Die Osteoarthrose ist eine degenerative Erkrankung der Gelenke. Sie zeichnet sich durch eine sukzessive Destruktion des Knorpels sowie der umliegenden Strukturen aus. Die Osteoarthrose ist die häufigste Gelenkerkrankung des Menschen und tritt insbesondere im hohen Lebensalter auf. Schätzungen zu Folge wird Osteoarthrose im Jahr 2020 zu der viert häufigsten Ursache für Erwerbsunfähigkeit aufsteigen. Neben dem Leidensdruck für den Patienten ist dies auch mit erheblichen Kosten für das Gesundheitssystem verbunden. Die natürliche Regeneration des avaskulären hyalinen Knorpels ist aufgrund der geringen Zelldichte und dem niedrigen Metabolismus der Zellen beschränkt. Es fehlt ein Perichondrium das den Knorpel stabilisiert und mit undifferenzierten Mesenchymzellen, als Quelle für frische Chondroblasten bzw. Chondrozyten, versorgt. Das fibrokartilaginäre Ersatzgewebe im erkrankten artikulären Knorpel beherbergt eine Population von Vorläuferzellen mit chondrogenen Eigenschaften. Die Herkunft dieser Zellen ist wenig erforscht. Es wird vermutet, dass diese durch Einsprossungen von Blutgefäßen aus dem subchondralen Knochen in die beschädigten Areale migrieren. Diese chondrogenen Progenitorzellen (CPCs) könnten sich als zugänglich für medikamentöse Therapien zur Stimulation ihres Reperaturpotentials erweisen. In dieser Arbeit sollten Coaktivatoren von dem chondrogenen Transkriptionsfaktor SOX9 oder Corepressoren von dem osteogenen Transkriptionsfaktor RUNX2 identifiziert werden. Dazu wurden CPCs verwendet, die durch siRNA-vermittelten Knockdown von RUNX2 in der Produktion von chondrogenen Faktoren stimuliert werden sollten. Auch der umgekehrte Versuch wurde durchgeführt. Durch den Knockdown von SOX9 sollten osteogene Faktoren stimuliert werden, die als Ziel inhibitorischer Therapien dienen könnten. Dabei konnte zunächst der antagonistische Zusammenhang zwischen SOX9 und RUNX2 in CPCs gezeigt werden. Der Knockdown von RUNX2 führte zu einer Hochregulation von SOX9 und damit zu einer Erhöhung des chondrogenen Potentials der Zellen. Umgekehrt führte der Knockdown von SOX9 zu einer Hochregulation von RUNX2 und damit zu einer Verringerung des chondrogenen Potentials der CPCs. Mithilfe massenspektrometrischer Analysen konnten aus Immunpräzipitationen und Pulldown-Isolaten von SOX9 und RUNX2 eine Vielzahl von Proteinen isoliert werden, die mit Signaltransduktionen und der Transkription in Verbindung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige der möglichen Coaktivatoren von SOX9 in CPCs überexprimiert und mögliche Corepressoren von SOX9 durch siRNA in ihrer Expression inhibiert. Die Überexpression von DDX5, HSPA8, RAB5C und YWHAE führte zu einer Zunahme der Genexpression von SOX9. Während HSPA8 auch eine Zunahme der Genexpression von RUNX2 bewirkte, führte YWHAE zu dessen Herabregulation und damit zu einer Erhöhung des chondrogenen Potentials von CPCs. Durch den Knockdown von LEMD2 und TMPO konnte ebenfalls eine Hochregulation von SOX9 erreicht werden. Ein Anzeichen für die Erhöhung des chondrogenen Potentials bot hierbei zusätzlich die erhöhte Expression der extrazellulären Bestandteile ACAN und die verminderte Expression von COL1A1. Darüber hinaus wurde zum ersten Mal die Interaktion zwischen SOX9 und DDX5 durch Coimmunpräzipitation untersucht. SOX9 konnte dabei copräzipitiert werden allerdings war der umgekehrte und damit der validierende Versuch nicht erfolgreich und bedarf weiterer Untersuchung, z. B. mithilfe einer anderen Methode wie Yeast-Two-Hybrid, um die tatsächliche Protein-Protein-Interaktion zu bestätigen bzw. um sie auszuschließen. Diese Ergebnisse zeigen, dass mithilfe der affnitätschromatographischen Aufreinigung von SOX9 sowie RUNX2 mögliche Interaktionspartner durch massenspektrometrische Analysen der isolierten Proteinkomplexe identifiziert werden können. Inwieweit diese Proteine direkt auf SOX9 einwirken oder Teil einer übergeordneten Transkriptionsmaschinerie sind muss in weiteren Studien untersucht werden, um die Frage zu beantworten, ob diese auch als potentielles Ziel für therapeutische Maßnahmen in Betracht kommen. Darüber hinaus muss die Frage geklärt werden, inwieweit sich die identifizierten Proteine auf die Expression von nachgeschalteten chondrogenen Faktoren auswirken. Diese Arbeiten könnten einen wichtigen Beitrag in der Entwicklung von neuen Therapeutika gegen Osteoarthrose leisten.

