Este trabalho está dividido em duas partes: (i) estudo da adsorção da enzima horseradish peroxidase (HRP) sobre substratos planos (lâminas de Si/SiO2, filmes ASP/Si/SiO2, filmes CABads/Si/SiO2, filmes CABspin/Si/SiO2 e filmes CMCABspin/Si/SiO2) seguida de testes da atividade enzimática da HRP imobilizada sobre estes substratos e (ii) obtenção de oligômeros divinílicos mediada pela HRP. Na primeira parte, a imobilização da HRP sobre substratos planos foi estudada através de elipsometria, microscopia de força atômica (AFM) e medidas de ângulo de contato. As isotermas de adsorção da HRP sobre Si/SiO2, APS/Si/SiO2 e CABads/Si/SiO2 apresentaram um aumento contínuo da quantidade de material adsorvido ΓHRP em função da concentração da solução de enzima até atingir um patamar de adsorção no qual verificou-se a formação de uma monocamada de HRP adsorvida. Nestes casos, o processo de adsorção da HRP pode ser descrito pelo modelo de adsorção aleatória (RSA). Para filmes HRP/CABspin/Si/SiO2 e HRP/CMCABspin/Si/SiO2 observou-se adsorção cooperativa de moléculas de HRP e formação de multicamadas. A adsorção da HRP sobre Si/SiO2, filmes APS, CABads e CMCABspin é um processo irreversível. Ao contrário, HRP adsorve reversivelmente sobre filmes CABspin, fato evidenciado pelo decréscimo de ~30% na espessura dos filmes de enzima. A atividade catalítica dos filmes de HRP imobilizados sobre substratos planos foi verificada na reação de oxidação do ABTS. Os testes de atividade catalítica mostraram que os substratos com a HRP adsorvida podem ser reutilizados 3 vezes sem dessorção ou perda da atividade catalítica da enzima, com exceção dos filmes HRP/CABspin/Si/SiO2 que se tornam inativos após a primeira catálise. A condição de máxima atividade catalítica de HRP imobilizada foi correlacionada com grau de cobertura de ~55%. O emprego do monômero etileno glicol dimetacrilato (EGDMA) em reações de polimerização catalisadas por filmes HRP/Si/SiO2 ou pela HRP livre em solução à temperatura ambiente revelou a formação de partículas cristalinas com geometria poligonal. Com objetivo de compreender a formação das estruturas cristalinas, a segunda parte do trabalho focou a formação de oligômeros de EGDMA e trietileno glicol dimetacrilato (TEGDMA) em meio aquoso catalisada pela HRP na presença H2O2 a temperatura ambiente. Os oligômeros de EGDMA e/ou TEGDMA foram caracterizados por gravimetria, cromatografia de permeação em gel, espectroscopia vibracional na região do infravermelho e espectroscopia 1H RMN. A auto-associação dos oligômeros originou partículas cristalinas com ângulos retos, como evidenciado pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura. As medidas de calorimetria exploratória diferencial e difração de raio-x confIrmaram a cristalinidade das amostras. Os oligômeros de EGDMA, TEGDMA e EGDMA-co-TEGDMA sintetizados na presença do sistema HRP-H2O2 apresentaram grupos vinila pendentes, boa solubilidade em clorofórmio e ponto de fusão bem definido, evidenciando pouca reticulação ou ciclização e mostrando que as propriedades catalíticas da HRP propiciam um ambiente reacional apropriado para produzir materiais poliméricos com novas características. / This work is divided into two parts: (i) study on the adsorption of the enzyme horseradish peroxidase (HRP) onto flat substrates (silicon wafers, ASP/Si/SiO2 films, CABads/Si/SiO2 films, CABspin/Si/SiO2 films, and CMCABspin/Si/SiO2 films) followed by enzymatic catalytic tests of HRP immobilized onto these substrates, and (ii) formation of divinyl-based oligomers mediated by HRP. In the first part, the HRP immobilization onto flat substrates was investigated by means of ellipsometry, atomic force microscopy (AFM), and contact angle measurements. Adsorption isotherms of HRP onto silicon wafers, APS/Si/SiO2, and CABads/Si/SiO2 presented the continuous increase of HRP adsorbed amount ΓHRP as a function of enzyme solution concentration until an adsorption plateau, which evidenced monolayer formation. In these cases, the HRP adsorption process can be described by the random sequential adsorption model (RSA). For HRP/CABspin/Si/SiO2 and HRP/CMCABspin/Si/SiO2 cooperative adsorption of HRP molecules and multilayer formation were evidenced. The HRP adsorption onto silicon wafers, APS, CABads, and CMCABspin films is an irreversible process. Contrarily, HRP adsorbed reversibly onto CABspin films, since desorption of ~30% could be detected. The catalytic activity of HRP films immobilized onto flat substrates was verified by oxidation reaction of ABTS. Catalytic tests showed that substrates with adsorbed HRP can be reused three times without desorption or catalytic activity lost, except for HRP/CABspin/Si/SiO2 films, which became inactive after first use. The emulsion polymerization of ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) in mediated by HRP/Si/SiO2 films or by free HRP at room temperature revealed the formation of crystalline particles with polygonal geometry. In order to understand the formation of such crystalline structures, the second part of this thesis focused on EGDMA and/or triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA) oligomers formation in aqueous medium catalyzed by HRP in the presence of H2O2 at room temperature. EGDMA and/or TEGDMA oligomers were characterized by means of gravimetry, gel permeation chromatography, infrared vibrational spectroscopy and 1H NMR spectroscopy. Self-assembling of oligomers led to right-angled crystalline particles, as evidenced by scanning electron microscopy images. Differential scanning calorimetry and X-ray diffractometry measurements ratified the samples crystallinity. EGDMA, TEGDMA and EGDMA-co-TEGDMA oligomers synthesized in the presence of HRP-H2O2 system presented pendant vinyl groups along the chains, good solubility in chloroform, and well defined melting point. These features evidenced few crosslinking or cyclization and revealed that the catalytic properties of HRP provide an appropriate environrnent for production of materials with new characteristics.

