Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: The plant metabolite, strigolactone, has recently gained the status of phytohormone as the result of several studies that implicated its role in plant architecture. These studies would characteristically rely on the use of mutants, such as the rms lines that were generated in peas, that shared several characteristics. This method allowed for the identification of several genetic component of the shared pathway. It is now known that the biosynthesis of strigolactone is dependent on the sequential action of an isomerase (D27) and two carotenoid cleavage deoxygenases (CCD7 and CCD8). Furthermore, it is known that strigolactone perception is localised to the plant nucleus, where it interacts with an α/β-fold hydrolase (D14) which would concomitantly binds to target proteins. The F box protein (MAX2) is able to recognize this proteïen complex. Through a MAX2 dependent mechanism the target protein becomes tagged for proteolysis. However, this model, though intricate, has only really been shown in higher plants. The model bryophyte, Physcomitrella patens, serves as a useful tool in genetic studies due to its predisposition for homologous recombination. More recently it has also gained interest in studies pertaining to strigolactones, which has led to the generation of a Ppccd8Δ mutant. Compared to the wild type, the Ppccd8Δ line produces more protonemal tissue. Furthermore, exogenous strigolactones have also been shown to inhibit colony expansion. Here we shown that there is only a single candidate gene, PpMAX2, present in the P. patens genome that could serve as a homologue for the Arabidopsis thaliana MAX2. Furthermore, we show that a recombinant GFP:PpMAX2 localises to the nucleus of P. patens cells. A Ppmax2:: mutant was generated which, unexpectedly, did not show the phenotype of Ppccd8Δ. Ppmax2:: has an apparent inability to produce protonema and appears to rather dedicate its growth to the production of gametophores. A double mutant, Ppccd8Δ max2Δ was generated which also displayed the characteristic phenotype of Ppmax2::. It seems therefore that the activity of PpMAX2 is able to override that of PpCCD8. By employing a GUS reporter system, we showed that the promoter, PPpMAX2, is predominantly active within gametophore tissues. Taken together, these results suggest that the activity of PpMAX2 facilitates the transition of gametophore tissue to protonema tissue. Although exogenous strigolactones did not appear to affect the growth of the Ppmax2:: line as it did the PpWT or Ppccd8Δ lines, those responses that have been ascribed to strigolactones to date have mostly been observed in protonemal tissue. We therefore suspect that any strigolactone response that might have been elicited in Ppmax2:: would have been masked by its phenotype of predominantly protonemal tissue. We are therefore hesitant to make any sweeping statements in regards to the role PpMAX2 might have in strigolactone perception in P. patens. However, though we suspect that PpMAX2 might not be a true functional homologue for the characterised MAX2 homologues from higher plants, we suspect that it may well be the ancestral predecessor of MAX2. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Strigolaktoon is ‘n metaboliet wat deur plante vervaardig word en is redelik onlangs as ’n fitohormoon geklassifiseer. Die klassifikasie as fitohormoon is die gevolg van verskeie studies wat strigolaktoon se rol in die plantstruktuur beklemtoon het. In hierdie studie is daar gebruik gemaak van mutante, soos onderandere die rms lyne, wat gegenereer is in ertjies, wat verskeie kenmerke deel. Sodoende is verskeie komponente van ’n gedeelde molekulêre padweg geïdentifiseer. Daar word tans verstaan dat die sintese van strigolaktoon afhanklik is van die stapsgewyse aksies van ’n isomerase (D27) en twee karotenoïedklewingsdeoksigenases (CCD7 en CCD8). Verder is dit bekend dat strigolaktoon waargeneem word in die plant nukleus deur te assosieer met ’n α/β-vou-hidrolase (D14) wat vervolgens met teikenproteïene bind. Die kompleks word deur ’n F-boks proteïen (MAX2) herken wat daartoe lei dat die teikenproteïen gemerk word vir proteolise; altans, dit is tans die model wat vir hoër plante aanvaar word. Die model briofiet, Physcomitrella patens, word dikwels aangewend in genetiese studies weens dit ’n hoër vatbaarheid vir homoloë rekombinasie het. Om P. patens te benut in navorsing wat die rol van strigolaktoon ondersoek is ook voordelig, aangesien daar reeds ’n Ppccd8Δ mutant beskikbaar is. In vergelyking met die wilde tipe, produseer Ppccd8Δ meer protonemale weefsel en blyk dit dat strigolaktoon die vermoë het om kolonie verspreiding te bekamp. Hier wys ons dat daar ’n enkele kandidaat geen, PpMAX2, in die genoom van die P. patens teenwoordig is wat as ’n homoloog vir die Arabidopsis thaliana MAX2 kan dien. Verder wys ons dat ’n rekombinante GFP:PpMAX2 proteïen wel na die selkern van P. patens selle lokaliseer. ’n Ppmax2:: mutant is gegenereer wat, onverwags, nie die fenotipe van Ppccd8Δ vertoon het nie. Ppmax2:: het ’n onvermoë om protonema te produseer en wy groei eerder aan die produksie van gametofiete. ’n Dubbele mutant, Ppccd8Δ max2Δ, is gegenereer wat ook die fenotipe van Ppmax2:: vertoon het; dus kom ons tot die gevolgtrekking dat die aktiwiteit van PpMAX2 dié van PpCCD8 oorheers. Deur gebruik te maak van ’n GUS verklikkersisteem kon ons aflei dat die aktiwiteit van die PPpMAX2 promotor hoofsaaklik tot die uitdrukking van PpMAX2 in gametofiet weefsel lei. Dit is moontlik dat die aktiwiteit PpMAX2 dus die oorgang van gametofoor weefsel na protonema weefsel te weg bring. Alhoewel strigolaktoon nie die groei van die Ppmax2:: lyn beïnvloed soos vir die PpWT of Ppccd8Δ lyne nie, vermoed ons dat die reaksie slegs in die protonemale weefsel waargeneem sal word. Daar kan tans nie met absolute sekerheid gesê word of PpMAX2 enigsins verbonde met strigolaktoon persepsie in mos is nie, tog vermoed ons dat PpMAX2 ’n primitiewe voorloper vir die gekarakteriseerde MAX2 homoloë van die hoër plante is.

La maladie de Newcastle est une de deux pestes aviaires qui, comme l’influenza, impactent fortement les élevages d’oiseaux domestiques par leur incidence clinique et leurs conséquences économiques sur la filière (contrôle des mouvements d’animaux, abattages sanitaires et préventifs). Des vaccins contre cette maladie ont été développés il y a plusieurs décennies à base de souches virales isolées dans les années 60. Ils assurent normalement une excellente protection clinique. Toutefois, depuis une dizaine d’années, des observations de terrain, principalement en Afrique et en Asie, font état d’échecs partiels de vaccination avec occurrence de foyers réduits dans des élevages a priori correctement vaccinés. En parallèle, des essais in vivo en conditions contrôlées ont établi que les vaccins actuels protégeaient bien cliniquement contre une épreuve avec des souches virulentes récentes mais n’empêchaient pas leur excrétion par les animaux vaccinés. Pour résoudre cette problématique, l’objectif de ce travail a été de générer une souche vaccinale plus efficace contre les souches virulentes circulant actuellement à l’échelle du globe. Pour générer des virus atténués modifiés, nous avons dû dans un premier temps améliorer le système conventionnel de génétique inverse. Nous montrons que la réduction du nombre de plasmides à 2 dans le système, permet de générer plus de virus atténués que le système conventionnel basé sur 4 plasmides. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à étudier le comportement in vitro de virus atténués et virulents équipés de marqueurs fluorescents. Nous montrons que seuls les virus virulents induisent un effet cytopathique in vitro. En revanche, les deux types de virus induisent une infection persistante à long terme sans effet cytopathique. Les cellules infectées de façon persistante résistent à une surinfection par un autre virus. En revanche, lors de co-infections simultanées, nous établissons qu’une cellule infectée par un premier virus peut s’infecter par un second virus lors d’un transfert direct de matériel viral d’une cellule à une autre par des extensions membranaires. Cette observation est remise en perspective par rapport à la capacité de ces virus à se recombiner chez l’animal telle qu’identifiée par des analyses bioinformatiques comparatives de différents isolats. En effet, nous montrons que des cellules peuvent s’infecter avec plusieurs virus par contact direct. Dans un dernier travail, une nouvelle souche vaccinale a été générée consistant à insérer des antigènes immunoprotecteurs d’un virus original isolé à Madagascar en 2008, dans un génome d’une souche vaccinale conventionnelle utilisée depuis plus de 50 ans. Nous montrons que cette nouvelle souche protège efficacement contre trois génotypes viraux dont deux circulant actuellement en Afrique et en Asie. / In addition to influenza, Newcastle disease is one of the two major diseases of poultry that strongly impact the animal health and farming owing to animal bans and depopulations. Vaccines against Newcastle disease are available. They have been developed some decades ago from isolates collected in the 60’s. They usually provide an excellent clinical protection. However, field reports of the last decade, mainly from Africa and Asia, suggest partial vaccination failures in some farms despite proper vaccination. In parallel, in vivo trials have shown that current vaccines provide a good clinical protection against a challenge with recent field strains, but do not prevent shedding of the challenge virus from vaccinated birds. To address this issue, one of the objectives of this study was to generate a new vaccine prototype with improved efficacy against virulent strains circulating worldwide. To generate new engineered attenuated viruses, we first developed an improved reverse genetics system. We demonstrate that the reduction of the number of plasmids to 2 compared to the conventional system based on 4 plasmids does not affect the performances of reverse genetics for virulent strains but significantly increases the yield of attenuated viruses. In a second step, we focused on the behavior of the attenuated and virulent viruses generated by reverse genetics. The viruses were tagged with fluorescent reporter genes to make easier they follow up in cell culture. We show that only virulent strains produce cytopathic effects in vitro. However, both attenuated and virulent strains are able to establish persistent infection in cells without cytopathic effects. Persistently infected cells resist to a super-infection by another virus. In contrast, after co-infection by two different viruses, we show that a cell infected by one virus can be infected by a second one by direct virus trafficking between the cells through cell membrane extensions. This observation supports the possibility of recombination events in the field which are frequently claim in the literature from comparative bioinformatics of field isolates and vaccine strains. Indeed, we show that cells can be infected by multiple viruses through direct contacts between cells. In a last step, a new vaccine prototype has been produced consisting in the substitution of immune-protective antigens in the conventional LaSota vaccine by their homologues derived from an original isolate of Madagascar (2008). We show that this prototype is protective against challenges with three different viruses, including two recent isolates from Africa and Asia.