Diese Arbeit untersucht die humanen chondrogenen Progenitorzellen (CPC) auf ihre Eignung für einen möglichen Therapieansatz der Osteoarthrose (OA). Hierbei zeigte sich, dass die CPC die Fähigkeit zur Migration sowohl in vitro als auch ex vivo besitzen. In vitro steigerte der Einsatz von TGF-ß3 die Migrationsrate, was von therapeutischem Nutzen sein könnte. Die CPC wanderten ex vivo ebenso in Knorpelgewebe aus makroskopisch unauffälligen Bereichen wie in an den Hauptdefekt angrenzendes Gewebe ein. Mit der Versuchsdauer nahm die Einwanderungstiefe zu, wobei dies im unauffällig erscheinenden Knorpel ausgeprägter war und hier auch größere Eindringtiefen gemessen wurden. Dies spricht für eine Zielzone, die die CPC anstreben und die im Knorpel neben dem Hauptdefekt früher erreicht wird. Bezüglich der Migrationsgeschwindigkeit weisen die CPC eine Heterogenität auf, verglichen mit anderen Zelltypen im menschlichen Organismus ist sie insgesamt allerdings gering. Über die gesamte Versuchsdauer ließen sich in beiden Gewebetypen proliferationsfähige CPC nachweisen. Eine Genexpressionsanalyse zeigte, dass die CPC dedifferenzierten Chondrozyten am ähnlichsten sind und eine kurzfristige Kultivierung sie kaum beeinflusst. Die Transfektion veränderte die Ausrichtung der CPC nicht, sondern führte vornehmlich zu einer vorübergehenden generellen Herabregulierung der Genexpression. Die Ergebnisse zeigen, dass ein therapeutischer Einsatz der CPC möglich wäre, da die Zellen auf einfache und komplikationsarme Weise gewonnen und kultiviert werden können. Zudem eröffnen die ausgeprägten migratorischen Fähigkeiten der CPC einfache Applikationswege, z. B. im Rahmen einer intraartikulären Injektion oder Arthroskopie. Ebenso viel versprechend ist die Erkenntnis, dass die Zellen innerhalb des Gewebes vital bleiben und so an einer Regeneration teilhaben könnten. Vor einer zukünftigen Anwendung der CPC bleiben allerdings noch einige Fragen zu beantworten. So ist die Rolle der CPC in der Pathogenese der OA noch nicht vollständig geklärt. Außerdem bleibt offen, wie lange die CPC im Gewebe vital bleiben und ob sie in der Lage sind, im Gewebe hyaline Knorpel-EZM herzustellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben daher Anlass für weitere Forschung auf diesem Gebiet.