A biomassa vegetal pode ser uma importante fonte de obtenção de diversos produtos a partir da desestruturação de suas frações por um vasto grupo de enzimas. No entanto, a geração de compostos de alto valor agregado a partir da biomassa lignocelulósica requer o desenvolvimento de novos sistemas enzimáticos. Pensando nisso, a prospecção e a caracterização de novas enzimas que estão presentes no secretoma de fungos degradadores da biomassa lignocelulósica tem sido fonte de pesquisa por pesquisadores do mundo todo. O objetivo deste trabalho foi prospectar, clonar e expressar de maneira heteróloga o gene codificante de uma enzima putativa do fungo termofílico T. terrestris em cepas do fungo filamentoso A. nidulans A773 e promover sua caracterização bioquímica e biofísica. O gene da enzima foi amplificado, clonado e inserido no vetor pEXPYR antes de ser inserido no sistema de expressão do A. nidulans. Os transformantes obtidos foram induzidos em meio mínimo de cultivo contendo 3% (m/v) de maltose e 1% (m/v) de glicose em meio estacionário para a produção, seguido da purificação da enzima. Estudos bioquímicos foram realizados para determinar o pH e a temperatura ótima de reação, bem como, a especificidade aos substratos e a determinação dos parâmetros cinéticos. A termoestabilidade da enzima também foi avaliada por estudo de dicroísmo circular (DC). Além disso, foi avaliado o efeito colaborativo entre uma xilanase GH10 e a enzima em estudo na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. A enzima obtida por expressão heteróloga foi caracterizada como uma xilo-oligossacarídeo oxidase (XylO). Por meio da análise filogenética das sequências de aminoácidos entre a enzima expressa e outras enzimas oxidativas, a XylO foi classificada como pertencente a família das flavoproteínas e subfamília das BBE. A enzima TtXylO demonstrou ter especificidade em oligossacarídeos de C5 apresentando boa atividade enzimática em substratos complexos de xilana. A enzima possui pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 25 ºC. As análises de DC indicaram temperatura de desnaturação de 62,7 ºC, caracterizando esta enzima como termofílica. Contudo, novos estudos ainda são necessários para avaliar os produtos gerados a partir da oxidação dos diferentes xilo-oligossacarídeos pela XylO e seu potencial uso na indústria. / Plant biomass is an important source for generation of several products obtained from enzymatic cleavage of its fractions by a large group of enzymes. However, the generation of high value compounds from lignocellulosic biomass requires the development of new enzymatic systems. Considering that, prospection and characterization of enzymes present in the biomass-degrading fungi secretome has been a source of study by researchers around the world. The aim of this work was to prospect, clone and heterologously express a putative enzyme encoding gene from the thermophilic fungus T. terrestris in A. nidulans A773 strains and to promote its biochemical and biophysical characterization. The gene was amplified, cloned and inserted into the pEXPYR vector before being inserted into A. nidulans expression system. The transformants were induced by culture in minimal médium containing 3% (w/v) maltose and 1% (w/v) glucose by stationary culture for the production, followed by enzyme purification. Biochemical analyses were performed to determine optimum pH and temperature as well as the substrate specificities and kinetic parameters. The enzyme thermostability was also evaluated by circular dichroism (CD). In addition, the collaborative effect between the enzyme and a GH10 on hydrolys of pre-treated sugarcane bagasse was evaluated. The enzyme obtained by heterologous expression was characterized as a xylooligosaccharide oxidase (XylO). Phylogenetic analysis between amino acid sequences of expressed enzyme and other oxidative enzymes classified XylO as belonging to flavoproteins family and subfamily of BBE. TtXylO has been shown to have specificity on C5 oligosaccharides exhibiting good enzymatic activity on complex xylan substrates. The enzyme has an optimum pH of 5.5 and optimum temperature of 25 ºC. DC analyses showed melting temperature of 62.7 ºC, characterizing this enzyme as thermophilic. In general, further studies are still needed to evaluate the products generated from oxidation of xylooligosaccharides by XylO and their potential use in the industry.