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La transmission des virus grippaux de type A s’effectue via l’eau, l’air ou les surfaces. Elle implique donc toujours une étape dans l’environnement, durant laquelle les virus sont inactivés plus ou moins rapidement en fonction du sous-type ou de la souche virale analysés. Cependant, à ce jour, les facteurs moléculaires déterminant la stabilité des particules virales en dehors de l’hôte restent largement méconnus. Dans le but d’identifier ces déterminants, nous avons généré différentes combinaisons de réassortiments entre deux virus grippaux de sous-types H1N1 possédant un phénotype de stabilité différent. Les stabilités respectives de ces virus réassortants ont été évaluées dans un environnement-modèle, puis comparées entre elles. Pour cela, nous avons utilisé un système d’analyse en temps réel des cultures cellulaires, permettant de calculer, pour chacun des virus testés, une pente d’inactivation moyenne et, in fine, de mesurer l’influence respective de chacun des segments viraux sur le phénotype de stabilité des virus. D’après nos résultats, le phénotype de stabilité des virus grippaux est majoritairement déterminé par l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), qui sont les principales glycoprotéines de surface de ces virus. De plus, nous avons identifié des changements d’acides aminés dans la HA et dans la NA, qui ont pour effet une diminution ou une augmentation de la stabilité des particules virales dans l’environnement. Nous avons également montré qu’un virus avec un gène de la HA codons-optimisés, et donc porteur de mutations synonymes, suffit pour augmenter significativement la stabilité des particules virales dans l’environnement. La stabilité de la HA à pH acide, le taux d’expression de la HA dans les cellules infectées, et le nombre de sites de fixation aux ions calcium dans la NA sont modifiés par les mutations décrites dans cette étude, et sont donc des facteurs de stabilité des particules virales. De plus, une analyse en microscopie a permis de montrer que les virus inactivés dans l’environnement peuvent fixer leurs récepteurs cellulaires, mais sont incompétents pour induire l’étape de fusion dans l’endosome nécessaire à l’entrée des virus dans la cellule. Ces deux étapes du cycle viral sont dépendantes de la HA. Dans l’ensemble, nos résultats montrent l’importance de la HA et de la NA des virus grippaux dans la détermination du phénotype de stabilité des virus grippaux dans l’environnement. Par conséquent, la diversité connue des HA et NA dans la nature laisse supposer des variations fréquentes du phénotype de stabilité de ces virus. Leur étude pourrait permettre de mieux décrire l’écologie et l’épidémiologie de ces virus. L’analyse des données épidémiologiques et climatiques des épidémies de grippe saisonnière, sur 5 ans et dans 13 pays, a ainsi révélé une différence de distribution des virus H1N1 et H3N2, en fonction de la température hebdomadaire dans ces pays. La comparaison de la stabilité de ces virus sur des surfaces, à 4 °C et à 20 °C, suggère que la distribution des sous-types viraux au début des épidémies est en partie régulée par leur stabilité en fonction de la température / The transmission of Influenza A viruses (IAV), either airborne in mammals or oro-faecal in aquatic birds, submits viral particle to a wide range of environmental conditions. These environmental conditions modulate IAV survival outside the host, which is also dependent on the viral subtype or strains. To date, the molecular drivers of IAV environmental persistence remain to be identified. In order to identify IAV molecular drivers of the environmental persistence, we generated different reassortant viruses between two H1N1 viruses that do not have the same stability outside the host. To this purpose, we performed survival kinetic and compared the inactivation slope of generated reassortant viruses in our controlledenvironment, using a real time cell analysis system. Our results demonstrate that the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA) are the main viral segments driving IAV environmental persistence. In addition, mutations driving viral stability in the environment were identified in the HA and NA amino-acid sequences. We also demonstrated that synonymous mutations introduced in the HA, using a codon-optimization strategy, drive the environmental persistence of IAV. The HA stability at low pH, HA surface expression levels in infected cells and the number of calcium binding sites of the NA were alternately changed by the mutations described in our study, indicating that these are stability determinants of IAV survival