Die Osteoarthrose (OA) des Ellbogengelenks ist eine der wichtigsten Gelenkerkrankungen des Hundes, die sich aufgrund erblich bedingter Fehlstellung der Gelenke sekundär häufig schon bei sehr jungen Hunden entwickelt und zu einer verminderten Lebensqualität der Tiere führt. Im Laufe der Erkrankung kommt es zu einer Schädigung des Gelenkknorpels, der an Elastizität und Spannkraft verliert und seine Funktion, nicht mehr ausüben kann. Eine Ablösung von Knorpelfragmenten und Entzündungen im Gelenk können die Zerstörung des Gelenkknorpels beschleunigen. Die OA ist nicht heilbar. Das Therapieziel ist eine möglichst vollständige Schmerzreduktion und die Verbesserung der Lebensqualität. Eine chirurgische Denervation ist im Ellbogengelenk des Hundes ohne Traumatisierung anatomischer Strukturen nicht möglich. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, erstmalig einen experimentellen Ansatz zur chemischen Denervation sensibler Gelenkafferenzen im Ellbogengelenk beim Beagle mit dem Neurotoxin OX7-Saporin durchzuführen. Zusätzlich wurden Substanzen aus der Humanmedizin zur Schmerzreduktion und symptomatischen Therapie der OA am Hund erprobt und der Therapieerfolg evaluiert. Im Rahmen eines Therapieversuches in der Klinik für Kleintiere der Universität Leipzig wurde bei zwei, an OA erkrankten Hunden Capsaicin einmalig intraartikulär injiziert. Der erste Hund erhielt intraartikulär 250 mg Capsaicin. Dieser Patient zeigte Nebenwirkungen in Form einer Herz- und Atemfrequenzerhöhung, starker Schmerzhaftigkeit und neurologischen Symptomen. Der zweite Hund wurde mit 83 mg Capsaicin behandelt und zeigte keine Nebenwirkungen. Sowohl die Bewertung der Besitzer als auch die orthopädische Untersuchung ergaben keine Verbesserung der Lahmheit. Vier kranken Hunden wurde ebenfalls im Rahmen eines Therapieversuches Botox (Botulinumtoxin A) intraartikulär einmalig injiziert. Drei Hunde wurden mit 50 Einheiten, ein Hund mit 100 Einheiten Botox behandelt. Die Applikation von Capsaicin und Botox führten zu keiner Verbesserung der Symptomatik. In der Humanmedizin ist die Schmerzbehandlung mit Capsaicin und Botox erfolgreich. Deshalb sollten diese Therapieansätze auch für die Anwendung beim Hund weiter optimiert werden. Das Neurotoxin OX7-Saporin wurde in einer Dosierung von 100 µg erstmalig in das Ellbogengelenk von drei Beagle-Hündinnen appliziert, um eine sensible Denervation des Gelenkes zu erreichen. Der retrograde Transport des Ribosomen-inaktivierenden Proteins in die Perikarya der Spinalganglienzellen, die das Ellbogengelenk sensibel innervieren, sollte eine selektive Zerstörung der Neurone durch das Neurotoxin bewirken. Der retrograde Tracer Fluoro-Gold wurde, zur Kontrolle der Wirkung des Neurotoxins, nach einer Wartezeit von 15 Tagen intraartikulär in das linke und das rechte Ellbogengelenk appliziert. Fluoro-Gold kann ausschließlich von intakten Nervenfasern transportiert werden. Die Ganglien C4 - Th3 wurden bilateral zur histologischen Auswertung entnommen und in Paraffin eingebettet. Zur Bestimmung der Gesamtneuronenanzahl wurden alle Neurone in jedem dritten Schnitt eines Ganglions gezählt. Die Summe dieser Nervenzellen ergab die Gesamtneuronenanzahl eines Ganglions. Die Einlagerung von Lipofuszin führte zu einer starken Autofluoreszenz im Zytoplasma der Neuronen. Alle Schnitte wurden mit Sudan-Schwarz gefärbt, um die Autofluoreszenz von der retrograden FG-Markierung zu unterscheiden. Die FG-Markierung konnte nur in den Ganglien C6 und Th1 im Zytoplasma sehr weniger Neuronen dokumentiert werden. Der histologische Nachweis einer Neurodegeneration nach Applikation des Neurotoxins OX7-Saporin in das linke Ellbogengelenk war negativ. In den untersuchten Spinalganglien wurden intakte Nervenzellen nachgewiesen. Auch die bilaterale intraartikuläre Injektion des retrograden Tracers FG war nicht erfolgreich. Aus den Ergebnissen dieser experimentellen Ansätze wird zusammenfassend geschlussfolgert: Ø Vor der Durchführung zukünftiger experimenteller Untersuchungen beim Hund muss die optimale Konzentration und die Wartezeit für das Neurotoxins OX7-Saporin ermittelt werden. Ø Die Rezeptoren für OX7-Saporin müssen an den Nervenzellen des Hundes zweifelsfrei nachgewiesen werden, bevor das Neurotoxin im caninen Tiermodell eingesetzt werden kann. Ø Die optimale Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffes FG für intraartikuläre Injektionen und dessen retrograde Transportgeschwindigkeit beim Hund müssen ermittelt werden, bevor dieser Tracer wieder im Tierexperiment eingesetzt werden kann. Ø FG wurde als 1,8%ige Lösung in das Ellbogengelenk beim Beagle appliziert. Diese Konzentration war wahrscheinlich zu gering, um eine retrograde Markierung der sensiblen Neurone in den entsprechenden Spinalganglienzellen nachzuweisen. Ø Die intraartikuläre Applikation des Neurotoxins OX7-Saporin führte nicht zur selektiven Neurodegeneration. Eine Aussage zur Schmerzausschaltung und symptomatischen Therapie der OA des Hundes mit OX7-Saporin ist deshalb nicht möglich.

