Während der letzten Dekade neurobiologischer Forschung wurde deutlich, dass inflammatorische Vorgänge in einem Netwerk nicht-neuronaler und neuronale Zellen wesentlich zur Entstehung und zur Progredienz einiger wichtiger neurodegenerativer Erkrankungen beitragen. Therapeutische Ansätze sollten daher auch auf die Protektion initial überlebender Neurone vor dieser sekundären inflammatorischen Schädigung zielen. Ein wesentlicher Bestandteil dieser sekundären Schädigung besteht aus der Migration von Makrophagen und Mikrogliazellen in die Regionen neuronaler Schädigung, wo sie grosse Mengen an toxischen Zytokinen und Sauerstoffradikalen freisetzen. In einer Makrophagen-ähnlichen Zelllinie, sowie in phagozytierenden Mikrogliazellen wurde eine nukleäres proteolytisches System identifiziert, dass in der Lage war, oxidativ geschädigte Kernproteine zu erkennen und abzubauen. Im Gegensatz zu dem bisherigen Konzept relativer Langlebigkeit der Histonproteine, wurde diese nach oxidativer Schädigung innerhalb von Minuten abgebaut und vom Chromatin entfernt. Dieser schnelle Abbau war von der nicht-kovalenten Interaktion der automodifizierten Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1) mit dem 20S Proteasom abhängig. Die PARP-1 wurde somit als ein Signalmolekül zwischen dem Chromatinschaden und der Einleitung einer protektiven Zellantwort charakterisiert, die Mikrogliazellen das Überleben ihres eigenen Aktivierungszustandes ermöglicht. Es zeigte sich, dass dieses PARP-Proteasom-System in Abhängigkeit vom Differenzierungsgrad Makrophagen-ähnlicher Zellen abhängig ist und auch funktionell in die Chemotherapieresistenz humaner Leukämiezellen involviert ist. Darüberhinaus regulierte die PARP-1 auch die Expression des Integrins CD11a durch Interaktion mit dem translozierten NF-kappaB und HMG-I(Y) und dadurch die Migration von Mikrogliazellen zum Ort der neuronalen Schädigung. Diese Ergebnisse machem die PARP-1 zu einem potentiellen Ziel therapeutischer Interventionen zur Verhinderung der destruktiven Migration von Mikrogliazellen, womit eine Protektion initial überlebender Neurone vor weiterer inflammatorischer Schädigung erreicht werden könnte. / During the last decade of neurobiological research, it became clear that inflammatory pathways in the CNS, involving a network of non-neuronal and neuronal cells, are contributing mainly to the onset and progress of several major neurodegenerative diseases. Therapeutic approaches must therefore focus on the protection of initially surviving neurons from this secondary inflammatory damage. One major component of secondary neuronal damage is the migration of macrophages and microglia cells towards the sites of injury where they produce large amounts of toxic cytokines and oxygen radicals. In a macrophage-like cell line and in phagocytosing microglial cells a nuclear proteolytic system was identified, which was able to recognize and degrade oxidatively-damaged nuclear proteins, in particular histones. In contrast to the previous concept of relatively long-living histone proteins, they are rapidly degraded and removed from the chromatin within minutes after oxidative damage. This rapid degradation was dependent on the non-covalent interaction of the 20S proteasome with the automodified poly(ADP-ribose)-polymerase-1 (PARP-1). Therefore, the PARP-1 has been identified as a signal molecule between the detection of a chromatin-damage and a protective cellular response, which enables microglial cells to survive their own activation state. The regulation of this PARP-proteasome-system depends on the differentiation state of macrophage-like cells and is also functionally involved in the chemotherapy-resistance of human leukemia cells. Moreover, PARP-1 regulates the expression of the integrin CD11a by interaction with the translocated NF-kappaB and HMG-I(Y) and therefore microglia migration towards the sites of neuronal injury. These findings renders the PARP as potential target for therapeutic interventions to inhibit destructive microglial migration and therefore to protect initially surviving neurons from inflammatory damage.

