Ce travail de thèse décrit et analyse la réaction neuro-inflammatoire accompagnant la mort cellulaire neuronale dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Dans ce modèle, induit par l’injection intrastriatale d'un analogue toxique de la dopamine, la 6-hydroxydopamine (6-OHDA), nous décrivons les caractéristiques et la cinétique de l’activation microgliale, de l'infiltration lymphocytaire T, de la perte de neurones dopaminergiques TH+ (Tyrosine Hydroxylase) et des altérations du comportement moteur. Nos observations sont complétées par une étude neuropathologique de la substance noire chez des patients atteints de maladie de Parkinson. Les résultats montrent que, chez l'homme comme chez la souris, la mort de neurones dopaminergiques induit une infiltration T de faible intensité, limitée à la substance noire et s'accompagnant d'une activation microgliale. Dans un deuxième temps, nous analysons l'impact d'une déficience lymphocytaire T génétiquement déterminée sur les paramètres histologiques et fonctionnels caractérisant le modèle 6-OHDA. Nos résultats montrent que, comparées à des souris contrôles immunocompétentes, les souris immunodéficientes de souche Foxn1 KO, CD3 KO, NOD SCID ou RAG1 KO présentent toutes, à des degrés divers, une susceptibilité significativement accrue aux effets neurotoxiques de la 6-OHDA. L'aggravation observée de la perte neuronale s'accompagne d'une accentuation majeure des troubles du comportement moteur et de l'activation microgliale. Ce travail démontre l'importance de la neuro-inflammation et de l'immunité adaptative dans la physiopathologie du modèle 6-OHDA. Il suggère également que les LyT infiltrant la substance noire des patients atteints de maladie de Parkinson exercent un rôle inhibiteur sur l'activation microgliale et pourraient par ce mécanisme ralentir l'évolution de la perte neuronale dopaminergique. En résumé, ce travail de thèse apporte un ensemble de données originales sur les interactions entre LyT, microglie et neurones dopaminergiques dans le contexte de la maladie de Parkinson et du modèle murin 6-OHDA / This thesis work describes and analyzes the neuroinflammatory reaction that accompanies neuronal cell death in a murine model of Parkinson's disease. In this model, induced by the intrastriatal injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA), a toxic dopamine analog, we report on the main features and kinetics of microglial activation, T-cell infiltration, loss of TH+ (Tyrosine Hydroxylase) dopaminergic neurons and motor behavior alterations. We also assessed the presence of T-cells in the susbstantia nigra of Parkinson's disease patients and found that, as observed in the 6-OHDA murine model, the neuronal cell death of dopaminergic neurons triggers a low-grade T-cell infiltration that accompanies microglial activation. We then studied the impact of genetically-determined T-cell immunodeficiency on histological and functional outcomes in the 6-OHDA model. Our results show that, as compared to immunocompetent control mice, immunodeficient strains consisting in Foxn1 KO, CD3 KO, NOD SCID or RAG KO mice consistently presented, at varied levels, a highest susceptibility to 6-OHDA induced dopaminergic neurodegeneration. The observed accentuation of neuronal cell loss was accompanied by a marked increase of microglial activation and motor behavior alterations. Our work demonstrates the pathophysiological role of neuroinflammation and adaptative immunity in the 6-OHDA model. It also suggests that T-cells infiltrating the substantia nigra of Parkinson's disease patients dampen microglial activation and could, via this inhibitory effect, slow the progression of dopaminergic cell loss. Overall this thesis work provides original data on the interactions between T-cells, microglia and dopaminergic neurons in the context of Parkinson's disease and the murine 6-OHDA model