Made available in DSpace on 2016-12-06T17:07:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diego.pdf: 1428301 bytes, checksum: deaba295723a0309d132a439fb80fac0 (MD5) Previous issue date: 2010-03-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / With this descriptive study it was aimed to evaluate the kinematic characteristics of the gait of individuals with knees osteoarthritis. Specifically: to analyze the clinical characteristics, characterize kinematics in volitional speed. It was also aimed to verify and to compare gait kinematics in different speeds. Participated of this study 18 (14 women and 4 men); 66 ± 7,6 years old. After the approval of the Ethics Committee in research with human of the UDESC, all the participants informed about the objectives and procedures of the study and signed an agreement form. The data collection were performed of in the laboratory of Biomechanics of the CEFID/UDESC. Initially the WOMAC questionnaire was applied and later the anthropometrics data had been acquired. In the sequence they had been carried through the landmark of the axles to articulate with the reflectives markers and the taking of the photos for acquisitions of amplitude of the passive and active movements. Finally, the acquisitions of the kinematic data of the gait first in fixed floor in the habitual and fast speed had been carried through, where the speeds had been measured through photocells that were connected to a chronometer, and after period of familiarization of the citizens in the treadmill walking, in controlled speed (2km/h). The filmings of the gait had been bidimensional, acquired through the camera of the system Peak Motus to a frequency of 60 Hz, previously calibrated. The images had been edited and the reflective markers digitalized by Ariel software Performance Analysis System - APAS 1,4 ® for attainment of the angles to articulate of the hip, knee and ankle and spatial temporal variables. The kinematic data had been filtered with Butterworth 4ª order and pass frequently low of cut of 6Hz. Descriptive statistics for characterization of the clinical variables was used and of the kinematics variable in the habitual speed and for the comparison between the speeds measured ANOVA were applied repeated; to verify between which speeds it had differences, applied the Post hoc of Bonferroni. P≤0,05 was adopted. The results had indicated that the citizens had presented high levels of index of corporal mass, presenting degrees varied of osteoarthritis of knees. The individuals had told to moderate complaint of pain and rigidity in the knee, and that they cause difficulty in the performance of the daily functions. It was observed that osteoarthritis of knee can unchain reduction of the passing length of, time of rocking, amplitude of movement of hip and knee and the extension of hip and increase of the support time, flexion of knee in the initial contact and reduction of the amplitude of movement of hip and knee and the reduction of the extension of hip. The increase in the speed provoked reduction of the maximum plant flexion of ankle, amplitude of movement of the ankle, principle flexion of knees and reduction of the maximum dorsiflexion. In the angular variables, ankle in the initial contact, knee in the initial contact, maximum extension of knees and amplitude of movement of knees, had occurred compensations for the difference of the fixed and mobile floor. However, the clinical and demographic characteristics of the citizens had demonstrated a predisposition of the studied sample to a progression of the illness and can indicate loss of the functional capacity. The individuals with osteoarthritis of knees had presented different kinematic characteristics of gait of citizens without osteoarthritis cited in literature. Angular and spatial temporal variables had suffered modifications in function from the speed addition. / Com este