outside the host. Then, the sequential events of viral entry were analysed with fluorescence microscopy assays, showing that viral particles being exposed for a long period in saline water at 35°C are still able to bind their cellular receptor whereas the HA-mediated fusion within the endosome is not possible anymore. These two steps of the viral cycle are mainly mediated by the HA protein. Altogether, these result highlight the importance of the HA and the NA proteins, driving the environmental persistence of IAV. Given the known diversity of these two proteins in nature, this arouses interest in studying IAV environmental persistence at a more global scale. Such study could improve our knowledge on IAV ecology and epidemiology. Epidemiologic and climatic data analyse of human seasonal influenza viruses during 5 years and from 13 countries revealed that H1N1 virus and H3N2 virus distribution differs according to the mean weekly temperature in these countries. We then compared the H1N1 virus and H3N2 virus persistence on stainless steel surface at 4 °C and 20 °C, and the preliminary results suggest that IAV seasonal subtypes distribution might be partly regulated by their stability according to the temperature

Human enterovirus 71 (HEV71) is a member of the Human Enterovirus A species within the Family Picornaviridae. Since 1997, HEV71 has emerged as a major cause of epidemics of hand, foot and mouth disease (HFMD) associated with severe neurological disease in the Asia-Pacific region. At the present time, little is known about the pathogenesis of acute neurological disease caused by HEV71. The major aim of this study was to generate infectious cDNA clones of HEV71 and use them as tools for investigating the biology of HEV71 and molecular genetics of HEV71 virulence and pathogenesis. Two infectious cDNA clones of HEV71 clinical isolates, 26M (genotype B3) and 6F (genotype C2) were successfully constructed using a low copy number plasmid vector and an appropriate bacterial host. Transfection of cDNA clones or RNA transcripts derived from these clones produced infectious viruses. Phenotypic characterisation of clone-derived viruses (CDV-26M and CDV-6F) was performed, and CDV-26M and CDV-6F were found to have indistinguishable phenotypes compared to their wild type viruses. Strains HEV71-26M and HEV71-6F were found to have distinct cell culture growth phenotypes. To identify the genome regions responsible for the growth phenotypes of the two strains a series of chimeric viruses were constructed by exchanging the 5„S untranslated region (5„S UTR), structural protein (P1), and nonstructural protein (P2 and P3) gene regions using infectious cDNA clones of both virus strains. Analysis of reciprocal virus chimeras revealed that the 5„S UTR of both strains were compatible but not responsible for the observed phenotypes. Both the P1 and P2-P3 genome regions influence the HEV71 growth phenotype in cell culture, phenotype expression is dependent on specific P1/P2-P3 combinations and is not reciprocal. In the previous study, in order to investigate the pathogenesis of HEV71 infection, a mouse HEV71 model was developed using a mouse-adapted variant of HEV71-26M. Mouse-adapted strain MP-26M caused fore- and/or hindlimb paralysis in mice, whereas HEV71-26M-infected mice did not develop clinical signs of infection at any virus dose or route of inoculation tested. In this study, the molecular basis of mouse adaptation by HEV71 was identified. Nucleotide sequence analysis of HEV71-26M and MP-26M revealed three point mutations in the open reading frame, each resulting in an amino acid substitution in the VP1, VP2 and 2C proteins; no mutations were identified in the untranslated regions of the genome. To determine which of the three amino acid mutations were responsible for the adaptation and virulence of HEV71-26M in mice, recombinant cDNA clones containing one, or a combination of two or three mutations, were constructed. Mouse virulence assays of the mutated viruses clearly demonstrated that a non-conservative amino acid substitution (G710„_E) in the capsid protein VP1 alone was sufficient to confer the mouse virulence phenotype on HEV71. In addition, a mouse oral infection model was established in this study. Oral inoculation with the mouse-adapted HEV71 virus, MP-26M, induced fore-or hindlimb paralysis in newborn mice in an age- and dose-dependent manner. As oral transmission is the natural route of HEV71 infection, this murine HEV71 oral infection model will provide a suitable tool for studying HEV71 pathogenesis, for defining neurological determinants, and for testing vaccine efficacy and immunogenicity in the future.

