major drawback of plasmid-borne detection constructs is a high fluorescence variance between individual cells. By generation of a nitrogen sensor strain with a genome-integrated detection construct, uniform expression on the single-cell level and simultaneous maintenance of basic properties (ability of fluorescence induction/regeneration and lack of cross-reactivity) was achieved. However, due to the singular detection construct per cell, significantly weaker overall fluorescence was observed. The traditional single-cell/single-construct approach was expanded upon in two ways. Firstly, a practical dual-colour sensor strain was created by simultaneous, constitutive expression of a red fluorescence reporter gene in green fluorescent nitrogen sensor cells. Secondly, an innovative cellular communication and signal amplification system inspired by the natural S. cerevisiae pheromone system and mating response was established successfully. It features the yeast pheromone alpha-factor as a trigger and alpha-factor-responsive reporter cells which express a fluorescence reporter gene from the pheromone-inducible FIG1 promoter as an output signal. The system was functional both with synthetic and cell-secreted alpha-factor, provided that recombinant cells were deleted for the alpha-factor protease Bar1p. Integration of amplifier cells which secrete alpha-factor in response to stimulation with the pheromone itself could increase the system\'s sensitivity further. Signal amplification was demonstrated for phosphorus sensor cells as a proof of concept. Therefore, the alpha-factor-based cellular communication and signal amplification system might be useful in applications that suffer from poor signal yield. Due to its modular design, the system could be applied in basically any cell-based biosensor or sensor-actor system. Immobilisation of the generated sensor and reporter cells in transparent natural polymers can be beneficial considering biosensor fabrication. Functionality of sensor and reporter cells in calcium-alginate beads or nano-printed arrays was successfully demonstrated. For the latter setup, fluorescence scanning and software-assisted fluorescence quantification was applied as a new detection method. In an experiment using an agarose-based two-compartment setup proposed by Jahn, 2011, properties of the alpha-factor-based cellular communication and signal amplification system after immobilisation were tested. These studies provide an initial experimental basis for an appropriate geometry of miniaturised immobilisation matrices with fluorescent yeast sensor and reporter cells in prospective biosensor designs.

Hcm1, es un factor transcripcional de la familia de los forkhead en Saccharomyces cerevisiae. Los factores forkhead se encuentran evolutivamente conservados, desde levaduras hasta humanos. En mamíferos estos factores regulan diversos procesos, entre ellos el ciclo celular, la supervivencia y la proliferación en respuesta a factores de crecimiento. Además, los factores FoxM, FoxO y sus ortólogos, participan en procesos como el envejecimiento y en enfermedades como el cáncer. Los estudios sobre Hcm1 en S. cerevisiae, indican que este factor es un regulador de la formación del spindle pole y de la expresión del cluster de genes necesarios en la fase S del ciclo celular. En el presente trabajo se estudió la regulación de Hcm1 sobre nuevos procesos celulares. En primer lugar, se demostró que Hcm1 regula positivamente la masa mitocondrial, el número de copias de ADN en esta organela y su actividad metabólica. Además, induce la metabolización de la glucosa favoreciendo el proceso oxidativo sobre la fermentación. Este cambio metabólico inducido por Hcm1, viene acompañado por una mayor resistencia celular al estrés. Además, se demostró que Hcm1 responde al estrés oxidativo aumentando su localización nuclear y su actividad transcripcional. Esta misma respuesta se observó cuando las células eran sometidas a restricción de glucosa o nitrógeno. En esta dirección estudiamos los mecanismos regulatorios de estas respuestas y se determinó que Sir2, una histona deacetilasa NAD+-dependiente relacionada con el envejecimiento y el silenciamiento genético, interacciona con Hcm1 y regula la respuesta a estrés de Hcm1. Paralelamente, analizamos la implicación de las vías AMPK y TOR/Sch9 en la regulación de Hcm1. De esta manera, demostramos que ambas vías son reguladoras de la respuesta de Hcm1 a restricción nutricional, ya que experimentos in vitro indicaron que Snf1 y Sch9 fosforilan Hcm1. El análisis de la expresión génica en la cepa salvaje y en el mutante hcm1, en diferentes puntos de la curva de crecimiento del cultivo, indicó que genes que se inducen durante esta cinética, y que están relacionados con el estrés y el metabolismo, son regulados por este factor. Los resultados obtenidos en este trabajo, permiten concluir que, además de su