estudo descritivo objetivou-se avaliar as características cinemáticas da marcha de indivíduos com osteoartrose de joelhos. Especificamente: analisar as características clínicas desses indivíduos; caracterizar as variáveis cinemáticas da marcha em velocidade habitual; verificar e comparar variáveis cinemáticas da marcha entre diferentes velocidades. Participaram 18 indivíduos (14 mulheres e 4 homens) com média de idade 66 ± 7,6 anos. Após a aprovação do Comitê de Ética em pesquisas com seres humanos da UDESC, todos os sujeitos foram informados sobre os objetivos do estudo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. As coletas de dados foram realizadas no laboratório de Biomecânica do CEFID/UDESC e utilizou-se como instrumentos uma ficha cadastral, questionário WOMAC, balança, estadiômetro, fita métrica, câmera fotográfica digital com tripé, sistema de fotocélulas com cronômetro, esteira ergométrica e uma câmera do sistema PeakMotus. Como procedimento de coletas inicialmente aplicou-se o questionário WOMAC e depois foram adquiridos os dados antropométricos. Na seqüência foram realizadas as demarcação dos eixos articulares com os marcadores refletivos e a tomada das fotos para aquisições das amplitudes de movimentos passivas e ativas. Por fim, foram realizadas as aquisições dos dados cinemáticos da marcha primeiramente em piso fixo na velocidade habitual e rápida, onde as velocidades foram medidas através de fotocélulas que estavam conectadas a um cronômetro, e após período de familiarização dos sujeitos na esteira, em velocidade controlada (2km/h). As filmagens da marcha foram bidimensionais, adquiridas através da câmera do sistema Peak Motus a uma freqüência de 60 Hz, previamente calibrada. As imagens foram editadas e os marcadores reflexivos digitalizados através do software Ariel Performance Analysis System - APAS 1.4 ® para obtenção dos ângulos articulares do quadril, joelho e tornozelo e das variáveis espaço temporais. Os dados cinemáticos foram filtrados com Butterworth 4ª ordem e passa baixa com freqüência de corte de 6Hz. Utilizou-se estatística descritiva para caracterização das variáveis clínicas e das variáveis cinemáticas na velocidade habitual e para a comparação entre as velocidades aplicou-se ANOVA medidas repetidas; para verificar entre quais velocidades houve diferenças, aplicou-se o Post hoc de Bonferroni. Adotou-se p≤0,05. Os resultados indicaram que os sujeitos apresentaram níveis elevados de índice de massa corporal, apresentando graus variados de osteoartrose de joelhos. Os indivíduos relataram queixa moderada de dor e rigidez no joelho, e que acarretam em dificuldade no desempenho das funções diárias. Observou-se que a osteoartrose de joelho pode desencadear redução do comprimento de passada, tempo de balanço, amplitudes de movimento de quadril e joelho e da extensão de quadril e aumento do tempo de apoio, flexão de joelho no contato inicial e diminuição das amplitudes de movimento de quadril e joelho e a diminuição da extensão de quadril. O aumento na velocidade provocou diminuição da máxima plantiflexão de tornozelo, amplitude de movimento do tornozelo, máxima flexão de joelhos e diminuição da máxima dorsiflexão. Nas variáveis angulares tornozelo no contato inicial, joelho no contato inicial, máxima extensão de joelhos e amplitude de movimento de joelhos, ocorreram compensações pela diferença do piso fixo e móvel. Contudo, as características clínicas e demográficas dos sujeitos demonstraram uma predisposição da amostra estudada a uma progressão da doença e podem indicar perda da capacidade funcional. Os indivíduos com osteoartrose de joelhos apresentaram características cinemáticas de marcha diferentes de sujeitos sem osteoartrose citados na literatura e tanto variáveis espaço temporais quanto variáveis angulares sofreram modificações em função do acréscimo de velocidade.

No description available.

No description available.

