Malgré les avancées considérables de la cancérologie, de nouvelles thérapies sont toujours recherchées étant donné les effets secondaires des traitements actuels. Peu connue, la virothérapie oncolytique consiste à utiliser un virus pour détruire des cellules cancéreuses tout en épargnant les saines. Sur les mutants T1026R1 et TP3R1 du VSV de la famille des vésiculovirus portant un génome à ARN négatif de 11 kb, des efforts sont entrepris afin de prouver qu'ils sont des armes efficaces contre le cancer. Cependant, leur faible pouvoir apoptique ainsi que la persistance démontrée pour T1026R1 dans les cellules H4 les rendent moins attrayants. D'autres mutants du VSV, soit TR5R1 et TP6R1 pourraient également être de bons candidats dans la virothérapie oncolytique. Ils ne persistent pas, ils sont de meilleurs inducteurs d'apoptose et comme les mutants T1026R1 et TP3R1, ils induisent fortement la réponse des interférons. Afin de comprendre les différences quant au phénotype d'infection des mutants TP5R1 et TP6R1, le séquençage du génome entier de la souche sauvage HR ainsi que tous les mutants thermosensibles et thermorésistants a été entrepris. Les mutations responsables de la thermosensibilité vs thermorésistance pourront du même coup être révélées. Les résultats confirment les mutations M51R sur la protéine de la matrice de T1026R1 et de T1026 et V221F-S226R de TP3R1. Les mutants TP5R1 et TP6R1 portent respectivement les mutations E254Q et E254G sur le « PH domain » de leur glycoprotéine. Les mêmes mutations sont retrouvées chez TP5 et TP6 avec en plus la mutation D232G aussi sur le « PH domain ». L'analyse de la structure secondaire montre des changements par rapport au VSV Indiana HR, alors que l'analyse de la structure tridimensionnelle montre que seule la mutation D232G altère la structure. La présence de cette mutation sur les souches thermosensibles T1026, TP5, TP6 et le VSV Indiana San juan ainsi que sa conséquence sur la structure 3D laissent présager qu'elle pourrait être responsable de la thermosensibilité. La cartographie génétique des virus BR, T1026, T1026R1, TP3, TP3R1, TP5, TP5R1, TP6 et TP6R1 permettra d'approfondir la compréhension de leur phénotype d'infection particulier pour éventuellement construire un virus oncolytique recombinant conjuguant les avantages de chacun.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Médecine. Sciences de la vie et de la santé. Immunologie-Cancérologie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Les virus oncolytiques sont une nouvelle classe d’agents thérapeutiques pouvant être une alternative au traitement des cancers. Plusieurs virus oncolytiques sont actuellement développés en clinique, néanmoins de nombreuses améliorations sont à apporter afin de créer une nouvelle classe de virus plus efficaces et moins toxiques. Le premier objectif de cette thèse a été d’améliorer la spécificité tumorale du virus de la vaccine via le ciblage de l’antigène MUC1 présenté à la surface des cellules tumorales. Pour cela un virus recombinant présentant à sa surface un fragment d’anticorps (scFv) dirigé contre l’antigène tumoral MUC1 a été construit et produit. Les tests in vitro n’ont toutefois pas permis de mettre en évidence un ciblage spécifique du virus recombinant. Un deuxième aspect de cette thèse a été de tester le potentiel oncolytique de virus de la famille des Poxviridae. Durant ce travail de thèse, les capacités oncolytiques de douze poxvirus, appartenant à 8 genres différents, ont été étudiés. Leurs effets sur la prolifération de cellules cancéreuses humaines ont été évalués. Les virus caractérisés par un effet oncolytique élevé ont été, par la suite, modifiés et armés par ingénierie virale afin d’augmenter leur efficacité. La dernière partie de cette thèse a été consacrée à la génération et la sélection de virus chimériques basées sur la méthode d’évolution dirigée. Cette méthode est utilisée pour mimer le processus naturel de sélection évolutif. Appliqué à la virothérapie oncolytique, ce procédé nous a permis de générer un nouveau virus oncolytique chimérique caractérisé par un potentiel anti-cancéreux amélioré. En résumé, cette thèse a permis, par des techniques d’ingénierie virale, par un criblage de nouveaux virus et par la méthode d’évolution dirigée, de créer et de sélectionner une nouvelle génération de poxvirus oncolytiques présentant une activité thérapeutique accrue avec un