implicación en el ciclo celular, Hcm1 es un factor clave en la adaptación temprana de las células a la restricción nutricional y en la posterior entrada en fase diáuxica, a través de la inducción de metabolismo oxidativo mitocondrial y la respuesta a estrés. / Hcm1 is a forkhead transcription factor in Saccharomyces cerevisae. The forkhead factors are evolutionary conserved from yeast to human. In mammals, these factors regulate different processes, among them, cell cycle, cell survival and cell proliferation in response to growth factors. Moreover, FoxO, FoxM and their orthologues have been related to the aging process and cancer. Studies on Hcm1 in S. cerevisae indicate that this factor is related to spindle pole dynamics and the regulation of the cluster of genes required during the S phase of the cell cycle. In this work we studied Hcm1 implication on novel cellular processes. First, we demonstrated that Hcm1 positively regulates mitochondrial mass, mtDNA copy and mitochondrial activity. In addition, Hcm1 favours oxidative metabolism of glucose over its fermentation. This metabolic shift, is accompanied by an increase in cellular stress resistance. In response to oxidative stress treatments, Hcm1 shifts to the nucleus and its transcriptional activity is activated. A similar Hcm1 response was observed when the cells were submitted to glucose or nitrogen restriction. Additionally, we analyzed the regulatory mechanisms behind these responses. We demonstrated that Sir2, a NAD+ dependent histone deacetylase involved in aging and genetic silencing, interacts with Hcm1 and regulates its response to oxidative stress. In parallel, we analyzed the role of AMPK and TOR/Sch9 pathways on Hcm1 regulation. In this context, we observed that both pathways regulate Hcm1 in response to nutrient restriction in vivo. Moreover, Snf1 and Sch9 phosphorylate Hcm1 in vitro. Gene expression analysis on wild type cells and in hcm1 mutant at different points along the growth curve, indicated that genes that are upregulated during this kinetic and are related to stress response and metabolism, are regulated by Hcm1. Taken together, our results indicate that Hcm1 not only regulates cell cycle dynamics, but is also a key factor in the early adaptation of the cells to nutrient deficiency and later, to the entry into the diauxic phase. This adaptation is mediated by Hcm1 induction of oxidative metabolism and stress response.

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<p>Earth’s ecosystems emerge from interconnected biosphere, geosphere, and atmosphere processes. Changes to any one process ripple through the Earth system, affecting other processes. As global climate change continues, nitrogen deposition is anticipated to increase and precipitation is expected to have varied changes across the globe. These changes to the atmosphere and geosphere will have implications for the biosphere. Namely, vegetation will be impacted by changes to nutrient and precipitation regimes. Vegetation comprises the aggregate strategies of individual plants, which are also influenced by changes in nutrient and water availability. The responses of individual plants to nitrogen, water, and uncertainty are the main focus of this dissertation, as understanding those will be critical to scaling up to the aggregate.</p> <p> First, I describe a mathematical model that predicts grassland root and shoot biomass across carbon, nitrogen, and water gradients. The model simulates competition among plants by dynamically allocating carbon to either root or shoot growth depending on the growth strategy employed by the other plant. I show that the model accurately predicts root net primary productivity (NPP), but performs poorly for shoot and total NPP. At the biome scale, modeled NPP does not vary with water alone but rather water and nitrogen interact to influence NPP. Second, I conduct a greenhouse experiment using <em>Eragrostis capillaris</em> (L.) Nees to examine the predictions of the model mentioned above to answer the question: how do water and nitrogen affect fitness and biomass allocation in a drought-tolerant C4 grass? And ask: what is the nature of the relationship between water and nitrogen as resources? I show that water was important for increasing shoot and total biomass, but that root biomass and root:shoot ratio was influenced interactively by water and nitrogen as predicted by the model. I conclude that the nature of the relationship between water and nitrogen was that of either interacting or hemi-essential resources. That is, additional water was able to partially substitute for limited nitrogen to maintain biomass. Third, I explore how information theory can apply to plants that face uncertainty in resource availability and briefly review the types and sources of information and the mechanisms that plants use to perceive and respond to their environment. Overall, my