L'Osteoarthrose (OA) est la maladie articulaire la plus répandue avec un impact socio-économique croissant en raison du vieillissement de la population, de l’augmentation de l'obésité et surtout de l'absence d'un traitement efficace. En effet, l’OA est caractérisée par la dégradation inéluctable du cartilage articulaire, l'apoptose des chondrocytes, un remodelage osseux sous-chondral et une inflammation de la synovie. La matrice extracellulaire (MEC) du cartilage est constituée de collagènes et de protéoglycanes (PG) eux-mêmes composés de glycosaminoglycanes (GAG) liés à un corps proteique, présents dans l'ECM ou à la surface cellulaire. Les GAG sont des chaînes polysaccharidiques linéaires sulfatées comprenant les Héparine/Héparan Sulfate (Hep/HS), Chondroitin Sulfate (CS) et Keratan Sulfate (KS). L'acide hyaluronique (AH) est un GAG non sulfaté particulier, non associé à un corps proteique. Dans le cartilage, l'un des principaux composants de la MEC est l'aggrécan, un CS/KS PG qui forme des aggrégats par interaction avec de l’AH. Au cours du vieillissement, des changements dans la qualité des PG ouvrent la voie à l’OA et les études depuis 60 ans se concentrent sur les aggrécans et le catabolisme des CS. En effets, les niveaux d'expression des CS, la taille de leurs chaînes, leurs profils de sulfatation évoluent, affectant les propriétés mécaniques de la MEC. Cependant, les traitements actuels de visco-supplémentation à base d’injections locales de CS ont démontré leur limite puisque la réparation du cartilage n'est pas induite. Même si ils sont rares dans le cartilage adulte, les HSPG sont associés aux chondrocytes et leurs rôles a été démontrée lors du développement osseux. Or les HS sont des régulateurs de l’homéostasie très importants car ils peuvent lier et réguler l'activité de protéines liant l'héparine (HBP) (facteurs de croissance, cytokines, chimiokines, morphogènes), les protégeant contre la protéolyse et potentialisant leur liaison à leurs récepteurs. Tous ces effets sont contrôlés par les profils de sulfatation complexes des chaînes d’HS.Dans ce contexte les objectifs de cette thèse sont de caractériser l'évolution de la signature chimique et de la fonctionnalité des HS au cours de l’OA. En collaboration avec les Rhumatologistes et Orthopédistes de l’Hopital Henri Mondor, une évaluation quantitative des HS dans des échantillons de cartilage humain contrôle versus OA a été corrélée à la gravité des dommages. Grace à la plateforme glycomic du CRRET, des modifications dans les profils de sulfatation des disaccharides de HS ont été observées et confirmées par des analyses de l'expression des enzymes de la biosynthèse des GAG. Ces caractéristiques structurales ont été corrélées à des changements fonctionnels de l’affinité des GAG pour des HBP, telles que FGF-2, VEGF et PTN. Enfin, les GAG OA ont des capacités différentes à moduler les propriétés (prolifération, adhésion, phénotype) de cellules souches mésenchymateuses, chondrocytes, fibroblastes et cellules endothéliales. Ces résultats démontrent que des modifications des structures et fonctions des HS pourraient être impliquées dans l'évolution de l'homéostasie du cartilage vers des processus pathologiques au cours de l’OA. Ce projet se positionne clairement comme une recherche fondamentale et translationnelle qui permettra d'acquérir des connaissances sur les mécanismes régulant les interactions cellules/matrice au cours de l'OA. De plus, les outils développés au cours de ce projet ont permis de réaliser 2 projets collaboratifs sur l'hypertension artérielle pulmonaire et une pathologie éosophagique. Enfin, ces données confirment l'intérêt d’identifier de nouvelles cibles glycaniques basées sur la chimie des HS. Cela permettra de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique basée sur des composes à même de contrôler les profils de sulfatation de la MEC, dans le but d'améliorer les propriétés de cellules souches thérapeutiques endogènes ou exogènes, associées. / Osteoarthritis (OA) is the most prevalent joint disease with increasing socio-economic impact due to population aging, obesity , and absence of an efficient medical treatment that can repair cartilage. OA is characterized by degradation of articular cartilage, hypertrophy and apoptosis of chondrocytes, subchondral bone remodeling and joint synovial