profil de toxicité atténué et pouvant être utilisés dans diverses indications thérapeutiques. / Oncolytiques viruses are a new class of therpeutic agents which could be an alternative for cancer treatment. Currently, several oncolytic viruses are evaluated in clinical trial, nevertheless improvements are needed to create a new class of more efficiente and less toxic viruses. The first objective of this thesis was to improved the vaccinia virus specificity through the targeting of the tumor-associated antigen MUC1. To address this goal, a recombinant virus expressing an scFv targeting the MUC1-protein was engineered and produced. However, in vitro, the demonstration of a specific targeting by the recombinant virus was not possible. A second aspect of this thesis work was to evaluate the oncolytic potential of Poxviridae family viruses. Oncolytic capacities of twelve viruses, belonging to eight genera, were evaluated. Their impact on human cancer cells was tested. In order to increase their efficacity, viruses with the highest oncolytic capacities were then modified and armed by genetic engineering. The third part of this work was devoted to the generation of chimeric viruses based on directed evolution process. This methodology is used to mimic the natural process of evolutionary selection. Applied to oncolytic virotherapy, this technique allowed the generation of a new chimeric oncolytic virus caracterised by an enhanced antitumoral potential. In summary, this thesis has allowed, through viral engineering, poxviruses screening and directed evolution methodology, the creation and selection of a new generation of oncolytic poviruses. These viruses demonstrate an increased therpeutic activity and greatest safety profil enabling their application in several therapeutic indication.

L'apport des anticorps immunomodulateurs ciblant PD-1, PD-L1 et CTLA-4 ont récemment révolutionné la prise en charge thérapeutique du cancer. Cependant, seule une minorité de patients développent des réponses objectives à ces traitements. Par conséquent, de nouvelles innovation thérapeutiques sont nécessaires afin d'augmenter l'immunogénicité des tumeurs et de surmonter la résistance à la thérapie contre les anticorps immunomodulateurs. Les propriétés oncolytiques de certains virus peuvent être exploitées afin de permettre un amorçage de l'immunité anti-tumorale. Différents virus oncolytiques (OVS) sont actuellement en développement clinique intense en combinaison avec des thérapies par anticorps immunomodulateurs. Nous avons trouvé qu'un vaccin viral pédiatrique disponible dans le commerce a des propriétés oncolytiques. Ce virus pédiatrique peut tuer directement les cellules cancéreuses, avec des caractéristiques de mort cellulaire immunogène. De plus, ce virus a des propriétés pro-inflammatoires et peut activer la voie NF-kB indépendamment des voies de danger cellulaire (TLR et IRF). Ces propriétés biologiques in vitro se traduisent in vivo en une activité anti-tumorale. L'Injection intra-tumorale du vaccin a des effets anti-tumoraux directs mais également à médiation immunitaire. De façon intéressante, dans des modèles de souris immunocompétentes porteuses de tumeurs murines, l'injection intra-tumorale de vaccin a un effet synergique avec des anti CTLA-4 permettant la guérison de 100% des souris. Les vaccins sont des produits pédiatriques et adultes de grade clinique. Par conséquent, des stratégies de vaccination in situ par injection intra-tumorale pourraient être rapidement mises en clinique / Immune checkpoint targeted therapies against PD-1, PD-L1 and CTLA-4 are currently revolutionizing cancer care. However, only a minority of patients develop objective responses with these treatments. Therefore, new therapeutic interventions are needed to increase the immunogenicity of tumors in order to overcome resistance to immune checkpoint blockade therapy. Oncolytic properties of common viruses can be exploited for the priming of anti-tumor immunity and such oncolytic viruses (OVs) are currently in intense clinical development in combination with immune checkpoint targeted therapies. We have found that commercially available virus vaccines do have oncolytic properties. These pediatric vaccine virus can directly kill cancer cells with features of immunogenic cell death. Moreover, it has pro-inflammatory properties and can activate the NF-Kb pathway in a toll-like receptor and IRF3 independent manner. These in vitro biological properties translate in vivo into anti-tumor activity. Intra-tumoral vaccine therapy has anti-tumor effects which are partly immune mediated. Interestingly, in immunocompetent murine pediatric tumor models, intra-tumoral injection overcome resistance and synergize with immune checkpoint targeted therapy. Vaccines are pediatric and adult clinical grade products. Therefore, in situ intra-tumoral immunization strategies could be implemented quickly in the clinic