La maladie de Parkinson (PD) est considérée comme la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente. L'examen post-mortem de patients parkinsoniens et des modèles physiologiques d’études de la maladie de Parkinson suggèrent la participation de la mort cellulaire programmée, l'inflammation et l'autophagie dues au stress oxydatif, à des mutations ou l’agrégation de protéines au sein des neurones DA. Les aptamères peptidiques sont de petites protéines combinatoires, consistitués d’une plateforme (dans notre cas, la thiorédoxine humaine, hTRX) et une boucle variable insérée dans le domaine actif de hTRX. Deux aptamères peptidiques ont été identifiés par la sélection fonctionnelle. L’aptamère peptide 32 (Apta-32) ,est spécifique liant deux paralogues T32 impliqués dans le processus d'endocytose. L’aptamère peptidique 34(Apta-34) lie à une cible "T34", une protéine pro-apoptotique ayant un rôle dans la voie apoptotique provenant du noyau. Le travail de cette thèse visait à étudier la fonction anti-apoptotique de nos deux aptamères peptidiques dans deux modèles d’étude de la maladie de Parkinson: un modèle cellulaire (in vitro) et un modèle transgénique D. melanogaster (in vivo). Deux toxines majeures ont été appliquées dans ce travail, 6-hydroxindopamine (6-OHDA) et le paraquat, un pesticide couramment utilisé. Nos observations montrent que la drosophile exprimant Apta-32 dans tous les neurones ont montré une meilleure résistance après 48h de traitement avec le paraquat comparé à deux autre aptamères peptidiques, Apta-34 et Apta-TRX (sans boucle de contrôle variable). Une autre étude a révélé un défaut dans la phagocytose des corps apoptotiques au cours du développement embryonnaire de la drosophile exprimant Apta-32 dans les macrophages, ce qui suggère qu’Apta-32 pourrait participer à et peut-être interférer avec le processus de l’autophygie, et que Apta-32 pourrait protéger contre l'autophagie induite par paraquat dans les neurones. / Parkinson’s disease is considered as the second most common neurodegenerative disease. Although the cause of the progressive cell loss of PD remains unclear to date, programmed cell death, inflammation and autophagy due to oxidative stress, gene mutations or protein aggregations within DA neuron have been suggested as potential causes. Peptide aptamers are small combinatorial proteins, with a variable loop inserted into a scaffold protein, human thioredoxin, hTRX. They are used to facilitate dissection of signaling networks by modulating specific protein interactions and functions. Two peptide aptamers were identified by functional selection which inhibit Bax-dependent cell death in mammalian models. One peptide aptamer (Apta-32) is binding two paralogues involved in endocytotic trafficking T32. The second peptide aptamer (Apta-34) is binding to a target "T34", a pro-apoptotic protein mediating apoptosis emanating from the nucleus. The work of my PhD thesis aimed to investigate the anti-apoptotic function of our two peptide aptamers in different PD models including cell model (in vitro), brain tissue slice and D. melanogaster (in vivo) ; in particular their impact on neuron survival after exposure to specific toxins. Two major toxins were applied in this work, 6-hydroxindopamine (6-OHDA) and Paraquat, a commonly used pesticide. Our observations indicated that Drosophila expressing Apta-32 in all neurons showed more resistance 48h after treatment with Paraquat, compared to drosophila expressing Apta-34 or TRX. Another study revealed a defect in phagocytosis of apoptotic bodies in drosophila embryo’s expressing Apta-32 in macrophage, suggesting Apta-32 could be involved in, and perhaps interfere with, the process of autophagy. This suggests that Apta-32 could protect against paraquat induced autophagy in neurons.

Au-delà des symptômes moteurs, la maladie de Parkinson (MP) est également caractérisée par une myriade de symptômes neuropsychiatriques allant de l’apathie et la dépression aux troubles du contrôle des impulsions (TCI). Les TCI représentent un groupe d’addictions comportementales incluant le jeu pathologique, l’hypersexualité et les achats faits de manière compulsive. Observés chez 10 à 14 % des patients parkinsoniens sous traitement dopaminergique, ils affectent fortement leur qualité de vie. L’impulsivité cognitive reflétant notamment l’incapacité à tolérer les délais de renforcements, est au cœur des TCI. En effet, différentes études suggèrent que cette impulsivité serait exacerbée dans la MP et sous traitements dopaminergiques. Cependant, les mécanismes sous-tendant les TCI dans la MP demeurent méconnus, et la contribution respective de la lésion, du traitement dopaminergique, et de certains facteurs de vulnérabilité reste à déterminer. De plus, l’impulsivité d’attente, une autre forme de déficit d’inhibition qui peut conduire au développement de comportements compulsifs, a été peu étudiée dans le cadre des TCI.L’objectif de ce projet de thèse a été d’évaluer l’influence d’une dénervation dopaminergique de la voie nigrostriée, avec ou sans adjonction d’agoniste dopaminergique, sur le développement d’impulsivité. Pour cela, nous avons utilisé un modèle lésionnel des troubles non-moteurs de la