Oropouche virus (OROV) is a medically important orthobunyavirus, which causes frequent outbreaks of a febrile illness in the northern parts of Brazil. However, despite being the cause of an estimated half a million human infections since its first isolation in Trinidad in 1955, details of the molecular biology of this tripartite, negative-sense RNA virus remain limited. The work presented in this thesis has re-determined the nucleotide sequences of OROV strain BeAn19991 (GenBank accession numbers: L, KP052850; M, KP052851 and S, KP052852), and demonstrates that the S segment is significantly longer than the published sequence with an additional 204 nucleotides at the 3' end. Data analysis revealed that there is a critical nucleotide mismatch at position 9 within the base-paired terminal panhandle structure of each genomic segment. Using a combination of deep sequencing and Sanger sequencing the complete genome sequences of 10 field isolates of OROV were also determined for the first time, and led to the identification of a novel OROV reassortant virus. Phylogenetic analysis of these sequences and of published sequences showed that there are two genotypes of OROV, rather than the four genotypes previously proposed. Further work led to the development of a T7-RNA polymerase-driven minigenome and virus-like particle (VLP) production systems for OROV; the information from these was subsequently used to develop a reverse genetics system for OROV. Using reverse genetics, OROV mutants that lack either the non-structural proteins NSm or NSs were generated. In vitro growth properties of the OROV mutant lacking NSm were indistinguishable from the wild-type virus, but the NSs mutant was attenuated in growth, particularly in interferon (IFN) competent cells. Further work demonstrated NSs as a viral IFN antagonist and that it's C-terminus is required for this activity. Interestingly, OROV is more resistant to IFN-α treatment than Bunyamwera virus, but this is not related to its NSs protein. The development of a reverse genetics system for OROV, which is the main human pathogen within the Simbu serogroup of orthobunyaviruses, will prove invaluable for future studies designed to further investigate the molecular pathogenesis of this virus and in the development of attenuated vaccine strains.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / A febre do Oropouche, causada pelo vírus Oropouche (OROV), é uma arbovirose de grande interesse para a saúde pública devido à alta incidência nas áreas tropicais da América do Sul e Central. Devido à inespecificidade dos sintomas, a febre do Oropouche é facilmente confundida com a dengue e uma série de arboviroses. Tais semelhanças sintomáticas dificultam o diagnóstico preciso para OROV, requerendo o desenvolvimento de estudos diferenciais. O diagnóstico laboratorial por isolamento viral é laborioso e depende de infraestrutura e pessoal especializado, disponível em poucos laboratórios brasileiros. O diagnóstico imunoenzimático possui limitações quanto à utilização de partículas virais infecciosas e também por produzirem reações cruzadas com outros vírus da mesma família. Portanto, com o intuito de realizar o diagnóstico sorológico específico para a febre causada por OROV, esse projeto teve por objetivo a construção de antígenos recombinantes a partir dos genes que codificam as proteínas estruturais Ns, G1 e G2 utilizando sistema de expressão eucariótico em células de insetos. Como resultados foram obtidos os baculovírus recombinantes para as proteínas Ns, G1 e G2 de OROV. O baculovírus correspondente à proteína G1 de OROV demonstrou instabilidade, provavelmente devido ao grande tamanho da construção recombinante. Testes de expressão das proteínas Ns e G2, em células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf-9) e High Five, com crescimento em suspensão, revelaram que em Sf-9 a proteína Ns foi exportada para o meio extracelular, enquanto que a proteína G2 foi encontrada na fração sólida da cultura. Não foi detectada expressão das proteínas Ns e G2 de OROV em células High FiveTM. A proteína recombinante Ns foi expressa pela primeira vez em sistema eucariótico, porém a quantidade obtida foi insuficiente para iniciar os ensaios sorológicos. A investigação da interação da proteína Ns com ácidos nucleicos sugere que no sistema de expressão em células de insetos, a mesma está associada ao DNA. Estudos estruturais serão necessários para confirmar os resultados obtidos. / Oropouche fever (OF), caused by Oropouche virus (OROV),is an arboviruse of great interest to public health due to the high incidence in tropical areas of Central and South America. Due