framework posits that plants interpret information from their surroundings as an emergent property of distributed information processed by a network of cells. I end with a prospectus of directions for future research, including decoding signal from noise, storage of information, strategies to cope with information entropy, additional means of information transmission, and two-way information signaling with biotic partners. Finally, I use the information theory framework discussed above to answer the questions: can plants sense and respond to information entropy? I explore this question using data from an experiment which altered the temporal supply of nutrients and found no support that <em>P. sativum</em> can sense and respond to entropy. Understanding the relationships of water, nitrogen, and uncertainty is critical to predicting plant growth, especially as climate change continues to influence the global system.</p>

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Ziel dieser Arbeit war es, das Verständnis über Reaktionen von Tomaten auf limitiertes Nährstoffangebot zu verbessern. In der Kontrollbehandlung (100% Biomassewachstum) wurden Pflanzen ohne Nährstofflimitierung kultiviert. Bei den Mangelvarianten wurde entweder K, Mg oder N kontinuierlich in Raten angeboten, die das Wachstum auf etwa 80% (leichter Mangel) oder 60% (starker Mangel) der Kontrolle reduzierten. Dieser Versuchsansatz ermöglichte es, pflanzliche Reaktionen auf eine gut definierte Intensität von Mangel an K, Mg und N zu vergleichen. Nährstofflimitierung veränderte die Biomasse- und Nährstoffallokation auf die verschiedenen Pflanzenorgane, wobei diese Veränderungen sich je nach Nährstoff unterschieden, aber nicht von der Intensität des Mangels abhängig waren. Die Wirkungen von Nährstofflimitierung auf morphologische Wurzel- und Sprosseigenschaften waren ebenfalls Nährstoff-spezifisch und nicht abhängig von der Intensität des Mangels. Die Wirkungen auf die Fruchtqualität, z.B. den Gehalt an Zuckern, Lycopin und Vitamin C waren Nährstoff-spezifisch und bei einigen Parametern auch von der Intensität des Mangels abhängig. Die Pflanzenreaktionen auf Mg-Mangel wurden in größerem Detail untersucht. In den ersten 6 Tagen nach Beginn der Limitierung nahmen die Mg-Konzentrationen in allen Organen stark ab, ohne Wirkung auf das Wachstum und die Photosynthese. Mangel erhöhte die Blattzuckergehalte, aber die Zuckerakkumulation stand in keiner Beziehung zur Photosyntheserate. Diese nahm erst ab, wenn die Blatt-Konzentrationen auf Werte unterhalb von 0,1 bis 0,2 mg Mg g-1 Frischmasse abgesunken waren. In Mg-Mangelpflanzen akkumulierten Zucker in den Sourceblättern sogar wenn das Source/Sink-Verhältnis in den Pflanzen durch Beschattung der basalen Blätter stark verringert wurde. Das stimmt mit der Annahme überein, dass Mg-Mangel aufgrund einer Inhibierung der Phloembeladung den Zuckerexport aus den Blättern verringert. / This thesis aims to increase our understanding about plant responses to K, Mg and N limitation and their relationship with fruit quality of tomato. In the control treatment (100% biomass growth), plants were grown at high nutrient concentration. In the nutrient-limitation treatments, either K or Mg or N was supplied continuously at rates, which reduced biomass growth to about 80% (mild deficiency) or 60% (severe deficiency) of the control. This experimental approach allowed comparing long-term plant responses to deficiency of K, Mg or N at well-defined intensities of nutrient limitation. Nutrient limitation was associated with changes of biomass and nutrient allocation among various plant organs, whereby these changes were nutrient specific (e.g., biomass allocation to leaves was increased in Mg deficient plants, and decreased in N deficient plants), but not much dependent on the intensity of nutrient limitation. Effects of nutrient limitation on root and shoot morphological traits were also nutrient-specific and independent on the intensity of deficiency. Effects of nutrient limitation on fruit quality, e.g, sugar, lycopene and ascorbic acid content, were also nutrient-specific, and for specific parameter dependent on the intensity of deficiency. Responses to Mg deficiency were studied in more detail. In the first 6 days after start of Mg limitation, Mg concentrations in all plant organs drastically decreased without any effects on growth and leaf photosynthetic rates. Mg-deficiency increased leaf sugar concentrations, but sugar accumulation was not directly related to leaf photosynthesis which only decreased after leaf Mg concentrations were below 0.10 to 0.20 mg Mg g-1 leaf fresh mass. In Mg-deficient plants, sugars accumulated in source leaves even when the source/sink ratio was strongly decreased by shading of basal leaves. This is in accordance with the suggestion that sugar export is reduced due to inhibition of phloem loading.