MP. Ces rats ont reçu une injection bilatérale de neurotoxine 6-OHDA dans la SNc, afin d’induire une dénervation sélective, bilatérale et partielle du striatum dorsal. Ils ont ensuite été traités avec du pramipexole, un agoniste des récepteurs D2/3, connu pour favoriser le développement de TCI chez les patients parkinsoniens. Les tâches d’intolérance au délai et de réaction en série à 5 choix (5-CSRTT) ont été utilisées pour évaluer respectivement l’impulsivité cognitive et l’impulsivité d’attente. Dans le premier paradigme, les rats doivent appuyer sur un levier pour choisir entre une petite récompense immédiate, ou une plus grosse récompense, avec un un délai. Dans le second paradigme, ils doivent inhiber l’émission d’une réponse motrice jusqu’à l’apparition d’un stimulus lumineux. Le traitement chronique au pramipexole augmente considérablement les choix impulsifs effectués dans la tâche d’intolérance au délai, mais seulement chez les rats non lésés. En effet, la lésion dopaminergique seule ou avec le traitement ne favorise pas les comportements impulsifs. Dans la tâche de 5-CSRTT, le pramipexole semble également promouvoir l’émission de réponses prématurées (effet pro-impulsif), lorsque l’intervalle inter-essais est constant. Cependant, lorsque cet intervalle augmente, le pramipexole provoque à l’inverse une diminution des réponses prématurées (effet anti-impulsif). Cette modulation d’impulsivité étant seulement observée chez les rats hautement impulsifs, ceci suggère qu’un endophénotype impulsif puisse être un facteur de vulnérabilité à l’effet iatrogène du pramipexole.A l’échelle neuronale, ce traitement favorise la surexpression des ARNm codants pour les récepteurs dopaminergiques D2 dans le striatum et y modifie la connectivité glutamatergique telle qu’observée en microscopie électronique. De plus, nous avons observé une suractivation de la voie mTORC1 dans le noyau accumbens, comme déjà constaté dans les processus addictifs. Afin d’apporter un lien causal à cette étude, nous avons bloqué l’activité de la voie mTORC1 par un inhibiteur spécifique, la rapamycine, chez des rats traités au pramipexole. Etonnamment, cette combinaison accentue fortement l’intolérance au délai, alors que la rapamycine seule ne provoque aucun effet notable. Ceci pourrait s’expliquer par une cinétique d’activation et d’inhibition complexe de cette voie. L’ensemble de ces résultats suggère que l’impulsivité observée dans la MP serait causée par une action iatrogène du pramipexole via une activation anormale de la voie mTORC1 dans le noyau accumbens. / Beyond motor symptoms, Parkinson’s disease (PD) is also characterized by a plethora of neuropsychiatric deficits, ranging from apathy and depression to Impulse control disorders (ICDs). ICDs represent a complex group of behavioral addictions including gambling disorders, hypersexuality and compulsive shopping, displayed by 10 to 14% of PD patients under dopamine replacement therapies, whose quality of life is greatly diminished. Importantly, cognitive impulsivity reflecting in particular, an inability to tolerate delays to reinforcements, appears as a core symptom of ICDs. Indeed, recent evidence suggested that this kind of impulsivity would be exacerbated in PD and under treatment by dopaminergic D2/3 receptor agonists. However, the mechanisms underlying ICDs in PD remain unknown and the respective contribution of dopamine lesion and treatment, combined with factors of vulnerability, remain to be determined. Moreover, waiting impulsivity, another form of behavioral inhibition which may lead to compulsive behaviors, has been poorly investigated in the framework of ICDs.In this thesis project, using a lesional rodent model of non-motor symptoms of PD, we addressed the question of whether denervation of the dopaminergic nigrostriatal system would promote the development of impulsivity when combined with dopamine agonist treatments. Rats were bilaterally injected in the SNc with the neurotoxin 6-OHDA to induce selective and partial denervation of the dorsal striatum. We then treated them with the dopamine D2/3 receptor agonist, pramipexole, a medication known to favor the development of ICDs in PD patients. Two different tasks were used to measure cognitive and motor impulsivity: the delay discounting task (DDT) and the 5-choice serial reaction time task (5-CSRTT) respectively. In the former, rats have to press a lever and choose between a smaller, but immediate reward and a larger, but delayed reward. For the latter, they have to wait for a stimulus light to