to its unspecific clinical signs, OF is usually mistaken with dengue fever and others arboviruses. Such symptomatic similarities hinder accurate diagnosis for OROV, requiring the development of differential studies. Laboratory diagnosis by viral isolation is hard and depends on infrastructure and trained personnel available in few Brazilians laboratorie's. The immuno diagnostic tests present limitations due the use of infectious viral particles and also produce cross reactions with other viruses of the same family. Therefore, in order to perform specific serological diagnosis of OF, the aim of this project was the construction of recombinant antigens based on the structural proteins Ns, G1 and G2 using an eukaryotic insect cells expression system. The results correspond to the achievement of recombinant baculovirus for the proteins Ns, G1 and G2 OROV. The G1 recombinant baculovirus showed instability, probably due to large size of the construct. NS and G2 proteins expression experiments in Spodoptera frugiperda 9 (Sf-9) and High Five, grown in suspension revealed that in Sf-9 NS protein was exported into the extracellular environment, while the G2 protein was found in the culture solid fraction. We did not detect expression of Ns and G2 OROV proteins in High Five cells. The Ns recombinant protein was expressed for the first time in an eukaryotic system, but the amount of protein obtained was insufficient to perform serological assays. The investigation of the interaction of the Ns protein with nucleic acids suggests that in the Baculovirus expression system, it is associated with DNA. Structural studies are needed to confirm the results.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As arboviroses são doenças causadas por vírus transmitidos por vetor artrópode (artropod-born viruses). A transmissão ocorre para os hospedeiros vertebrados susceptíveis no momento do repasto sanguíneo realizado pelos artrópodes hematófagos ou pode ocorrer entre artrópodes através da via transovariana e possivelmente venérea. A região Amazônica possui um grande número de artrópodes hematófagos (culicídeos, flebotomíneos, ceratopogonídeos) e vertebrados silvestres que juntamente com o clima tropical propiciam a manutenção dos arbovírus na natureza. O manejo inadequado da natureza através do desmatamento decorrente da abertura de estradas, construção de barragens, garimpo e mineração são alguns dos eventos responsáveis por surtos de arboviroses identificados na região Norte do Brasil. O Estado de Roraima está localizado no extremo norte do país, com fronteira internacional com a Venezuela e com a Guiana e ainda com o Estado do Amazonas e Pará. Estudos regulares a respeito da circulação de arbovírus no Estado são feitos apenas para dengue e febre amarela, nos quais foi identificada a circulação dos quatro sorotipos de dengue. O grande número de casos notificados para dengue cujo diagnóstico laboratorial é negativo para este arbovírus demonstrou a necessidade de se ampliar a pesquisa para outros vírus. Foram analisadas 150 amostras cujo teste NS1 apresentou-se negativo, provenientes do Laboratório Central de Saúde Pública do Estado de Roraima, pertencentes a pacientes que manifestaram síndrome febril no período agudo da doença (até 5 dias de início dos sintomas) e que possuiam outros sintomas como: artralgia, cefaleia, dor retrorbital, calafrio, mialgia, diarreia, vômito e exantema. Conhecendo-se a maior sensibilidade da técnica de qPCR por sonda as amostras(150) foram submetidas à técnica qPCR para DENV, das quais obtivemos 33 (22%) amostras positivas para DEN tendo identificado os sorotipos por RT-PCR convencional obtendo os seguintes resultados: DENV-1(1), DENV-2(4), DENV-3(2), DENV-4(21), além de obtermos amostras negativas(3) e inconclusivas(2). Posteriormente 72 amostras que permaneceram negativas no qPCR para DENV foram submetidas a qPCR para MAYV/ORO obtendo-se positividade para MAYV(7) e para OROV(13). A identificação de outros arbovírus circulantes no Estado de Roraima torna-se necessária para que se conheça a população viral presente e assim desenvolver mecanismos de monitoramento e detecção, em tempo oportuno, da entrada de um arbovírus emergente, responsável por um possível surto. / The arboviruses are diseases caused by viruses transmitted by arthropod vector (artropod-born viruses). Transmission occurs for vertebrate hosts susceptible at the time of blood meal held by arthropod vectors or can occur between arthropods through transovarially and possibly venereal. The Amazon region has a large number of arthropod vectors (mosquitoes, sand flies, ceratopogonídeos) and wild vertebrates that