inflammation. Cartilage extracellular matrix (ECM) consists of collagens, glycoproteins and proteoglycans (PGs) that are composed of Glycosaminoglycans (GAGs) linked to core proteins, presents in the ECM or at the cell surface. GAGs are linear polysaccharidic sulfated chains including Heparine/Heparan Sulfate (Hep/HS), Chondroitin Sulfate (CS) and Keratan Sulfate (KS) families. Hyaluronic acid (HA) is a particular un-sulfated GAG no associated to core protein. In cartilage, one of the major ECM component is aggrecan, a CS/KS PG that form aggregate through HA interaction. During the aging process, changes in PGs quality pave the way for OA and studies are focus on aggrecans and CS catabolism since 60 years. CS expression levels, chain size, sulfation patterns evolved during OA, affecting the mechanical properties of ECM. However, treatments based on visco-supplementation with CS local injections have demonstrated their limit since cartilage repair is not induced. Even if rare in adult cartilage, HSPG are present associated to chondrocytes also and their relevance was demonstrated mainly during bone development. HS chains are very important homeostatic regulators because they are able to bind and regulate the activity of several heparin binding proteins (HBP) (growth factors, cytokines, chemokines, morphogens), protecting them against proteolysis and potentiating their binding to their receptors. These interactions provide a stock of regulatory factors that can be release by selective degradation of the HS chains too. All these regulatory effects are mediated through the complex sulfation/acetylation pattern of HS chains but no data are available on this aspect during OA.In this context, the goals of this Thesis were to characterize the evolution of HS chemical signature and functionality during OA. In collaboration with Rheumatology and Orthopedic clinical teams from Henri Mondor Hospital, a quantitative evaluation of HS and CS amount in control versus OA human cartilage samples was correlated to the structural damage severity. According to the tools of the CRRET’s lab glycomic platform, structural changes on HS and CS sulfated disaccharides compositions was observed using HPLC, confirmed by RQ-PCR analyzes of the expression of enzymes involved in GAG biosynthesis. These structural features were correlated to functional changes on HBP affinities, such as FGF-2, VEGF and PTN, through ELISA based competition assay. Finally, GAGs from OA have different abilities to modulate properties (adhesion proliferation, phenotype…) of Mesenchymal Stem Cells, chondrocytes, fibroblast and endothelial cells. These results clearly make the proof that modifications of HS structures and functions could be involved in the evolution of cartilage homeostasis and pave the way for altered pathological processes during OA. This project is clearly positioned as a fundamental and translational research that will permit to gain knowledge on the mechanisms regulating cartilage cells/matrix interactions during OA. All these results are summarized in 2 scientific and 1 review articles. Moreover, all the tools developed during this project have permit to realize 2 collaborative projects and associated articles on Pulmonary Hypertension and Eosophagic pathology also. Finally, all these data confirmed the interest of the team to identify new glycanic targets based on HS chemistry. This will permit to propose new therapeutic strategy based on HS compounds associated to endogenous or exogenous therapeutic stem cells, with the aim of improving cell properties according to HS ability to control sulfation panels of ECM.

No description available.

No description available.

Die Osteoarthrose (OA) des Ellbogengelenks ist eine der wichtigsten Gelenkerkrankungen des Hundes, die sich aufgrund erblich bedingter Fehlstellung der Gelenke sekundär häufig schon bei sehr jungen Hunden entwickelt und zu einer verminderten Lebensqualität der Tiere führt. Im Laufe der Erkrankung kommt es zu einer Schädigung des Gelenkknorpels, der an Elastizität und Spannkraft verliert und seine Funktion, nicht mehr ausüben kann. Eine Ablösung von Knorpelfragmenten und Entzündungen im Gelenk können die Zerstörung des Gelenkknorpels beschleunigen. Die OA ist nicht heilbar. Das Therapieziel ist eine möglichst vollständige Schmerzreduktion und die Verbesserung der Lebensqualität. Eine chirurgische Denervation ist im Ellbogengelenk des Hundes ohne Traumatisierung anatomischer Strukturen nicht möglich. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, erstmalig einen experimentellen Ansatz zur chemischen Denervation sensibler Gelenkafferenzen im Ellbogengelenk beim Beagle mit dem Neurotoxin OX7-Saporin durchzuführen. Zusätzlich wurden Substanzen aus der Humanmedizin zur Schmerzreduktion und symptomatischen Therapie der OA am Hund erprobt und der Therapieerfolg evaluiert. Im Rahmen eines Therapieversuches in der Klinik für Kleintiere der Universität Leipzig wurde bei zwei, an OA erkrankten Hunden Capsaicin einmalig intraartikulär injiziert. Der erste Hund erhielt intraartikulär 250 mg Capsaicin. Dieser Patient zeigte Nebenwirkungen in Form einer Herz- und Atemfrequenzerhöhung, starker Schmerzhaftigkeit und neurologischen Symptomen. Der zweite Hund wurde mit 83 mg Capsaicin behandelt und zeigte keine Nebenwirkungen. Sowohl die Bewertung der Besitzer als auch die orthopädische Untersuchung ergaben keine Verbesserung der Lahmheit. Vier kranken Hunden wurde ebenfalls im Rahmen eines Therapieversuches Botox (Botulinumtoxin A) intraartikulär einmalig injiziert. Drei Hunde wurden mit 50 Einheiten, ein Hund mit 100 Einheiten Botox behandelt. Die Applikation von Capsaicin und Botox führten zu keiner Verbesserung der Symptomatik. In der Humanmedizin ist die Schmerzbehandlung mit Capsaicin und Botox erfolgreich. Deshalb sollten diese Therapieansätze auch für die Anwendung beim Hund weiter optimiert werden. Das Neurotoxin OX7-Saporin wurde in einer Dosierung von 100 µg erstmalig in das Ellbogengelenk von drei Beagle-Hündinnen appliziert, um eine sensible Denervation des Gelenkes zu erreichen. Der retrograde Transport des Ribosomen-inaktivierenden Proteins in die Perikarya der Spinalganglienzellen, die das Ellbogengelenk sensibel innervieren, sollte eine selektive Zerstörung der Neurone durch das Neurotoxin bewirken. Der retrograde Tracer Fluoro-Gold wurde, zur Kontrolle der Wirkung des Neurotoxins, nach einer Wartezeit von 15 Tagen intraartikulär in das linke und das rechte Ellbogengelenk appliziert. Fluoro-Gold kann ausschließlich von intakten Nervenfasern transportiert werden. Die Ganglien C4 - Th3 wurden bilateral zur histologischen Auswertung entnommen und in Paraffin eingebettet. Zur Bestimmung der Gesamtneuronenanzahl wurden alle Neurone in jedem dritten Schnitt eines Ganglions gezählt. Die Summe dieser Nervenzellen ergab die Gesamtneuronenanzahl eines Ganglions. Die Einlagerung von Lipofuszin führte zu einer starken Autofluoreszenz im Zytoplasma der Neuronen. Alle Schnitte wurden mit Sudan-Schwarz gefärbt, um die Autofluoreszenz von der retrograden FG-Markierung zu unterscheiden. Die FG-Markierung konnte nur in den Ganglien C6 und Th1 im Zytoplasma sehr weniger Neuronen dokumentiert werden. Der histologische Nachweis einer Neurodegeneration nach Applikation des Neurotoxins OX7-Saporin in das linke Ellbogengelenk war negativ. In den untersuchten Spinalganglien wurden intakte Nervenzellen nachgewiesen. Auch die bilaterale intraartikuläre Injektion des retrograden Tracers FG war nicht erfolgreich. Aus den Ergebnissen dieser experimentellen Ansätze wird zusammenfassend geschlussfolgert: Ø Vor der Durchführung zukünftiger experimenteller Untersuchungen beim Hund muss die optimale Konzentration und die Wartezeit für das Neurotoxins OX7-Saporin ermittelt werden. Ø Die Rezeptoren für OX7-Saporin müssen an den Nervenzellen des Hundes zweifelsfrei nachgewiesen werden, bevor das Neurotoxin im caninen Tiermodell eingesetzt werden kann. Ø Die optimale Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffes FG für intraartikuläre Injektionen und dessen retrograde Transportgeschwindigkeit beim Hund müssen ermittelt werden, bevor dieser Tracer wieder im Tierexperiment eingesetzt werden kann. Ø FG wurde als 1,8%ige Lösung in das Ellbogengelenk beim Beagle appliziert. Diese Konzentration war wahrscheinlich zu gering, um eine retrograde Markierung der sensiblen Neurone in den entsprechenden Spinalganglienzellen nachzuweisen. Ø Die intraartikuläre Applikation des Neurotoxins OX7-Saporin führte nicht zur selektiven Neurodegeneration. Eine Aussage zur Schmerzausschaltung und symptomatischen Therapie der OA des Hundes mit OX7-Saporin ist deshalb nicht möglich.