In den meisten Ländern Mitteleuropas gilt weniger als ein Prozent des verbleibenden Laubwaldes als ungestört und temperierte Wälder sind Herausforderungen wie Arteninvasion, Klimawandel und steigender Stickstoff(N)-Deposition ausgesetzt. In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass hohe N-Einträge N-Limitierungen verringern, Phosphor(P)aufnahme behindern und P-Mängel in der Buche auslösen können. Die Artendiversität von Bäumen kann die Bestandsproduktivität durch die Prozesse Komplementarität und Facilitation (Wachstumserleichterung) erhöhen, wenn diese einen wachstumslimitierenden Nährstoff betreffen. Ein Schlüsselprozess im Nährstoffkreislauf ist der Weg von Nährstoffen durch die mikrobielle Biomasse während der Dekomposition. Es wurde gezeigt, dass die mikrobielle Biomasse um N bspw. mit Buchen und um P mit tropischen Moorpflanzen konkurriert. Die Buche ist eine sehr konkurrenzfähige Baumart in temperierten Waldökosystemen aber kann von der Eiche in trockenen Bereichen übertrumpft werden, während Hainbuche und Linde eine geringere Rolle spielen. Eichen erfahren jedoch in der jüngsten Vergangenheit in europäischen Wäldern einen Rückgang, der womöglich auf hohe N-Einträge zurückzuführen ist. Für diese Arbeit untersuchten wir die Nährstoff-, Konkurrenz- und strukturelle Dynamik eines unbewirtschafteten, sehr naturnahen Laubwaldes in Mitteldeutschland, der aus Buche (Fagus sylvatica), Eiche (Quercus petraea und Quercus robur), Hainbuche (Carpinus betulus) und Linde (Tilia cordata und Tilia platyphyllus) aufgebaut ist. Unsere Ziele waren (1) zu erforschen, ob Komplementarität und/oder Facilitation die Produktivität in diesem Waldökosystem erhöht, (2) festzustellen, ob es Konkurrenz um die Nährstoffe N, P und K zwischen Bäumen und mikrobieller Biomasse gibt und, (3) die Nachbarschaftsdynamik der genannten Baumarten zu untersuchen und herauszufinden, ob der Eichenrückgang mit hoher N-Deposition einhergeht. In Beständen einer Art sowie verschiedenen Mischbeständen aus je drei Arten ermittelten wir Biomasseproduktion und Nährstoffverfügbarkeit. Nährstoffnutzungseffizienzkurven (Nährstoffnutzungseffizienz = Biomasseproduktion pro verfügbare Nährstoffe) wurden genutzt um festzustellen, ob ein bestimmter Nährstoff das Baumwachstum limitiert. Die jährliche Netto-Nährstoffveränderung wurde in einer Laubbeutel-Studie als Differenz zwischen ursprünglichem und verbleibendem Nährstoffgehalt des sich zersetzenden Laubfalls nach einem Jahr kalkuliert. Die Nährstoffresorptionseffizienz berechneten wir über die Ermittlung der N-, P- und Kalium(K)-Konzentrationen in sonnenexponierten Blättern und im gefallenen Laub. Die Nachbarschaftsdynamik von Bäumen wurde über die Durchmesserverteilung, überirdische Holzbiomasse für jede Artenkombination sowie eine Polygon-Abschätzung von Wachstumsräumen erforscht. Zusätzlich wurde eine durchmesserbasierte nearest neighbor(nächster-Nachbar)-Analyse für Baumpaare durchgeführt. Ein Geographisches Informationssystem (GIS) wurde genutzt um Wachstumsraum-Polygone zu erstellen und nächste Nachbarn zu bestimmen. Auf Einzelbaum-Level, ermittelt durch einen Nachbarschaftsansatz, waren relative Wachstumsraten von Buchen im Einzelbestand geringer als in der Mischung mit Linde und Hainbuche während das Wachstum von Linde im Einzelbestand größer war als in Mischung mit Buche und Eiche. Die Nährstoffnutzungseffizienzkurve für Buche zeigte optimale P- und K-Nutzungseffizienz für die Art in Mischbeständen, während sie in Einzelbeständen  P- und K-limitiert war. Während die jährliche Netto-Nährstoffveränderung in sich zersetzendem Blattlaub die Verfügbarkeit von P und K im Boden beeinflusste, war dies für N nicht der Fall. Resorptionseffizienzen von N, P und K hingen negativ mit der jährlichen Netto-Nährstoffveränderung zusammen. In unserer Studie zur Nachbarschaftsdynamik von Bäumen fanden wir heraus, dass intraspezifische nearest neighbors gleiche Durchmesser aufwiesen und ihren Durchmesser gleichzeitig mit dem des Nachbarn vergrößerten. Im Gegensatz dazu waren die Durchmesser von interspezifischen nearest neighbors im Allgemeinen unterschiedlich und der Durchmesser des Nachbarn verringerte sich mit zunehmendem Durchmesser des Zielbaums. Eichen konnten ihren Wachstumsraum mit zunehmendem Durchmesser nicht vergrößern, aber dominierten ihre nearest neighbor über die Größe. Unsere