coupled with the tropical climate favor the maintenance of arboviruses in nature. Inadequate management of nature through deforestation caused by the opening of roads, dams, mining and mining are some of the events responsible for outbreaks of arboviruses identified in northern Brazil. The State of Roraima is located in the extreme north of the country, with international border with Venezuela and Guyana and with the state of Amazonas and Pará. Regular studies regarding the circulation of arboviruses in the state are made just for dengue and yellow fever, which was identified in in the circulation of four dengue serotypes. The large number of reported cases of dengue laboratory diagnosis which is negative for this arbovirus demonstrated the need to expand the research to other vírus. We analyzed 150 samples with NS1 test appeared negative, from the Central Laboratory of Public Health of the State of Roraima, belonging to patients who manifested febrile syndrome in acute period of the disease (up to 5 days of onset of symptoms) and who possessed other symptoms such as arthralgia, headache, retrorbital, chills, myalgia, diarrhea, vomiting and rash. Knowing the greater sensitivity of the qPCR technique to probe the samples (150) were subjected to qPCR technique for DENV, which obtained 33 (22%) samples were positive for DEN serotypes and identified by conventional RT-PCR obtaining the following results : DENV-1 (1), DENV-2 (4), DENV-2 (3), DENV-4 (21), and obtain negative samples (3) and inconclusive (2). Subsequently 72 samples that remained negative for DENV in the qPCR were subjected to qPCR MAYV/OROV positive for obtaining MAYV (7) and OROV (13). Identification of other arboviruses circulating in the State of Roraima is necessary for knowing the viral population present and well developed mechanisms for monitoring and detection, timely entry of an emerging arbovirus responsible for a possible outbreak.

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Introducción: La fiebre de Oropouche es una enfermedad infecciosa causada por el virus Oropouche (OROV). El diagnóstico y predicción del cuadro clínico continúa siendo un gran desafío para los médicos quienes manejan a los pacientes con síndrome febril agudo. Se han asociado diversos síntomas con la infección por virus OROV en pacientes con síndrome febril; sin embargo, a la fecha no existe una regla de predicción clínica. Objetivo: Evaluar el rendimiento de un modelo de predicción basado únicamente en signos y síntomas para diagnosticar la infección por el virus de Oropouche en pacientes con síndrome febril agudo. Materiales y Métodos: Estudio de validación, que incluyó a 923 pacientes con síndrome febril agudo registrados en la base de datos de la Vigilancia Epidemiológica de tres zonas del Perú durante los años 2015-2016. Resultados: Un total de 97 (19.0%) pacientes fueron positivos para infección por Oropouche en el grupo de desarrollo y 54 (23.6%) para el grupo de validación. El área bajo la curva fue de 0.65 y la sensibilidad, especificidad, VPP, VPN, LR+ y LR- fueron de 78.2%, 35.1%, 27.6%, 83.6%, 1.20 y 0.62 respectivamente. Conclusión: El desarrollo de un modelo de predicción clínica para el diagnóstico de OROV basado únicamente en signos y síntomas no funcionó bien debido a que la clínica es inespecífica y se relaciona con otras infecciones arbovirales, lo cual dificulta la predicción del diagnóstico, especialmente en áreas endémicas de coinfección de estas enfermedades. Se recomienda la vigilancia epidemiológica de OROV utilizando pruebas como PCR molecular. / Background. Oropouche fever is an infectious disease caused by the Oropouche virus (OROV). The diagnosis and prediction of the clinical picture continue to be a great challenge for clinicians who manage patients with acute febrile syndrome. Several symptoms have been associated with OROV virus infection in patients with febrile syndrome; however, to date, there is no clinical prediction rule. Objective. To assess the performance of a prediction model based solely on signs and symptoms to diagnose Oropouche virus infection in patients with acute febrile syndrome. Materials and Methods. Validation study, which included 923 patients with acute febrile syndrome registered in the Epidemiological Surveillance database of three areas of Peru during the years 2015-2016. Results. A total of 97 patients (19%) were positive for OROV infection in the development group and 23.6% in the validation group. The area under the curve was 0.65 and the sensitivity, specificity, PPV, NPV, LR + and LR- were 78.2%, 35.1%, 27.6%, 83.6%, 1.20 and 0.62, respectively. Conclusions. The development of a clinical prediction model for the diagnosis of Oropouche based solely on signs and symptoms does not work well because the clinic is nonspecific and is related to other arbovirus infections, which makes it difficult to predict the diagnosis, especially in areas co-infection endemics of these diseases. Epidemiological surveillance of OROV using laboratory tests such as molecular PCR is recommended. / Tesis

Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / A família Bunyaviridae agrupa virus de RNA trissegmentados de cadeia negativa e inclui mais de 350 isolados classificados em cinco gêneros, Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus. Juntos, esses bunyavirus infectam uma grande variedade de animais e plantas, e determinados vírus têm a capacidade de causar doenças graves em seus respectivos hospedeiros. Depois da febre da Dengue, a doença viral transmitida por artrópodes com maior prevalência no Brasil corresponde à febre do Oropouche (FO), cujo agente etiológico é o arbovírus Oropouche (OROV) da família Bunyarviridae, gênero Orthobunyavírus, grupo sorológico Simbu. Nos últimos anos, OROV tem sido responsável por mais de 500.000 casos humanos em extensas e explosivas epidemias na Região Amazônica e no Planalto Central. Com o intuito de buscar novas ferramentas para o diagnóstico específico e tratamento da febre do Oropouche, este projeto teve por objetivo investigar a forma recombinante da proteína do Nucleocapsídeo (N) por meio de estudos estruturais. A proteína N dos bunyavirus é essencial para o processo de replicação, apresentando mecanismo específico de encapsidação do genoma de RNA. O gene que codifica a proteína N de OROV foi subclonada no vetor de expressão bacteriano pET28a (+), com subseqüente expressão em bactéria E. coli da linhagem BL21 (DE3), em diferentes condições de temperatura. Desenvolveram-se estudos estruturais com a análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS), Dicroísmo circular (CD), e de espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS). Os resultados indicaram que o monômero da proteína N de OROV produzida em bactérias apresenta 28kDa com cauda de histidina, e após purificação em condições nativas, apresentou alta massa molecular com tamanho entre 400-660 kDa, sugerindo a formação de multímero associado inespecificamente à molécula de RNA com tamanho menor de 100 bases. / The Bunyaviridae family groups trissegmented RNA virus of negative strand and includes more than 350 isolates classified into five genders, Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus and Tospovirus. Together, these bunyavirus infect a variety of animals and plants, and certain viruses have the ability to cause severe disease in their hosts. After Dengue fever, the viral disease transmitted by arthropods with a higher prevalence in Brazil corresponds to Oropouche fever (OF), whose etiologic agent is the Oropouche virus (OROV) of Bunyarviridae family, Orthobunyavirus genus, and serologic group Simbu. In recent years, OROV has been responsible for more than 500,000 human cases in extensive and explosive epidemics in the Amazon region and in the Central Highlands. In order to search for new tools for specific diagnosis and treatment of OF, this project aimed to investigate the recombinant form of the nucleocapsid (N) protein by means of structural studies. The N protein of bunyavirus is essential for the replication process, and present a specific mechanism for encapsidation of the virus RNA genome. The gene encoding the OROV N protein was subcloned into the bacterial expression vector pET28a (+) with subsequent expression in E. coli strain BL21 (DE3) under different temperature conditions. Structural studies have been developed with the dynamic light scattering analysis (DLS), circular dichroism (CD), and X-ray scattering at low angles (SAXS). The results indicated that the monomer OROV N protein with six histidine tag, produced in bacteria, has 28kDa, and after purification under native conditions, showed high molecular mass size between 400-660 kDa, suggesting multimer formation associated nonspecifically to RNA molecules with a length less than 100 bases.