come on. In the DDT, chronic administration of pramipexole treatment only increased impulsive choices in non-lesioned rats. Indeed, the dopaminergic lesion by itself, or in adjunction with the treatment, did not increase impulsivity. In the 5-CSRTT, pramipexole progressively increased premature responses, reflecting a pro-impulsive effect when the inter-trial interval is constant. However, when the interval was increased, pramipexole reduced the premature responses, exhibiting an anti-impulsive effect. Interestingly, this modulation of motor impulsivity was only observed in rats with a high level of impulsivity, suggesting that an impulsive endophenotype might be an important factor of vulnerability to the iatrogenic effects of pramipexole.The effect of this treatment was then investigated at a cellular level. It promotes overexpression of the dopamine D2 receptor mRNA within the striatum, and seems to alter glutamatergic synaptic connectivity suggested by electron microscopy. Moreover, we showed that the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) pathway is lastingly over-activated in the nucleus accumbens, as already observed in drug addictions. In an attempt to make a causal link between this pathway and the behavioral changes, we treated rats with pramipexole and rapamycine, a specific inhibitor of this pathway. Surprisingly, this combination accentuated impulsivity even more, whereas rapamycine by itself did not promote impulsivity. This effect may be explained by the complexity of the kinetics of activation and inhibition of mTORC1 pathway.Taken together, these results suggest that impulsivity in PD may be triggered by an iatrogenic effect of the dopaminergic pramipexole treatment through an abnormal activation of the mTORC1 pathway within the nucleus accumbens.

De nombreuses études ont établi que la majorité des neurones libèrent plus qu’une substance chimique. Il est bien connu que les neurones peuvent co-exprimer et co-libérer des neuropeptides en plus de leur neurotransmetteur, mais des évidences de la co-libération de deux petits neurotransmetteurs à action rapide se sont accumulées récemment. Des enregistrements électrophysiologiques ont aussi montré que des neurones sérotoninergiques et dopaminergiques isolés peuvent libérer du glutamate quand ils sont placés en culture. De plus, la présence de glutamate et de glutaminase a été détectée dans des neurones sérotoninergiques, dopaminergiques et noradrénergiques par immunomarquage sur des tranches de cerveau. Malheureusement, en considérant le rôle métabolique du glutamate, sa détection immunologique n’est pas suffisante pour assurer le phénotype glutamatergique d’un neurone. Récemment, la découverte de trois transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUT1-3) a grandement facilité l’identification des neurones glutamatergiques. Ces transporteurs sont nécessaires pour la libération de glutamate et constituent les premiers marqueurs morphologiques du phénotype glutamatergique. Il a été démontré que des neurones noradrénergiques expriment VGLUT2 et que des neurones sérotoninergiques expriment VGLUT3. Mais aucune évidence d’expression d’un des sous-types de VGLUT n’a été reportée pour les neurones dopaminergiques. Le but de notre travail était d’identifier quel sous-type de VGLUT est exprimé par les neurones dopaminergiques mésencéphaliques, et de déterminer si le phénotype glutamatergique de ces neurones peut être modulé dans des conditions particulières. Premièrement, nous avons utilisé des microcultures pour isoler les neurones dopaminergiques et des doubles marquages immunocytochimiques pour observer l’expression de VGLUT dans les neurones positifs pour la tyrosine hydroxylase (TH). Nous avons montré que la majorité (80%) des neurones TH+ isolés exprime spécifiquement VGLUT2. Cette expression est précoce au cours du développement in vitro et limitée aux projections axonales des neurones dopaminergiques. Toutefois, cette forte expression in vitro contraste avec la non-détection de ce transporteur dans les rats adultes in vivo. Nous avons décidé ensuite de regarder si l’expression de VGLUT2 pouvait être régulée pendant le développement cérébral de jeunes rats et sous des conditions traumatiques, par double hybridation in situ. Entre 14 et 16 jours embryonnaires, les marquages de VGLUT2 et de TH montraient une superposition significative qui n’était pas retrouvée à des stades ultérieurs. Dans le mésencéphale de jeunes rats postnataux, nous avons détecté l’ARNm de VGLUT2 dans environs 1-2% des neurones