Neste trabalho estudamos a dinâmica molecular e o empacotamento em semicondutores orgânicos com diferentes tamanhos de cadeias conjugada usando uma estratégia de multi-técnicas, em particular Ressonância Magnética Nuclear (RMN), espalhamento de Raios-X de alto ângulo (WAXS), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), espectroscopia Raman e espectroscopias Ópticas de absorção UV-Vis e fluorescência. Nestes estudos utilizamos oligômeros de fluorenos, com 3, 5 e 7 unidades repetitivas e copolímeros multibloco conjugados/não-conjugados com as unidades conjugadas constituídas por unidades de fenileno de vinileno (PV) e as não-conjugadas formadas por unidades metilênicas. No estudo com oligômeros, foi mostrado que a capacidade e a forma de ordenamento das cadeias dependem do número de unidades repetitivas, com o Pentâmero possuindo uma tendência muito maior de cristalização. Essa conclusão foi suportada por cálculos teóricos ab-initio, que mostraram que a conformação de menor energia do pentâmero favorece as interações intercadeias e, portanto, o ordenamento de longo alcance. Os resultados referentes aos estudos de dinâmica molecular corroboraram essas características e mostraram que a ativação dos movimentos moleculares nas fases amorfas dos oligômeros são predominantemente dependentes dos comprimentos das cadeias oligoméricas, em concordância com o comportamento encontrado para as suas Tg´s. No estudo referente aos copolímeros multiblocos, foi encontrado que a presença dos grupos espaçadores alifáticos inibem a forte tendência de cristalização das unidades de PV, porém não impedem a agregação dessas unidades. Foi verificado que, a dispersão de tamanhos das unidades agregadas afeta fortemente as características de emissão dos copolímeros, onde a emissão nas cadeias maiores é privilegiada. No que diz respeito a dinâmica molecular, foi observado que a presença de movimentos na região alifática contribui para o aparecimento de processos de relaxação não radiativos o qual inibem a emissão dos copolímeros e provocam alargamento das bandas vibrônicas. Por fim, foi observado que movimentos isotrópicos das cadeias de PV são responsáveis pela transição vítrea dos copolímeros, sendo que as energias necessárias para ativar esses movimentos aumentam com o tamanho da cadeia. Portanto, de forma geral, nossos resultados indicam que mesmo em sistemas com comprimento de cadeias muito bem controlados, as fortes interações intermoleculares presentes em polímeros conjugados, podem tornar a morfologia em estado sólido desses sistemas bastante complexa, sendo que muitas das propriedades ópticas (e provavelmente também elétricas) são afetadas pela forma de empacotamento, desordem conformacional e térmica, além da própria constituição das cadeias. / In this dissertation we present a study of the molecular dynamics and packing in organics semiconductor with different conjugated chains lengths using a of multi-techniques approach, in particular, Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Wide Angle X-ray Scattering (WAXS), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Raman spectroscopy, UV-Vis absorption and fluorescence spectroscopy. The studies were carried-in fluorene oligomers with 3, 5 and 7 repeat units and multi-block conjugated/non-conjugated copolymers with the conjugated part formed by phenylene-vinylene units (PV) and the non-conjugated block formed by methylene units. Concerning the oligomers studies, it was shown that the ability of the chain to form ordered domains as well as the domain structure depend on the number of repeat units, with the pentamer having a higher tendency to crystallization. This conclusion was supported by theoretical ab-initio calculations, which showed that the pentamer conformation favors inter-chain interactions and therefore long-range ordering. The molecular dynamics studies support these characteristics and showed that the activation of molecular motions in oligomers amorphous phase are predominantly dependent on the oligomeric chain lengths, in agreement with the behavior observed for their glass transitions (Tg´s). In the study concerning the multi-block copolymers, it was found that presence of the aliphatic chains inhibit the strong tendency to crystallization of the PV units, but do not prevent their aggregation. It was found that the dispersion in aggregated units sizes strongly affects the copolymers emission, with the emission of larger chains being privileged. Regarding the molecular dynamics, we observed that the presence of motion on aliphatic region contributes to the appearance of non-radiative relaxation processes that inhibit the emission of the copolymers and produce broadening of the vibronic bands. Finally, we observed that isotropic motions of the PV chains are responsible for the copolymers glass transition and the energy required to activate these movements increase with length of the chain. In summary, our results indicate that even in systems with well controlled chains length, the strong intermolecular interactions present in conjugated polymers, can make the solid state morphology of these systems quite complex, which may affect many optical (and probably electric) properties are affected by the packaging structure, thermal and conformational disorder, in addition to the constitution of the chains composition.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-04-26T13:48:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_cassyo_de_araujo_rufino.pdf: 1782663 bytes, checksum: 48211778344c5f757ff01c4c9282d9b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-05-02T18:29:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_cassyo_de_araujo_rufino.pdf: 1782663 bytes, checksum: 48211778344c5f757ff01c4c9282d9b8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-05-02T18:31:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_cassyo_de_araujo_rufino.pdf: 1782663 bytes, checksum: 48211778344c5f757ff01c4c9282d9b8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T18:31:51Z (GMT). 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Os compostos utilizados são naturais, têm propriedades antiadesivas e atividade antimicrobiana contra microrganismos, possuem propriedades biocompatíveis e não fitotóxicas aos vegetais em geral. O processo de sínteses dos compostos contendo própolis, quitina e nanoprata, foi realizado por meio da aplicação de sonicação para a dispersão e mistura entre as substâncias. Foram testados os produtos no desenvolvimento e crescimento do fungo Bipolaris oryzae em placas de petri e em sementes de arroz infectadas. Os tratamentos foram: quitina, própolis, prata, quitina+própolis, quitina+própolis+nanoprata, quitina+prata, própolis+nanoprata e testemunha (T - sementes sem tratamentos), totalizando neste estudo 10 tratamentos. Logo a eficiência dos produtos e suas soluções foram testados por meio do blotter test (teste de sanidade de sementes), porcentagem de inibição e diâmetro de crescimento do fungo, germinação e comprimento de plântulas das sementes tratadas com os produtos. Os resultados demonstram que os oligômeros de quitosana e os compósitos de quitosana com extrato de própolis e nanopartículas de prata controlam o crescimento do patógeno. A importância deste achado reside no fato de que é um passo em direção ao objetivo de diminuir o uso de fungicidas químicos. A partir de testes de germinação poderá concluir-se que os melhores resultados foi o tratamento com quitosano/prata compósito NPs, com uma taxa de germinação de 91%. Os novos materiais poliméricos são considerados como muito promissores para o controle de Bipolaris oryzae no arroz, tornando-se assim alternativas ecológicas aos fungicidas químicos. / The use of natural products in conjunction with silver nanoparticles has attracted interest of many researches, from both scientific and technological point of view due to their action for disease and pests control. The objective was to test natural products (with or without nanosilver) with antimicrobial action against Bipolaris oryzae, in vitro, and in the treatment of rice seeds. To study the compounds containing chitin and propolis optionally added nanosilver rice seeds were used in IRGA inoculated with an isolated 424 Bipolaris oryzae. The compounds used are natural, have anti-adhesive properties and antimicrobial activity against microorganisms, have biocompatible properties and not phytotoxic to plants in general. The process of synthesis of compounds containing propolis, chitin and nanosilver was performed by applying the sonication for the dispersion and mixing of the substances. Products were tested on the development and growth of Bipolaris oryzae fungus in petri dishes and infected rice seeds. The treatments were: chitin, propolis, silver, chitin + propolis, chitin + Propolis + nanosilver, chitin + silver, propolis + nanosilver and control (T - treatments seeded), totaling 10 treatments in this study. The results were conclusive in showing that chitosan oligomers and the composites of chitosan with propolis extract and silver nanoparticles led to a remarkable reduction in growth of the pathogen. The importance of this finding lies in the fact that it is a step towards the goal of decreasing the use of chemical fungicides in plant pathology. From germination tests it could be concluded that the best results was the treatment with chitosan/silver NPs composite, with a germination rate of 91%. The novel polymeric materials can thus be deemed as very promising for the control of the Bipolaris oryzae of rice and pave the way towards eco-friendly alternatives to chemical fungicides.