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-30T14:39:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-30T14:39:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-30T14:39:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) Previous issue date: 2017-09-04 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Dengue is currently considered the most important arbovirose. Its main vector is the mosquito Aedes aegypti, present in several regions around the world. The serological diagnosis by means of the NS1 antigen search is the one that has greater applicability, because of easy of execution and the window for detection between the 1st and the 9th day of the onset of symptoms, with a higher frequency until the 5th day. This study aimed to investigate the presence of dengue virus in samples with non-reactive results for the NS1 antigen, assessing if there was a failure in laboratorial diagnosis, or the existence of other arboviruses circulating in the state of Amazonas. Using the RT-qPCR technique, the presence of dengue virus was investigated in 306 serum samples from patients with clinical suspicion of infection. The samples that remained negative were investigated for the presence of the Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) and Oropouche (OROV) viruses with the same methodology, as well as the presence of IgG and IgM for dengue virus by ELISA. Of the 306 analyzed samples, 17 (5.5%) were positive for DENV, with three sequenced for serotype 4. Thirty-four (10.8%) were positive for ZIKV, one (0.3%) for CHIKV, thirteen 4.2%) for MAYV and nine (2.9%) for OROV. In relation to the NS1 test, all kits evaluated presented 100% agreement in negativity. For the screening of anti-DENV antibodies of the IgG class, of the 306 samples tested 134 (43.8%) had positive results. Regarding the detection of the IgM antibody, different positivities were observed for commercial kits: VIRION (n = 250) 35.6% positive; FOCUS (n = 105) 10.5% positive and PANBIO (N = 80) 20% positive. Our results confirm cases of false negative results for the NS1 tests of three commercial kits, in addition to the circulation of other arboviruses among patients from different municipalities in the state of Amazonas. / A dengue é considerada atualmente a mais importante arbovirose. O seu principal vetor é o mosquito da espécie Aedes aegypti, presente em diversas regiões do mundo. O diagnóstico sorológico por meio da pesquisa do antígeno NS1 é o que tem maior aplicabilidade, pela baixa complexidade na execução e por ser detectado entre o 1º e 9º dia de início dos sintomas, porém com frequência maior até o 5º dia. Esse estudo teve por objetivo principal investigar a presença do vírus dengue em amostras com resultados “Não Reagentes” para o antígeno NS1, avaliando se houve falha no diagnóstico laboratorial, ou a existência de outros arbovírus circulando no estado do Amazonas. Utilizando a técnica de RT-qPCR, pesquisou-se a presença do vírus dengue em 306 amostras de soros de pacientes com suspeita clínica de infecção. As amostras que continuaram negativas foram pesquisadas quanto a presença dos vírus Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) e Oropouche (OROV), pela mesma metodologia, bem como foi pesquisada a presença de anticorpos das classes IgG e IgM para o vírus dengue por ELISA. Das 306 amostras analisadas 17 (5,5%) foram positivas para DENV, com três sequenciadas para o sorotipo 4. Trinta e quatro (10,8%) foram positivas para o ZIKV, uma (0,3%) para CHIKV, treze (4,2%) para MAYV e nove (2,9%) para OROV. Em relação ao teste NS1 todos os kits avaliados apresentaram 100% de concordância em negatividade. Para a pesquisa de anticorpos anti-dengue da classe IgG, das 306 amostras testadas 134 (43,8%) tiveram resultados positivos. Em relação à detecção do anticorpo IgM foram observadas diferentes positividades para os kits comerciais: VIRION (n=250) 35,6% positivas; FOCUS (n=105) 10,5% positivas e PANBIO (N=80) 20% positivas. Nossos resultados confirmam casos de resultados falso-negativos, para os testes NS1 de três kits comerciais, além da circulação de outros arbovírus entre os pacientes de diferentes municípios do estado do Amazonas.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-11T12:04:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EpidemiologiaMolecularVirusOropouche.pdf: 8072606 bytes, checksum: 4583fd996c0fca9e376db310de118adb (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-04-08T15:49:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_EpidemiologiaMolecularVirusOropouche.pdf: 8072606 bytes, checksum: 4583fd996c0fca9e376db310de118adb (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-08T15:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_EpidemiologiaMolecularVirusOropouche.pdf: 8072606 bytes, checksum: 4583fd996c0fca9e376db310de118adb (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2009 / O Virus Oropouche (VORO; Bunyaviridae, Orthobunyavirus) é um dos mais importantes arbovírus que infecta humanos na Amazônia brasileira, e é causador da febre do Oropouche. Entre 1961 e 2009, um grande número de epidemias foi