exprimant l’ARNm de TH dans la substance noire et l’aire tegmentaire ventrale (ATV). Pour explorer la régulation de l’expression de VGLUT2 dans des conditions traumatiques, nous avons utilisé la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) pour léser les neurones dopaminergiques dans les jeunes rats. Dix jours après la chirurgie, nous avons trouvé que 27% des neurones dopaminergiques survivants dans l’ATV exprimaient l’ARNm de VGLUT2 dans les rats 6-OHDA. Finalement, nous avons observé la colocalisation de la protéine VGLUT2 dans les terminaisons TH positives par microscopie électronique. Dans les rats normaux, la protéine VGLUT2 est retrouvée dans 28% des terminaisons axonales TH dans le noyau accumbens. Dans les rats lésés à la 6-OHDA, nous avons observé une diminution considérable des terminaisons TH positives, et une augmentation dans la proportion (37%) des terminaisons dopaminergiques présentant du VGLUT2. Nos résultats suggèrent que le phénotype glutamatergique des neurones dopaminergiques est régulé au cours du développement, peut être réactivé dans des états pathologiques, et que ces neurones peuvent libérer du glutamate dans conditions spécifiques. / Numerous studies have established that the majority of neurons release more than one chemical substance. It is well known that neurons can co-express and co-release neuropeptides in addition to their neurotransmitter, but evidence of co-release of two small and fast-acting neurotransmitters has been accumulated recently. Electrophysiological recordings have also shown that isolated serotonine and dopamine neurons can release glutamate as a co-transmitter when they are placed in culture. Furthermore, the presence of glutamate and glutaminase has been detected in serotonine, dopamine and noradrenaline neurons by immunolabelling in brain slices. Unfortunately, considering the metabolic role of glutamate, its immunodetection is not sufficient to assert the glutamatergic phenotype of a neuron. Recently, the discovery of three vesicular glutamate transporters (VGLUT1-3) has greatly facilitated the identification of glutamate neurons. These transporters are necessary for the glutamate release by neurons and constitute the first molecular markers of a glutamatergic phenotype. Interestingly, it was demonstrated that some noradrenaline neurons express VGLUT2 and that some serotonin neurons express VGLUT3. But no evidence for expression of any VGLUT subtypes was initially reported for dopamine neurons. The goal of our work was to identify which VGLUT subtype is expressed by mesencephalic dopamine neurons, and to determine if the glutamatergic phenotype of these neurons can be modulated under specific conditions. First, we used microcultures to isolate dopamine neurons and double immunocytochemistry to visualize VGLUT expression in tyrosine hydroxylase (TH) positive neurons. We showed that the majority (80%) of isolated TH+ neurons express specifically VGLUT2. This expression occurred early during in vitro development and was limited to axonal projections of dopamine neurons. However, this strong expression in vitro contrasted with the lack of detection of this transporter in adult rats in vivo. We next decided to investigate if VGLUT2 expression could be regulated during brain development of young rats and under traumatic conditions, using double in situ hybridization. At embryonic days 14 to 16, VGLUT2 and TH labelling displayed significant overlap which was no longer found at later stages. In postnatal mesencephalon of young rats, we detected VGLUT2 mRNA in approximately 1-2% of neurons expressing TH mRNA in the substantia nigra and in ventral tegmental area (VTA). To explore the regulation of VGLUT2 expression under traumatic condition, we used 6-hydroxydopamine (6-OHDA) to damage dopamine neurons in young rats. Ten days post-surgery, we found that 27% of surviving dopamine neurons in the VTA expressed VGLUT2 mRNA in 6-OHDA animals. Finally, we observed the colocalisation of VGLUT2 protein in TH positive terminals by electron microscopy. In normal rats, VGLUT2 protein was found in 28% of TH positive axon terminals in nucleus accumbens. In 6 OHDA-lesioned rats, we observed a considerable reduction of TH positive terminals, and an increase in the proportion (37%) of dopamine terminals displaying VGLUT2. Our results suggest that the glutamatergic phenotype of dopamine neurons is developmentally regulated, can be reactivated under pathological states, and that these neurons are able to release glutamate under specific conditions.