A biomassa vegetal pode ser uma importante fonte de obtenção de diversos produtos a partir da desestruturação de suas frações por um vasto grupo de enzimas. No entanto, a geração de compostos de alto valor agregado a partir da biomassa lignocelulósica requer o desenvolvimento de novos sistemas enzimáticos. Pensando nisso, a prospecção e a caracterização de novas enzimas que estão presentes no secretoma de fungos degradadores da biomassa lignocelulósica tem sido fonte de pesquisa por pesquisadores do mundo todo. O objetivo deste trabalho foi prospectar, clonar e expressar de maneira heteróloga o gene codificante de uma enzima putativa do fungo termofílico T. terrestris em cepas do fungo filamentoso A. nidulans A773 e promover sua caracterização bioquímica e biofísica. O gene da enzima foi amplificado, clonado e inserido no vetor pEXPYR antes de ser inserido no sistema de expressão do A. nidulans. Os transformantes obtidos foram induzidos em meio mínimo de cultivo contendo 3% (m/v) de maltose e 1% (m/v) de glicose em meio estacionário para a produção, seguido da purificação da enzima. Estudos bioquímicos foram realizados para determinar o pH e a temperatura ótima de reação, bem como, a especificidade aos substratos e a determinação dos parâmetros cinéticos. A termoestabilidade da enzima também foi avaliada por estudo de dicroísmo circular (DC). Além disso, foi avaliado o efeito colaborativo entre uma xilanase GH10 e a enzima em estudo na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. A enzima obtida por expressão heteróloga foi caracterizada como uma xilo-oligossacarídeo oxidase (XylO). Por meio da análise filogenética das sequências de aminoácidos entre a enzima expressa e outras enzimas oxidativas, a XylO foi classificada como pertencente a família das flavoproteínas e subfamília das BBE. A enzima TtXylO demonstrou ter especificidade em oligossacarídeos de C5 apresentando boa atividade enzimática em substratos complexos de xilana. A enzima possui pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 25 ºC. As análises de DC indicaram temperatura de desnaturação de 62,7 ºC, caracterizando esta enzima como termofílica. Contudo, novos estudos ainda são necessários para avaliar os produtos gerados a partir da oxidação dos diferentes xilo-oligossacarídeos pela XylO e seu potencial uso na indústria. / Plant biomass is an important source for generation of several products obtained from enzymatic cleavage of its fractions by a large group of enzymes. However, the generation of high value compounds from lignocellulosic biomass requires the development of new enzymatic systems. Considering that, prospection and characterization of enzymes present in the biomass-degrading fungi secretome has been a source of study by researchers around the world. The aim of this work was to prospect, clone and heterologously express a putative enzyme encoding gene from the thermophilic fungus T. terrestris in A. nidulans A773 strains and to promote its biochemical and biophysical characterization. The gene was amplified, cloned and inserted into the pEXPYR vector before being inserted into A. nidulans expression system. The transformants were induced by culture in minimal médium containing 3% (w/v) maltose and 1% (w/v) glucose by stationary culture for the production, followed by enzyme purification. Biochemical analyses were performed to determine optimum pH and temperature as well as the substrate specificities and kinetic parameters. The enzyme thermostability was also evaluated by circular dichroism (CD). In addition, the collaborative effect between the enzyme and a GH10 on hydrolys of pre-treated sugarcane bagasse was evaluated. The enzyme obtained by heterologous expression was characterized as a xylooligosaccharide oxidase (XylO). Phylogenetic analysis between amino acid sequences of expressed enzyme and other oxidative enzymes classified XylO as belonging to flavoproteins family and subfamily of BBE. TtXylO has been shown to have specificity on C5 oligosaccharides exhibiting good enzymatic activity on complex xylan substrates. The enzyme has an optimum pH of 5.5 and optimum temperature of 25 ºC. DC analyses showed melting temperature of 62.7 ºC, characterizing this enzyme as thermophilic. In general, further studies are still needed to evaluate the products generated from oxidation of xylooligosaccharides by XylO and their potential use in the industry.