Le virus de la paralysie chronique de l’abeille (CBPV) est responsable d’une maladie infectieuse et contagieuse de l’abeille domestique. c'est un virus anisométrique et non enveloppé. Les premières études ont décrit son génome étant constitué de cinq segments d’ARN simple brin de polarité positive : deux ARN majoritaires et trois ARN minoritaires. Cependant, ces derniers n’ont pas été observés lors de récentes études. L’ARN 1 coderait pour les protéines non structurales et L’ARN 2 coderait pour deux protéines structurales.Les ARN totaux du CBPV sont infectieux chez l’abeille par inoculation intra-thoracique. Toutefois, les éléments génétiques essentiels à la réplication du virus n’étaient pas encore déterminés. Néanmoins, cette information est cruciale pour la mise en place du système de génétique inverse pour le CBPV afin de mieux caractériser ce virus. Lors de ce travail, nous avons montré le pouvoir infectieux des ARN majoritaires du CBPV. Ces résultats nous ont permis d'accomplir la première étape de la mise du système de génétique inverse pour le CBPV: le clonage des ARN majoritaires. Les résultats préliminaires montrent que les ARN transcrits in vitro à partir des plasmides recombinants sont répliqués in vivo après leur inoculation aux abeilles, mais ne conduisaient à aucun signe clinique de la maladie. Le système de génétique inverse du CBPV développé offrira la possibilité, par mutagenèse dirigée, de définir les fonctions des ORF et des protéines voire de permettre la production de protéines purifiées nécessaires à la production d’anticorps monoclonaux afin de développer un test rapide de diagnostic de la paralysie chronique. / Chronic bee paralysis virus (CBPV) causes an infectious and contagious disease of adult honeybees. CBPV is an anisometric and non-enveloped virus. First studies described its genome as composed of five positive single-stranded RNAs: two major RNAs and three minor RNAs. However, these latest were not observed during recent studies. CBPV RNA 1 encodes for the non-structural proteins and RNA 2 encodes for two structural proteins. The total RNAs of CBPV are infectious by intra-thoracic inoculation of bees. However, the essential genetic elements for CBPV replication are still unknown. Besides, this information is crucial to develop a reverse genetic system in order to better characterize this virus.In this work, we showed the infectivity of CBPV major RNA. These results allowed us to accomplish the first step of the implementation of the reverse genetics system for CBPV: cloning of major RNA. Our preliminary results showed that RNA transcribed in vitro from recombinant plasmids replicated in vivo after inoculation to bees, but did not led to any clinical signs of the disease.The reverse genetics system developed for CBPV facilitate the study of CBPV genome, by site directed mutagenesis, the determination of its proteins functions. Moreover, it allows the expression of purified proteins necessary for production of monoclonal antibodies to develop a rapid diagnostic test for CBPV.

Dans le contexte de la menace pandémique liée au virus influenza A(H5N1), un projet «GRIPPE AVIAIRE ET GRIPPE PANDÉMIQUE » a émergé au sein de LyonBioPôle avec comme objectif le développement d’outils de caractérisation des virus influenza pour la production de vaccins. Pour étudier le réassortiment génétique entre virus influenza, nous avons développé 3 systèmes de génétique inverse : virus humain A(H3N2) et aviaires A(H5N2) et A(H5N1) et produit des virus réassortants de composition déterminée. Leurs capacités réplicatives ont été évaluées par cinétiques de croissance virale sur MDCK avec quantification de la production virale par qRT-PCR temps réel. L’émergence du virus influenza A(H1N1)2009 pose deux questions sur l’acquisition par réassortiment génétique, d’une résistance à l’oseltamivir d’une part ou de facteurs de virulence d’autre part. Nous avons donc développé un protocole de co-infection virale de cellules MDCK pour étudier les constellations de gènes des réassortants entre différents virus: A(H1N1)2009-A(H1N1) H275Y et A(H1N1)2009-A(H5N1). Nous montrons par deux approches différentes, génétique inverse et co-infections virales, que le réassortiment génétique entre souches aviaires et humaines et surtout aviaires et porcines est possible, en privilégiant certaines constellations. Nous rapportons que le virus pandémique peut acquérir la NA H275Y des virus A(H1N1) Brisbane-like résistants à l’oseltamivir sans que ses capacités de réplication ne soient altérées. De même nous montrons que son réassortiment avec un virus hautement pathogène A(H5N1) est possible. Ces observations renforcent la nécessité de promouvoir la vaccination afin de limiter les risques de co-infection virale chez un