A infusão de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) na via nigroestriatal em ratos é um modelo da Doença de Parkinson (DP). O Teste de Motricidade sobre Grade (TMG ou, em inglês, footfault test) é um teste comportamental utilizado para avaliar a função motora em ratos. Observamos que animais lesionados unilateralmente com 6-OHDA mostram atividade rotacional ipsilateral induzida pelo contexto quando colocados no aparato do TMG por 3 minutos e isso pode ser utilizado como índice para detectar animais lesionados. Nossos resultados mostraram que o TMG tem sensibilidade e especificidade de 100% para lesões maiores que 94 e 64%, respectivamente (Curva Operacional Característica: Área sob a curva = 0,988). Um modelo de regressão logística binária mostrou exp(B)= 1,116 (95% CI, 1,007-1,236) e C = -9,081 ± 4,554 (p = 0,046) utilizando a imunoistoquímica para tirosina-hidroxilase como técnica padrão (cada unidade representa 10% de lesão). Além disso, o TMG foi mais sensível que o teste de atividade rotacional induzida por apomorfina 1mg/kg quando os testes foram realizados em dias diferentes e foi menos sensível que o teste de atividade rotacional induzida por metilfenidato 40mg/kg (Teste do Sinal, p < 0,05). Portanto, o TMG pode ser bastante útil nesse modelo animal de DP para triagem de animais, uma vez que é um teste rápido, simples e não requer drogas para indução de atividade rotacional. / The administration of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the nigrostriatal pathway is a rat model of Parkinson’s Disease (PD). The footfault test is a behavioural task in which rodents have their motor functions assessed. Here, we observed that unilaterally 6-OHDA-lesioned animals show a context-induced ipsilateral rotational behaviour when placed on the footfault apparatus for 3 minutes and this may be used as index to detect lesioned animals. Our results showed a sensitivity and specificity of 100% for lesions higher than 94 and 64%, respectively (ROC curve: AUC = 0.988). A binary logistic regression model showed an exp(B)= 1.116 (95% CI, 1.007-1.236) and C = -9.081 ± 4.554 (p = 0.046) using the nigral tirosine hidroxylase immunocontent as standard (each unit represents a 10%-lesion extension). Additionally, the footfault test was more sensitive than apomorphine challenging at 1 mg/kg when these tests were carried out days apart and it was less sensitive than methylphenidate at 40 mg/kg (Sign Test, p < 0.05). Therefore, the footfault test may be very useful in the PD animal model for screening animals since it is fast and simple and it does not require a drug to induce rotational activity.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-06-27T11:25:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_SintomasNaoMotores.pdf: 1790988 bytes, checksum: 7cf0cdaefcf7792e67b618293e978463 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-07-31T13:20:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_SintomasNaoMotores.pdf: 1790988 bytes, checksum: 7cf0cdaefcf7792e67b618293e978463 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-31T13:20:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_SintomasNaoMotores.pdf: 1790988 bytes, checksum: 7cf0cdaefcf7792e67b618293e978463 (MD5) Previous issue date: 2014 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum em idosos, caracterizada pela neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos da substância negra (SN), com etiologia não claramente estabelecida, entretanto as causas podem estar associadas a exposição de toxinas ambientais e fatores genéticos. Os processos patológicos envolvidos na DP são disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, inflamação e excitotoxicidade. A sintomatologia da DP são alterações motoras, cognitivas e autonômicas. Contudo, poucos estudos analisam os sintomas não-motores da DP, principalmente em modelos animais. Nesse contexto o objetivo deste trabalho foi avaliar sintomas não-motores da DP em modelo animal com lesão provocada pela neurotoxina 6-hidroxidopamina com duas doses diferentes, injetadas bilateralmente no estriado. Para alcançar nossos objetivos realizamos os testes de campo aberto, apomorfina, labirinto aquático de Morris e testes de discriminação olfativa, além de análises histológicas. Nossos resultados mostraram alterações motoras, déficits de memória e aprendizado, associadas a diminuição de células dopaminérgicas na SN, neurônios estriatais e neurônios da região hipocampal CA1. Dessa forma, esse modelo para os sintomas não-motores da DP pode ser utilizado para a compreensão dos mecanismos que envolvem a doença, assim como para avaliar medidas terapêuticas que possam retardar ou interromper a progressão da DP. / Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease in the elderly, characterized by neurodegeneration of dopaminergic neurons of the substantia nigra (SN), with no clearly established etiology, though the causes may be associated with exposure to environmental toxins and genetic factors. The pathological processes involved in PD are mitochondrial dysfunction, oxidative stress, inflammation and excitotoxicity. The symptoms of PD are motor, cognitive and autonomic changes. However, few studies have analyzed the non-motor symptoms of PD, especially in animal models. In this context, the objective of this study was to assess non-motor symptoms of PD in animal models with lesions caused by the neurotoxin 6-hydroxydopamine with two different doses, injected bilaterally into the striatum. To achieve our goals we performed tests of open field, apomorphine, Morris water maze and olfactory discrimination tests, and histological analyzes. Our results showed motor abnormalities, learning and memory deficits associated with decreased dopaminergic cells in the SN, striatal neurons and neurons of the hippocampal CA1. Thus, this model for non-motor symptoms of PD can be used to understand the mechanisms involved in the disease, as well as to evaluate therapeutic strategies to slow or stop progression of PD.