Neste trabalho estudamos a dinâmica molecular e o empacotamento em semicondutores orgânicos com diferentes tamanhos de cadeias conjugada usando uma estratégia de multi-técnicas, em particular Ressonância Magnética Nuclear (RMN), espalhamento de Raios-X de alto ângulo (WAXS), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), espectroscopia Raman e espectroscopias Ópticas de absorção UV-Vis e fluorescência. Nestes estudos utilizamos oligômeros de fluorenos, com 3, 5 e 7 unidades repetitivas e copolímeros multibloco conjugados/não-conjugados com as unidades conjugadas constituídas por unidades de fenileno de vinileno (PV) e as não-conjugadas formadas por unidades metilênicas. No estudo com oligômeros, foi mostrado que a capacidade e a forma de ordenamento das cadeias dependem do número de unidades repetitivas, com o Pentâmero possuindo uma tendência muito maior de cristalização. Essa conclusão foi suportada por cálculos teóricos ab-initio, que mostraram que a conformação de menor energia do pentâmero favorece as interações intercadeias e, portanto, o ordenamento de longo alcance. Os resultados referentes aos estudos de dinâmica molecular corroboraram essas características e mostraram que a ativação dos movimentos moleculares nas fases amorfas dos oligômeros são predominantemente dependentes dos comprimentos das cadeias oligoméricas, em concordância com o comportamento encontrado para as suas Tg´s. No estudo referente aos copolímeros multiblocos, foi encontrado que a presença dos grupos espaçadores alifáticos inibem a forte tendência de cristalização das unidades de PV, porém não impedem a agregação dessas unidades. Foi verificado que, a dispersão de tamanhos das unidades agregadas afeta fortemente as características de emissão dos copolímeros, onde a emissão nas cadeias maiores é privilegiada. No que diz respeito a dinâmica molecular, foi observado que a presença de movimentos na região alifática contribui para o aparecimento de processos de relaxação não radiativos o qual inibem a emissão dos copolímeros e provocam alargamento das bandas vibrônicas. Por fim, foi observado que movimentos isotrópicos das cadeias de PV são responsáveis pela transição vítrea dos copolímeros, sendo que as energias necessárias para ativar esses movimentos aumentam com o tamanho da cadeia. Portanto, de forma geral, nossos resultados indicam que mesmo em sistemas com comprimento de cadeias muito bem controlados, as fortes interações intermoleculares presentes em polímeros conjugados, podem tornar a morfologia em estado sólido desses sistemas bastante complexa, sendo que muitas das propriedades ópticas (e provavelmente também elétricas) são afetadas pela forma de empacotamento, desordem conformacional e térmica, além da própria constituição das cadeias. / In this dissertation we present a study of the molecular dynamics and packing in organics semiconductor with different conjugated chains lengths using a of multi-techniques approach, in particular, Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Wide Angle X-ray Scattering (WAXS), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Raman spectroscopy, UV-Vis absorption and fluorescence spectroscopy. The studies were carried-in fluorene oligomers with 3, 5 and 7 repeat units and multi-block conjugated/non-conjugated copolymers with the conjugated part formed by phenylene-vinylene units (PV) and the non-conjugated block formed by methylene units. Concerning the oligomers studies, it was shown that the ability of the chain to form ordered domains as well as the domain structure depend on the number of repeat units, with the pentamer having a higher tendency to crystallization. This conclusion was supported by theoretical ab-initio calculations, which showed that the pentamer conformation favors inter-chain interactions and therefore long-range ordering. The molecular dynamics studies support these characteristics and showed that the activation of molecular motions in oligomers amorphous phase are predominantly dependent on the oligomeric chain lengths, in agreement with the behavior observed for their glass transitions (Tg´s). In the study concerning the multi-block copolymers, it was found that presence of the aliphatic chains inhibit the strong tendency to crystallization of the PV units, but do not prevent their aggregation. It was found that the dispersion in aggregated units sizes strongly affects the copolymers emission, with the emission of larger chains being privileged. Regarding the molecular dynamics, we observed that the presence of motion on aliphatic region contributes to the appearance of non-radiative relaxation processes that inhibit the emission of the copolymers and produce broadening of the vibronic bands. Finally, we observed that isotropic motions of the PV chains are responsible for the copolymers glass transition and the energy required to activate these movements increase with length of the chain. In summary, our results indicate that even in systems with well controlled chains length, the strong intermolecular interactions present in conjugated polymers, can make the solid state morphology of these systems quite complex, which may affect many optical (and probably electric) properties are affected by the packaging structure, thermal and conformational disorder, in addition to the constitution of the chains composition.