registrado em diferentes centros urbanos dos Estados Brasileiros do Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Pará, Rondônia e Tocantins, e também no Panamá, Peru e Trinidad & Tobago. Este trabalho teve por objetivo desenvolver um estudo retrospectivo dos aspectos epidemiológicos e moleculares do VORO enfatizando sua distribuição, a dinâmica das epidemias ocorridas no período, bem como a dispersão de diferentes genótipos na América Latina e no Brasil como contribuição à epidemiologia molecular do VORO. Para tanto 66 isolamentos do VORO pertencentes ao acervo do Instituto Evandro Chagas foram propagados em camundongos e em cultura de células VERO, seguida da extração do RNA viral e obtenção do cDNA por RTPCR; os amplicons foram purificados e submetidos ao sequenciamento nucleotídico para análises moleculares e evolução, incluindo o rearranjo genético, estudo de relógio molecular e análise de dispersão viral. Foi demonstrada a presença de quatro linhagens distintas do VORO na Amazônia brasileira (genótipos I, II, III e IV), sendo os genótipos I e II, respectivamente os mais frequentemente encontrados em áreas da Amazônia ocidental e oriental. Esses e o genótipo III estão constantemente evoluindo, mediante o mecanismo “boom and boost” que resulta na emergência seguida de substituição das sublinhagens (subgenótipos) circulantes por outras mais recentes. O genótipo III do VORO, previamente encontrado somente no Panamá, foi descrito na Amazônia e Sudeste do Brasil. Os dados obtidos pela análise filogenética comparativa das topologias para os segmentos PRNA e MRNA sugerem que o VORO utiliza o rearranjo genético como mecanismo de geração de biodiversidade viral, sendo o genótipo I o mais estável e o II o mais instável e, portanto, mais sensível às pressões evolutivas; foi reconhecido um novo genótipo do VORO neste estudo em amostras isoladas em Manaus no ano de 1980, que foi denominado de genótipo IV. O estudo do relógio molecular mostrou que a emergência do VORO se deu no Estado do Pará provavelmente há 223 anos e daí ao longo dos anos se dispersou pela PanAmazônia bem como para o Caribe, sendo que o genótipo I foi o que originou os demais genótipos do VORO. / Oropouche Virus (OROV; Bunyaviridae, Orthobunyavirus) is one of most important arbovirus which infects humans in the Brazilian Amazon, and is also the causal agent of Oropouche fever. Between 1961 and 2009, dozens of epidemics were registered in several urban centers of the Brazilian states of Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Pará, Rondônia and Tocantins, and also in Panama, Peru and Trinidad & Tobago. This work aimed to develop a retrospective epidemiologic and molecular study of OROV emphasizing its distribution, epidemic dynamics in the period, as well as the dispersion of the OROV genotypes in Brazil and other Latin American countries as a contribution to understanding of the molecular epidemiology of it. A total of 66 OROV isolates of the Instituto Evandro Chagas collection were growth into VERO cells and suckling mice; then, RNA was extracted and cDNA prepared by RT-PCR; the amplicons were purified and submitted to nucleotide sequencing to further molecular and evolution analyzes including genetic reassortment, molecular clock and viral dispersion. It was demonstrated the circulation of four different genetic lineages of OROV in the Brazilian Amazon (genotypes I, II, III, and IV); the genotypes I and II were respectively the most distributed OROV genotypes in Occidental and Oriental Amazon areas. These and the genotype III have been continuously under evolution pressure and changing by the mechanism “boom and boost” which result in an emergence of new OROV sub-genotypes that replace the older circulating sub-lineages in an area. The genotype III which was previousouly recognized in Panama it was identified in the Amazon and Southeast regions. The results obtained by the comparative phylogenetic analyses of the SRNA and MRNA topologies suggest that OROV uses the genetic reassortment as mechanism to further generate its viral biodiversity, and the genotype I is the most stable, while the genotype II is the most unstable, and therefore under higher evolutionary pressure; it was recognized a new OROV genotype in this study, the genotype IV. The molecular clock analysis showed that OROV emerged in Pará State approximately 223 years ago, and along of the years did its dispersal and evolution through the Pan- Amazon as well as to the Caribbean and Central America regions, and the genotype I was responsible by the emergence of all other OROV genotypes.

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