Le traitement substitutif par la L-DOPA, indiqué dans la maladie de Parkinson, induit à terme des complications motrices appelées les dyskinésies induites par la L-DOPA. L'apparition des dyskinésies est due, au moins en partie, à la mise en place d'une plasticité aberrante dans le striatum, qui fait suite à des modifications transcriptionnelles induites par la L-DOPA. Une analyse du transcriptome nous a permis d'identifier le gène Nptx2, codant pour la neuropentraxine Narp, comme étant un candidat potentiellement impliqué dans l'apparition des dyskinésies. L'objectif de ce travail était d'étudier la régulation et le rôle de Narp dans l'apparition des dyskinésies, dans un modèle de souris lésée à la 6-hydroxydopamine. Nous avons montré que les dyskinésies induites par la L-DOPA sont diminuées chez des souris invalidées pour Nptx2 (Narp-KO). Par ailleurs, l'injection dans le striatum dorsal d'un adénovirus exprimant une forme dominante négative de Narp, induit une réduction importante des scores de dyskinésies. Dans le striatum, Narp est exprimé par les neurones épineux de taille moyenne et par les interneurones à parvalbumine. Après une stimulation dopaminergique, l'augmentation de l'expression de Nptx2 s'accompagne d'un enrichissement de Narp au niveau synaptique. Nos travaux montrent donc que Narp joue un rôle important dans le développement des dyskinésies et suggèrent qu'il pourrait être impliqué dans la plasticité synaptique des neurones du striatum, comme cela a été montré dans l'hippocampe. Ces résultats permettent d'ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour retarder l'apparition de ces complications motrices chez les patients parkinsoniens. / Dopaminergic replacement therapy in Parkinson’s disease is hampered by the occurrence of L-DOPA-induced dyskinesia (LID). One major hypothesis is that LID result from L-DOPA-induced aberrant plasticity in the striatum due to modifications of the transcriptional program. Using a microarray-based approach, we identified Narp as a putative candidate implicated in LID induction. Thus, we investigated Narp involvement in LID by examining abnormal involuntary movements (AIM) development in Narp genetically-ablated mice or upon intrastriatal injection of a dominant negative form of Narp. Interestingly, the total AIM score was greatly reduced in these two models of impaired Narp expression. Hence, my results highlight Narp as an important actor in LID development. Then, I further examined Narp regulatory mechanisms in the striatum and I demonstrated that dopamine stimulation leads to increased Narp expression both at the transcriptional level and at the protein level through its accumulation within the synaptic compartment. These findings advance knowledge about mechanisms underlying dyskinesia with the hope of delaying their appearance in patients.