Les paramyxovirus respiratoires humains sont des virus responsables d'infections chez les jeunes enfants, les personnes âgées et les patients immuno déprimés. Ces virus possèdent deux glycoprotéines à la surface de leur enveloppe, jouant un rôle dans l'entrée du virus dans la cellule cible. La glycoprotéine d’attachement (HN, G ou H) permet l’attachement du virus à son récepteur cellulaire et, dans le cas de HN, celle-ci est suspectée d’activer la seconde glycoprotéine, la protéinede fusion (F). Cette dernière réalise la fusion entre l'enveloppe du virus et la membrane cellulaire.Le mécanisme par lequel la protéine HN "active" la protéine F reste mal caractérisé, malgré la détermination récente de leurs structures en cristallographie. Plusieurs modèles sont actuellement proposés. Ce travail de thèse s’est focalisé principalement sur les glycoprotéines d’enveloppe des virus parainfluenza humain de type 2 (hPIV-2) et parainfluenza de type 5 (PIV-5), ainsi que sur la glycoprotéine de fusion du métapneumovirus humain (hMPV). La première partie de ce projet a consisté à caractériser une mutation retrouvée sur la protéine F de souches circulantes hPIV-2. Cette étude a notamment souligné l’importance de la sous-unité F2 dans la régulation de la fusion membranaire. Puis, dans un second temps, l’une des étapes du mécanisme d’entrée du métapneumovirus a été étudiée : la fusion membranaire induite par la glycoprotéine F. Il a été démontré qu’il était possible dans une certaine mesure, et par une approche de mutagenèse combinatoire, de dissocier les caractéristiques de F hMPV et ainsi de pouvoir mieux les étudier. Ce travail d’ingénierie de la glycoprotéine F hMPV s’est également inscrit dans un objectif de recherche appliquée afin de contribuer au développement de nouveaux outils prophylactiques et thérapeutiques. Cette perspective thérapeutique de F PIV-5 a été évaluée dans le cadre d’un vecteur oncolytique basé sur l’adénovirus de type 5 (AdV-5). L’expression de cette glycoprotéine hyperfusogène a ainsi contribué à un effet cytotoxique amplifié des vecteurs armés in vitro ainsiqu’en modèle animal immunocompétent. / Human respiratory paramyxoviruses are responsible for infectious diseases and hospitalisations among infants, children, elderly and the immunocompromised. These viruses harbour two glycoproteins implicated in virus entry into the cell. The attachment glycoprotein (HN,G or H) is implicated the virus attachment on a target cell receptor, and HN is also suspected to activate the second glycoprotein, the fusion protein (F). This latter glycoprotein can perform the fusion between the cellular membrane and the viral envelope. The mechanism of activation of the F protein, is not well-defined, even with the structural characterisation for some viruses studied inthis thesis. This thesis work is focussed on the viral glycoprotein of parainfluenza virus type 2 (hPIV-2), parainfluenza virus type 5 (PIV-5), and the fusion glycoprotein of human Metapneumovirus (hMPV).The first part of this project was the characterization of a mutation observed in the F protein natural variants of hPIV-2. This work highlights the importance of the F2 subunit of F in the fusion regulation. A second part of the project consisted of the study of the mechanism of F hMPV entry into the cell, induced by F glycoprotein. This work showed that it was possible to dissociate the characteristics of the F glycoprotein, in order to allow a better understanding of these characteristics. This engineering work on the F protein was used to understand the basic science but could also be used in the development of therapeutic tools.The therapeutic use of F PIV-5 was also evaluated in an oncolytic vector based on adenovirus type 5 (AdV-5). Its expression in tumours showed a highly cytotoxic activity for the target cells in vivo, but also in vitro on immunocompetent rodents.