même individu. / In the context of A(H5N1) pandemics threat, an « avian flu and flu pandemics » project was proposed by LyonBioPole to develop influenza viruses characterization tools for vaccine production. To study genetic reassortment between influenza viruses, 3 reverse genetic systems of A(H3N2) human virus and A(H5N2) and A(H5N1) avian viruses were developed and reassortant viruses were produced. Their replicative capacities were evaluated using growth kinetics on MDCK cells with viral production quantification by real-time qRT-PCR. The A(H1N1)2009 emergence raises two questions about the acquisition by genetic reassortment of oseltamivir resistance and/or pathogenicity determinants. A co-infection protocol on MDCK cells was developed to study gene constellations of reassortant viruses like A(H1N1)2009-A(H1N1) H275Y and A(H1N1)2009-A(H5N1). We report here that genetic reassortment is possible between avian, human and swine strains using reverse genetic and viral co-infection and that some specific constellations emerged. We also report, that pandemic A(H1N1)2009 can acquire the H275Y mutated NA from seasonal oseltamivir resistant A(H1N1) viruses without any modifications on replicative capacities. This genetic reassortment is also possible with A(H5N1) viruses. These observations strenght the importance of vaccination against all these influenza strains to reduce the risk of one-individual viral co-infection.

La génétique inverse est devenue une méthode clé pour la production de virus à ARN génétiquement modifiés et pour comprendre les propriétés cellulaires et biologiques des virus. Cependant les méthodes les plus fréquemment utilisées, basées sur le clonage de génomes viraux complets dans des plasmides, sont laborieuses et imprévisibles. La première partie de cette thèse présente des études sur la mise au point d'un nouveau système de génétique inverse, appelé méthode ISA (Amplicons-Sous génomique-Infectieux), qui permet la génération, en quelques jours, de virus infectieux sauvages et génétiquement modifiés appartenant à trois familles différentes de virus à ARN simple brin de polarité positive, avec une grande maîtrise des séquences virales. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons appliqué pour la première fois à un arbovirus (CHIKV), le ré-encodage des codons - une méthode développée récemment et très excitante pour le développement de vaccins vivants atténués. En utilisant une approche aléatoire de ré-encodage des codons qui attribue au hasard des codons sur la base de la séquence en acides aminés correspondante, nous avons mis en évidence des pertes importantes de fitness réplicatif sur des cellules de primates et d'arthropodes. La diminution du fitness réplicatif est en corrélation avec le degré de ré-encodage, une observation qui peut aider à la modulation de l'atténuation virale. En utilisant l'expérience acquise avec le CHIKV, nous avons transposé avec succès ce mécanisme d'atténuation au JEV et amélioré notre maîtrise du processus d'atténuation en utilisant une combinaison de la synthèse de novo et de la méthode ISA. / Reverse genetics has become a key methodology for producing genetically modified RNA viruses and deciphering cellular and viral biological properties, but the most commonly used methods, based on the preparation of plasmid-based complete viral genomes, are laborious and unpredictable. The first part of this thesis presents studies relating to the development of a new reverse genetics system, designated the ISA (Infectious-Subgenomic-Amplicons) method, which enabled the generation of both wild-type and genetically modified infectious viruses belonging to three different families of positive, single stranded RNA viruses within days with great control of the viral sequences. In the second part of this thesis, we applied for the first time to an arbovirus (CHIKV), codon re-encoding - a recently developed and very exciting method for the development of live attenuated vaccines. Using a random codon re-encoding approach which randomly attributed nucleotide codons based on their corresponding amino acid sequence, we identified major fitness losses of CHIKV in both primate and arthropod cells. The decrease of replicative fitness correlated with the extent of re-encoding, an observation that may assist in the modulation of viral attenuation. Detailed analysis of these observed replicative fitness losses indicated that they are the consequence of several independent re-encoding induced events. Using the experience acquired on the CHIKV, we successfully transposed this attenuation mechanism to JEV and improved our control of the attenuation process by using a combination of de novo synthesis and the ISA method.

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