To test whether SKF 38393 could ontogenetically sensitize dopamine (DA) D$\sb1$ receptors and whether this sensitization would be associated with biochemical changes, intact and neonatal 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rats (200 $\mu$g i.c.v.) were treated daily from birth with SKF 38393 (3.0 mg/kg i.p. x 28 days) or its vehicle. In DA D$\sb1$ neonatally sensitized 6-OHDA rats, enhanced locomotor responses were observed with the first SKF 38393 challenge dose (3.0 mg/kg i.p.) at 6 weeks. This response increased further with weekly SKF 38393 treatments. Enhanced stereotyped behaviors were seen in both lesioned and sensitized rats at 8 weeks. There was no change in the percentage of high affinity D$\sb1$ sites in these groups of rats. Striatal mRNA levels for D$\sb1$ receptors were reduced in the lesioned rats, but restored to control level after treatments with SKF 38393 in adulthood. Basal, DA-, NaF- and forskolin-stimulated adenylate cyclase activities were similar among treatment groups. Striatal DA content was reduced ($>$99%), whereas serotonin (5-HT) content was elevated ($>$50%) in the 6-OHDA groups. To study possible interaction between DA and 5-HT systems, the effects of a series of 5-HT agents on the induction of oral activity were determined. The 5-HT$\sb{\rm 1C}$ receptor agonist, m-chlorophenylpiperazine (m-CPP), produced a marked increase in oral activity in 6-OHDA-lesioned rats. The respective 5-HT$\sb{\rm 1A}$ and 5-HT$\sb{\rm 1B}$ agonists, 8-OH-DPAT and CGS-12066B did not increase oral activity. The m-CPP-induced oral response in the lesioned rats was attenuated by mianserin, a 5-HT$\sb{\rm 1C}$ antagonist, but not by ketanserin or MDL-72222, 5-HT$\sb2$ and 5-HT$\sb3$ antagonists, respectively. Although the supersensitized oral response of lesioned rats to m-CPP was not attenuated by SCH 23390, the enhanced response of SKF 38393 was attenuated by mianserin. Additionally, mRNA levels for 5-HT$\sb{\rm 1C}$ receptor were not altered in both intact and lesioned rats. These findings demonstrate that ontogenetic treatments of neonatal 6-OHDA-lesioned rats with a D$\sb1$ agonist produce partial sensitization of DA D$\sb1$ receptors in adulthood without altered biochemical markers, and that this neonatal lesion is associated with both supersensitized DA D$\sb1$ and 5-HT$\sb{\rm 1C}$ receptors. Moreover, induction of oral activity by DA agonists is mediated via a serotonergic system.

Ce travail a eu comme objectif de mettre en place des techniques de spectroscopie RMN du proton optimisées pour la détection du glutamate cérébral afin d'étudier des changements éventuels du métabolisme glutamatergique dans la maladie de Parkinson. En vue d'une application chez le patient, une approche de filtrage à double quanta et une méthode liée à la spectroscopie bi-dimensionnelle ont été évaluées à 3 Tesla sur un imageur corps entier. Une étude incluant dix patients atteints par la maladie de Parkinson idiopathique et dix volontaires sains a ensuite été réalisée, utilisant une méthode liée à la spectroscopie bi-dimensionelle et ciblant le noyau lenticulaire (putamen et globus pallidum). Aucun changement significatif du glutamate total (intra- et extracellulaire) n'a pu être mis en évidence comparant le patient sous traitement par levodopa (L-DOPA) ou ayant temporairement interrompu son traitement et le volontaire sain. Une tendance à la diminution de la creatine/phosphocreatine a été observée chez le patient. En vue d'une étude complémentaire sur le modèle animal, la méthode mise en œuvre chez le patient a été évaluée chez le rat à 7 Tesla. Une étude sur le rat traité par 6-hydroxydopamine (6-OHDA) a ensuite été réalisée, utilisant une séquence PRESS standard à un temps d'écho de 136 ms et ciblant le striatum. Sur le même animal, des spectres avant traitement à la 6-OHDA, après traitement et suivant une injection de levodopa ont été acquis. Aucun changement de glutamate n'a pu être mis en évidence, alors qu'une tendance à la réduction de la choline suivant le traitement à la 6-OHDA était observée. Nos résultats indiquent que les changements du métabolisme glutamatergique, ayant lieu dans le cadre de la maladie de Parkinson qui ont été mis en évidence dans le modèle 6-OHDA par d'autres méthodes, ne sont pas reflétés par des changements des concentrations du glutamate total mesuré par RMN in vivo.

In zebrafish, the ventilatory response to hypoxia first develops at 3 days post-fertilization (d.p.f.) before O2-chemoreceptive neuroepithelial cells (NECs) of the gill appear at 7 d.p.f. This indicates the presence of extrabranchial chemoreceptors in embryos and a developmental transition to primarily gill O2 sensing. This thesis examined the skin NECs, which reach peak density in embryos but decline as gill NECs appear. Exposure of embryos and larvae to chronic hypoxia prevented the loss of skin NECs, shifted peak basal ventilation to a later developmental stage, and induced a hypoventilatory response to acute hypoxia. Chronic exposure to hyperoxia rapidly diminished skin NECs, shifted peak ventilation to earlier stages and eliminated the response to acute hypoxia. Administration of the neurotoxin 6-hydroxydopamine degraded nerve terminals that contact skin NECs and reduced both basal ventilation frequency and the hypoxic ventilatory response. Thus, skin NECs are candidates for extrabranchial O2 chemoreceptors in developing zebrafish.