Le cancer est une maladie qui touche des millions de personnes et ne discrimine pas. La forme de cancer la plus répandue chez les femmes au Canada est le cancer du sein et la deuxième cause de décès par le cancer chez cette population. Les traitements dépendent de plusieurs facteurs dont le stade du cancer, la ménopause, le statut des récepteurs hormonaux et du récepteur HER2 du cancer, etc. Les traitements qui existent sont la chirurgie suivie par la radio- et/ou chimiothérapie et l’hormonothérapie. Malgré les nombreuses études et les avancées dans les traitements pour différents cancers, plusieurs patients ont des cancers du sein qui sont réfractaires aux traitements disponibles. Une alternative naissante est l’utilisation de virus oncolytiques, c’est-à-dire des virus qui ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses et laissent intact les cellules saines. Malheureusement, certains cancers demeurent réfractaires aux traitements avec virus oncolytiques. Ceci nous amène donc à regarder plus en détail des facteurs de l’environnement tumoral qui pourraient prédire la susceptibilité virale et engendrer des résultats positifs. C’est dans cette perspective que nous avons découvert que l'estrogène, précisément l’estradiol, rend les cellules cancéreuses qui en expriment le récepteur plus sensible au virus oncolytique VSV (virus de la stomatite vésiculaire). Cependant, nous ignorons toujours si d’autres hormones peuvent également moduler l’action de VOs. Nous émettons donc l’hypothèse que, comme l’estrogène, d’autres hormones vont affecter l’efficacité des VOs et qu’il serait possible de manipuler ces interactions pour améliorer la réponse au traitement. Notre étude nous permettra de concevoir des stratégies thérapeutiques améliorées pour les patients atteints du cancer du sein. L’importance de cette étude est que jusqu’à présent l’impact des hormones sur l’efficacité des virus oncolytiques reste un sujet inexploré. Nous allons déterminer l’effet de différents niveaux d’hormones sur la réplication et l’effet oncolytique de VSV. Ceci nous donnera ainsi la possibilité et les connaissances d’améliorer la sélection des patients pour le traitement et la conception d’une nouvelle génération de virus oncolytiques perfectionnés. / Cancer is a disease that affects millions of people across the world. The most common cancer in Canadian women is breast cancer and it also represents the second cause of death by cancer in this same group. The treatment depends on multiple factors including the stage of the cancer, menopause status, hormone receptor status, HER2 receptor status, etc. The available treatments for breast cancer are surgery followed by either radiation or chemotherapy as well as endocrine therapy. Despite numerous studies and advances in the treatment of different cancers, many patients’ cancer still remains refractory to these treatments. An exciting new alternative treatment is the use of oncolytic viruses. An oncolytic virus is a virus that can specifically target cancer cells all while leaving healthy normal cells intact. However, many cancers remain refractory to treatment with oncolytic viruses. There was thus a need to investigate different factors or the tumor microenvironment that may predict viral susceptibility and obtain positive outcomes. In this vein, it was found that estrogen (specifically estradiol), a hormone found in the body, can render cancer cells that express its receptor more sensitive to oncolytic virus infection by VSV (vesicular stomatitis virus). In spite of that, we are unaware if there are other hormones capable of modulating the actions of oncolytic viruses. Our hypothesis is that, like estrogen, other hormones will affect the efficacy of oncolytic viruses and that it will be possible to manipulate these interactions with the goal to improve treatment response. Our research will allow the conception of enhanced therapeutic strategies for patients with breast cancer. The importance of this study is that as of now the interplay between hormones and oncolytic viruses remains unexplored. We will determine the effects of hormone levels on viral replication and oncolytic ability of VSV. This knowledge will allow for a greater selection of patients for which oncolytic virus treatment will have a positive outcome. Additionally, it will allow for the development of a new generation of perfected oncolytic virus platforms.