Ergebnisse zeigten, dass im untersuchten Waldökosystem Nährstofflimitierungen artabhängig waren und dass die Nutzung von Nährstoffnutzungseffizienz und Nachbarschaftsansatz geeignete Mittel sind, den Einfluss einzelner Baumarten auf die Produktivität einer Art im Rein- und Mischbestand zu ermitteln – so wie die beobachtete Facilitation der Buche im Mischbestand. Diese Werkzeuge stellen eine wichtige Basis zur verbesserten Bewirtschaftung typischer temperierter Mischwälder dar. Wir schlussfolgerten weiterhin, dass Konkurrenz zwischen mikrobieller Biomasse und Bäumen für P und K hoch, aber für N weniger bedeutend war, was wahrscheinlich in hoher N-Deposition in diesem Waldökosystem begründet liegt, welche den internen N-Kreislauf entkoppelte. Die hohe N-Deposition trug wahrscheinlich auch zu geringer Verjüngung der Eiche bei, während ältere Eichen in unserem Untersuchungsgebiet im Wettbewerb um Licht erfolgreich waren. Die Bestandsstruktur war charakterisiert durch stärkere interspezifische verglichen mit intraspezifischer Konkurrenz. Daraus resultierend bildeten Reinbestände aus Buche, Eiche und Linde Klimaxbestände hoher Biomasse innerhalb eines sich verändernden, kleinskaligen Mosaiks verschiedener Artenzusammensetzungen. In Reaktion auf neue Bewirtschaftungsanforderungen des Globalen Wandels sind weiterführende Forschungen zu Nutzungseffizienz unterschiedlicher Ressourcen für Baumarten in verschiedenen Zusammensetzungen empfehlenswert.

Les activités anthropiques affectent les cycles biogéochimiques globaux, principalement par l'ajout de nutriments dans les écosystèmes. Il est donc crucial de déterminer dans quelle mesure les cycles biogéochimiques globaux peuvent être régulés. Les autotrophes peuvent réguler les réservoirs de nutriments par la consommation des ressources, mais la majorité des ressources leur sont inaccessibles à l'échelle globale. Par des modèles théoriques, nous avons cherché à évaluer la manière dont les autotrophes répondent à la fertilisation à l'échelle globale et leur capacité à réguler les concentrations des nutriments quand leur accessibilité est limitée. Nous avons également étudié les mécanismes qui déterminent la régulation des rapports de Redfield dans l'océan, ainsi que les effets de l'ajout de nutriments sur la production primaire océanique totale. Nous avons montré que les organismes ne régulent pas efficacement les réservoirs de nutriments. Le couplage des cycles biogéochimiques et la compétition entre groupes fonctionnels peuvent altérer, négativement ou positivement, la régulation des cycles biogéochimiques globaux par les organismes. Une régulation inefficace des concentrations de nutriments n'exclut par contre pas une forte régulation des rapports entre ces nutriments, comme dans le cas des rapports de Redfield. La fertilisation des écosystèmes terrestres et océaniques risque donc de fortement impacter la production primaire et les cycles biogéochimiques globaux, à de courtes comme à de grandes échelles de temps. / Anthropogenic activities heavily impact global biogeochemical cycles, mainly through nutrient fertilisation of ecosystems; thus it is crucial to assess the extent to which global biogeochemical cycles are regulated. Autotrophs can regulate nutrient pools locally through resource consumption, but most resources are inaccessible to them at global scales. We used theoretical models to assess how organisms respond nutrient fertilisation at global scales and how they can regulate the concentration of these nutrients when their accessibility of is limited. We further investigated the mechanisms driving the regulation of Redfield ratios in oceans, and the effects of nutrient fertilisation on total oceanic primary production. We showed that organisms cannot efficiently regulate nutrient pools. Mechanisms such as coupling of nutrient cycles and competition between functional groups can alter the strength of biotic regulation of global biogeochemical cycles, either positively or negatively. An inefficient regulation of inaccessible nutrient concentration, however, does not exclude a strong biotic regulation of nutrient ratios, as is the case with Redfield ratios in oceans. Nutrient fertilization of oceanic and terrestrial ecosystems is thus likely to have a strong impact on primary production and global nutrient cycles at both small and long timescales.