Este trabalho está dividido em duas partes: (i) estudo da adsorção da enzima horseradish peroxidase (HRP) sobre substratos planos (lâminas de Si/SiO2, filmes ASP/Si/SiO2, filmes CABads/Si/SiO2, filmes CABspin/Si/SiO2 e filmes CMCABspin/Si/SiO2) seguida de testes da atividade enzimática da HRP imobilizada sobre estes substratos e (ii) obtenção de oligômeros divinílicos mediada pela HRP. Na primeira parte, a imobilização da HRP sobre substratos planos foi estudada através de elipsometria, microscopia de força atômica (AFM) e medidas de ângulo de contato. As isotermas de adsorção da HRP sobre Si/SiO2, APS/Si/SiO2 e CABads/Si/SiO2 apresentaram um aumento contínuo da quantidade de material adsorvido ΓHRP em função da concentração da solução de enzima até atingir um patamar de adsorção no qual verificou-se a formação de uma monocamada de HRP adsorvida. Nestes casos, o processo de adsorção da HRP pode ser descrito pelo modelo de adsorção aleatória (RSA). Para filmes HRP/CABspin/Si/SiO2 e HRP/CMCABspin/Si/SiO2 observou-se adsorção cooperativa de moléculas de HRP e formação de multicamadas. A adsorção da HRP sobre Si/SiO2, filmes APS, CABads e CMCABspin é um processo irreversível. Ao contrário, HRP adsorve reversivelmente sobre filmes CABspin, fato evidenciado pelo decréscimo de ~30% na espessura dos filmes de enzima. A atividade catalítica dos filmes de HRP imobilizados sobre substratos planos foi verificada na reação de oxidação do ABTS. Os testes de atividade catalítica mostraram que os substratos com a HRP adsorvida podem ser reutilizados 3 vezes sem dessorção ou perda da atividade catalítica da enzima, com exceção dos filmes HRP/CABspin/Si/SiO2 que se tornam inativos após a primeira catálise. A condição de máxima atividade catalítica de HRP imobilizada foi correlacionada com grau de cobertura de ~55%. O emprego do monômero etileno glicol dimetacrilato (EGDMA) em reações de polimerização catalisadas por filmes HRP/Si/SiO2 ou pela HRP livre em solução à temperatura ambiente revelou a formação de partículas cristalinas com geometria poligonal. Com objetivo de compreender a formação das estruturas cristalinas, a segunda parte do trabalho focou a formação de oligômeros de EGDMA e trietileno glicol dimetacrilato (TEGDMA) em meio aquoso catalisada pela HRP na presença H2O2 a temperatura ambiente. Os oligômeros de EGDMA e/ou TEGDMA foram caracterizados por gravimetria, cromatografia de permeação em gel, espectroscopia vibracional na região do infravermelho e espectroscopia 1H RMN. A auto-associação dos oligômeros originou partículas cristalinas com ângulos retos, como evidenciado pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura. As medidas de calorimetria exploratória diferencial e difração de raio-x confIrmaram a cristalinidade das amostras. Os oligômeros de EGDMA, TEGDMA e EGDMA-co-TEGDMA sintetizados na presença do sistema HRP-H2O2 apresentaram grupos vinila pendentes, boa solubilidade em clorofórmio e ponto de fusão bem definido, evidenciando pouca reticulação ou ciclização e mostrando que as propriedades catalíticas da HRP propiciam um ambiente reacional apropriado para produzir materiais poliméricos com novas características. / This work is divided into two parts: (i) study on the adsorption of the enzyme horseradish peroxidase (HRP) onto flat substrates (silicon wafers, ASP/Si/SiO2 films, CABads/Si/SiO2 films, CABspin/Si/SiO2 films, and CMCABspin/Si/SiO2 films) followed by enzymatic catalytic tests of HRP immobilized onto these substrates, and (ii) formation of divinyl-based oligomers mediated by HRP. In the first part, the HRP immobilization onto flat substrates was investigated by means of ellipsometry, atomic force microscopy (AFM), and contact angle measurements. Adsorption isotherms of HRP onto silicon wafers, APS/Si/SiO2, and CABads/Si/SiO2 presented the continuous increase of HRP adsorbed amount ΓHRP as a function of enzyme solution concentration until an adsorption plateau, which evidenced monolayer formation. In these cases, the HRP adsorption process can be described by the random sequential adsorption model (RSA). For HRP/CABspin/Si/SiO2 and HRP/CMCABspin/Si/SiO2 cooperative adsorption of HRP molecules and multilayer formation were evidenced. The HRP adsorption onto silicon wafers, APS, CABads, and CMCABspin films is an irreversible process. Contrarily, HRP adsorbed reversibly onto CABspin films, since desorption of ~30% could be detected. The catalytic activity of HRP films immobilized onto flat substrates was verified by oxidation reaction of ABTS. Catalytic tests showed that substrates with adsorbed HRP can be reused three times without desorption or catalytic activity lost, except for HRP/CABspin/Si/SiO2 films, which became inactive after first use. The emulsion polymerization of ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) in mediated by HRP/Si/SiO2 films or by free HRP at room temperature revealed the formation of crystalline particles with polygonal geometry. In order to understand the formation of such crystalline structures, the second part of this thesis focused on EGDMA and/or triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA) oligomers formation in aqueous medium catalyzed by HRP in the presence of H2O2 at room temperature. EGDMA and/or TEGDMA oligomers were characterized by means of gravimetry, gel permeation chromatography, infrared vibrational spectroscopy and 1H NMR spectroscopy. Self-assembling of oligomers led to right-angled crystalline particles, as evidenced by scanning electron microscopy images. Differential scanning calorimetry and X-ray diffractometry measurements ratified the samples crystallinity. EGDMA, TEGDMA and EGDMA-co-TEGDMA oligomers synthesized in the presence of HRP-H2O2 system presented pendant vinyl groups along the chains, good solubility in chloroform, and well defined melting point. These features evidenced few crosslinking or cyclization and revealed that the catalytic properties of HRP provide an appropriate environrnent for production of materials with new characteristics.

A Doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência na população idosa e tende a se tornar um grave problema de saúde pública com o aumento da expectativa de vida da população mundial. A perda progressiva de memória, principal sintoma da demência em pacientes com DA, é atribuída a danos sinápticos e à perda neuronal desencadeadas pelo desequilíbrio entre a produção e a depuração do peptídeo A?. Evidências surgidas nos últimos 20 anos apontam os oligômeros solúveis de A? (A?O), produtos de agregação do peptídeo A?, como as principais espécies neurotóxicas na DA. Por conta disso, e também pela ausência de métodos diagnósticos pre-mortem e tratamento eficientes para essa demência, a busca por anticorpos conformacionais específicos para A?O está em ascensão. Testes clínicos com IgG anti-A? resultaram em efeitos colaterais inflamatórios mediados pela porção não variável Fc. Então, anticorpos conformacionais artificiais do tipo scFv, desprovidos de porção Fc, foram selecionados contra A?O. Dentre eles, está NUsc1, que é neuroprotetor contra A?O em cultura primária de neurônios. Neste trabalho, avaliamos a toxicidade de A?Os na linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada em neurônios maduros e comparamos a neuroproteção conferida por diferentes anticorpos contra A?Os, por ensaio de viabilidade celular com MTT. Também avaliamos a especificidade de NUsc1 por A?O comparativamente a lisozima monomérica e oligomérica em ensaio de ELISA, já que outros anticorpos conformacionais reconhecem epítopo compartilhado por estados oligoméricos de outras proteínas amiloidogênicas. Para a validação de células SH-SY5Y como modelo in vitro de neurônios maduros, a diferenciação foi induzida com ácido retinoico e BDNF e as células foram marcadas para as proteínas MAP2 e NeuN em ensaio de imunofluorescência. Células submetidas ao protocolo de diferenciação apresentaram aumento dos níveis dessas proteínas, mudança morfológica condizente com o esperado na maturação neuronal. Posteriormente, o desafio da cultura com A?O indicou morte celular dose-dependente e reversão desta morte segundo a dose administrada dos anticorpos 6E10 e NU-4. Obtivemos um sinal cerca de 400 vezes maior no reconhecimento de A?O por NUsc1 que para oligômeros de lisozima, quando presentes na mesma concentração, indicando forte especificidade de NUsc1 por A?O. Além disso, NUsc1 purificado em sistema de gelfiltração em HPLC não apresenta citotoxicidade em concentração equivalente a dos anticorpos 6E10 e NU-4 em ensaios de neuroproteção em cultura de SH-SY5Y diferenciada, sugerindo que, se NUsc1 for tão eficiente quanto estas IgG\'s, este poderá ser usado em dose não citotóxica. Portanto, podemos concluir que NUsc1 apresenta grande potencial como ferramenta diagnóstica e terapêutica para a DA, mas que mais experimentos para expandir sua validação e potencial ainda são necessários. / Alzheimer\'s Disease (AD) is the leading cause of dementia in the elderly population and tends to become a serious public health problem with increasing life expectancy of the world\'s population. Progressive memory loss, the main symptom of dementia in patients with AD, is attributed to synaptic damage and neuronal loss triggered by imbalance between production and clearance of the A? peptide. Evidence from the last 20 years indicates that soluble A? oligomers (A?O), A? peptide aggregation products, as the main neurotoxic species in AD. Because of this, and also because of the absence of efficient pre-mortem diagnostic and treatment methods for this dementia, the search for conformational antibodies specific for A?O is on the rise. Clinical tests with anti-A? IgG\'s resulted in inflammatory side effects mediated by the non-variable Fc portion. Then, artificial conformational antibodies of the scFv type, lacking the Fc portion, were selected against A?O. Among them is NUsc1, which is neuroprotective against A?O in primary neuronal culture. In this work, we evaluated the toxicity of A?Os in the differentiated SH-SY5Y human neuroblastoma line in mature neurons and compared the neuroprotection conferred by different antibodies against A?O types by MTT cell viability assay. We also evaluated the specificity of NUsc1 for A?O compared to monomeric and oligomeric lysozyme in the ELISA assay, since other conformational antibodies recognize epitope shared by oligomeric states of other amyloidogenic proteins. For the validation of SH-SY5Y cells as an in vitro model of mature neurons, differentiation was induced with retinoic acid and BDNF and the cells were labeled for MAP2 and NeuN proteins in immunofluorescence assay. Cells submitted to the differentiation protocol presented increased levels of these proteins, a morphological change consistent with the expected neuronal maturation. Subsequently, the challenge of culture with A?O indicated dose-dependent cell death and reversion of this death according to the administered dose of 6E10 and NU-4 antibodies. We obtained a 400-fold higher signal in the recognition of A?O by NUsc1 than for lysozyme oligomers, when present at the same concentration, indicating strong specificity of A?O by NUsc1. In addition, NUsc1 purified on HPLC gel-filtration system does not exhibit cytotoxicity at concentration equivalent to 6E10 and NU-4 antibodies in neuroprotection assays in differentiated SH-SY5Y culture, suggesting that, if NUsc1 is as efficient as these IgG\'s, it may be used in a non-cytotoxic dose. Therefore, we can conclude that NUsc1 presents great potential as a diagnostic and therapeutic tool for AD, but that further experiments to expand its validation and potential are still necessary.

A Doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência na população idosa e tende a se tornar um grave problema de saúde pública com o aumento da expectativa de vida da população mundial. A perda progressiva de memória, principal sintoma da demência em pacientes com DA, é atribuída a danos sinápticos e à perda neuronal desencadeadas pelo desequilíbrio entre a produção e a depuração do peptídeo A?. Evidências surgidas nos últimos 20 anos apontam os oligômeros solúveis de A? (A?O), produtos de agregação do peptídeo A?, como as principais espécies neurotóxicas na DA. Por conta disso, e também pela ausência de métodos diagnósticos pre-mortem e tratamento eficientes para essa demência, a busca por anticorpos conformacionais específicos para A?O está em ascensão. Testes clínicos com IgG anti-A? resultaram em efeitos colaterais inflamatórios mediados pela porção não variável Fc. Então, anticorpos conformacionais artificiais do tipo scFv, desprovidos de porção Fc, foram selecionados contra A?O. Dentre eles, está NUsc1, que é neuroprotetor contra A?O em cultura primária de neurônios. Neste trabalho, avaliamos a toxicidade de A?Os na linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada em neurônios maduros e comparamos a neuroproteção conferida por diferentes anticorpos contra A?Os, por ensaio de viabilidade celular com MTT. Também avaliamos a especificidade de NUsc1 por A?O comparativamente a lisozima monomérica e oligomérica em ensaio de ELISA, já que outros anticorpos conformacionais reconhecem epítopo compartilhado por estados oligoméricos de outras proteínas amiloidogênicas. Para a validação de células SH-SY5Y como modelo in vitro de neurônios maduros, a diferenciação foi induzida com ácido retinoico e BDNF e as células foram marcadas para as proteínas MAP2 e NeuN em ensaio de imunofluorescência. Células submetidas ao protocolo de diferenciação apresentaram aumento dos níveis dessas proteínas, mudança morfológica condizente com o esperado na maturação neuronal. Posteriormente, o desafio da cultura com A?O indicou morte celular dose-dependente e reversão desta morte segundo a dose administrada dos anticorpos 6E10 e NU-4. Obtivemos um sinal cerca de 400 vezes maior no reconhecimento de A?O por NUsc1 que para oligômeros de lisozima, quando presentes na mesma concentração, indicando forte especificidade de NUsc1 por A?O. Além disso, NUsc1 purificado em sistema de gelfiltração em HPLC não apresenta citotoxicidade em concentração equivalente a dos anticorpos 6E10 e NU-4 em ensaios de neuroproteção em cultura de SH-SY5Y diferenciada, sugerindo que, se NUsc1 for tão eficiente quanto estas IgG\'s, este poderá ser usado em dose não citotóxica. Portanto, podemos concluir que NUsc1 apresenta grande potencial como ferramenta diagnóstica e terapêutica para a DA, mas que mais experimentos para expandir sua validação e potencial ainda são necessários. / Alzheimer\'s Disease (AD) is the leading cause of dementia in the elderly population and tends to become a serious public health problem with increasing life expectancy of the world\'s population. Progressive memory loss, the main symptom of dementia in patients with AD, is attributed to synaptic damage and neuronal loss triggered by imbalance between production and clearance of the A? peptide. Evidence from the last 20 years indicates that soluble A? oligomers (A?O), A? peptide aggregation products, as the main neurotoxic species in AD. Because of this, and also because of the absence of efficient pre-mortem diagnostic and treatment methods for this dementia, the search for conformational antibodies specific for A?O is on the rise. Clinical tests with anti-A? IgG\'s resulted in inflammatory side effects mediated by the non-variable Fc portion. Then, artificial conformational antibodies of the scFv type, lacking the Fc portion, were selected against A?O. Among them is NUsc1, which is neuroprotective against A?O in primary neuronal culture. In this work, we evaluated the toxicity of A?Os in the differentiated SH-SY5Y human neuroblastoma line in mature neurons and compared the neuroprotection conferred by different antibodies against A?O types by MTT cell viability assay. We also evaluated the specificity of NUsc1 for A?O compared to monomeric and oligomeric lysozyme in the ELISA assay, since other conformational antibodies recognize epitope shared by oligomeric states of other amyloidogenic proteins. For the validation of SH-SY5Y cells as an in vitro model of mature neurons, differentiation was induced with retinoic acid and BDNF and the cells were labeled for MAP2 and NeuN proteins in immunofluorescence assay. Cells submitted to the differentiation protocol presented increased levels of these proteins, a morphological change consistent with the expected neuronal maturation. Subsequently, the challenge of culture with A?O indicated dose-dependent cell death and reversion of this death according to the administered dose of 6E10 and NU-4 antibodies. We obtained a 400-fold higher signal in the recognition of A?O by NUsc1 than for lysozyme oligomers, when present at the same concentration, indicating strong specificity of A?O by NUsc1. In addition, NUsc1 purified on HPLC gel-filtration system does not exhibit cytotoxicity at concentration equivalent to 6E10 and NU-4 antibodies in neuroprotection assays in differentiated SH-SY5Y culture, suggesting that, if NUsc1 is as efficient as these IgG\'s, it may be used in a non-cytotoxic dose. Therefore, we can conclude that NUsc1 presents great potential as a diagnostic and therapeutic tool for AD, but that further experiments to expand its validation and potential are still necessary.

Apresentamos os resultados do estudo das não-linearidades ópticas de origem eletrônica de duas moléculas da classe dos oligômeros de anilina: o dímero e o tetrâmero. Foram medidas quatro concentrações de tetrâmero, puras e também dopadas em 33 e 100%; uma de dímero pura e outra dopada em 100%. As soluções foram preparadas usando dimetil-sulfóxido (DMSO) como solvente e a dopagem foi realizada com ácido clorídrico. As amostras foram caracterizadas por medidas de absorção linear e fluorescência antes das medidas não-lineares. Obtivemos os valores da primeira hiperpolarizabilidade (?) para todas as amostras, o índice de refração não-linear (n2) do tetrâmero dopado e não dopado, e a absorção não-linear em função da intensidade e da concentração do tetrâmero. As medidas foram realizadas através das técnicas de Varredura-Z, absorção não-linear e espalhamento Hiper-Rayleigh. Os resultados foram interpretados em termos da comparação entre diferentes estados de dopagem e da variação da seção de choque do estado fundamental para o primeiro excitado. / We report on the study of electronic optical non linearities in two aniline oligomers: dimer and the tetramer. Four tetramer concentrations were measured, pure and also 33 and 100% doped; one of dimer non doped another 100% doped. The solutions were prepared using dimethyl sulfoxide (DMSO) as solvent and the doping was performed with hydrochloric acid. The samples were characterized by measurements of linear absorption and fluorescence. We obtained the values of the first hyperpolarizability (?) for all samples, the non linear index of refraction (n2) for non doped and doped tetramer, and the non linear absorption in function of intensity and concentration of the tetramer. The measurements were accomplished through the techniques of Z-Scan, non linear absorption and Hyper-Rayleigh Scattering. The results were interpreted in terms of the comparison among different doping states and of the variation of cross-section for the transition from ground to the first excited states.