Autosomal recessive triple A syndrome is caused by mutations in the AAAS gene encoding the protein ALADIN. The disorder manifests with the triad of adrenocorticotropin-resistant adrenal insufficiency, achalasia of the stomach cardia and impaired tear production (alacrima) in combination with progressive neurological impairment of the central, peripheral and autonomic nervous systems. ALADIN is part of the nuclear pore complex acting as a scaffold nucleoporin. In this work the role of ALADIN in the human adrenocortical tumour cell line NCI-H295R1 was investigated. These cells were engineered to either over-express or down-regulate AAAS by inducible stable transfection. Alterations in steroidogenic gene expression and functional consequences were determined. In addition, the role of ALADIN on cell viability and oxidative stress response was analysed. Using both the human adrenal NCI-H295R1-TR AAAS knock-down and over-expression models the potential impairment of the nuclear import of aprataxin, DNA ligase 1 and ferritin heavy chain 1 was investigated. For this YFP-specific vectors transiently transfected into the cell lines were employed. The findings indicate that AAAS knock-down induces a down-regulation of genes coding for type II microsomal cytochrome P450 hydroxylases CYP17A1 and CYP21A2 and their electron donor enzyme cytochrome P450 oxidoreductase, thereby decreasing biosynthesis of precursor metabolites required for glucocorticoid and androgen production. Furthermore I demonstrate that ALADIN deficiency leads to increased susceptibility to oxidative stress and alteration in redox homeostasis after paraquat treatment. Finally, I show significantly impaired nuclear import of DNA ligase 1, aprataxin and ferritin heavy chain 1 in ALADIN knock-down cells. I conclude that down-regulating ALADIN results in decreased oxidative stress response leading to alteration in steroidogenesis, highlighting the knock-down cell model as an important in vitro tool for studying the adrenal phenotype in triple A syndrome. In an approach to identify new interaction partners of ALADIN, co-immunoprecipitation followed by proteome analyses using mass spectrometry was conducted in a GFP-ALADIN over-expression model using the human adrenocortical tumor cell line NCI-H295R. These results were verified in co-immunoprecipitation assays of endogenous ALADIN using NCI-H295R wild-type cells. The results suggest a possible interaction between ALADIN and microsomal flavoprotein cytochrome P450 oxidoreductase and progesterone receptor membrane compartment 2. Co-localisation analyses of these findings were done using immunofluorescence. The data are suggestive for an involvement of ALADIN in the export of nuclear-encoded mitochondrial proteins. Regulation of adrenocortical steroidogenesis is complex and there is increasing evidence that oxidative stress due to ROS accumulation and mitochondria are significantly involved. Furthermore, there may be an important cross-talk between functional organelles comprising nucleus, ER and mitochondria which presumably involves lipid metabolism. The goal of this work was to elucidate the function of ALADIN for the cellular oxidative stress response and its possible consequences for adrenocortical steroidogenesis in triple A syndrome patients. / Mutationen im AAAS Gen verursachen die autosomal rezessive Krankheit Triple-A-Syndrom. AAAS kodiert das Nukleoporin ALADIN, welches Bestandteil des nukleären Porenkomplexes ist. Phänotypische Charakteristika des Triple-A-Syndroms sind Nebennierenrinden-Insuffizienz, Achalasie des unteren Speiseröhrenschließmuskels und eine fehlende Tränenproduktion (Alakrimie). Diese Symptome sind kombiniert mit progredienten neurologischen Störungen des zentralen, peripheren und autonomen Nervensystems. In dieser Arbeit wurde die Rolle von ALADIN in der humanen Karzinom-Zelllinie NCI-H295R1 untersucht. Diese Nebennierenrinden-Zellen wurden stabil transfiziert und mit einem induzierbaren Expressionssystem modifiziert, so dass sie AAAS entweder überexprimierten oder herunterregulierten. In NCI-H295R1-Zellen wurden Veränderungen der Genexpression von Enzymen der Steroidogenese und funktionelle Konsequenzen der Überexpression oder Herunterregulation von ALADIN gemessen. Des Weiteren wurde die Rolle von ALADIN auf die Zellviabilität und die Redox-Homöostase analysiert. ALADIN überexprimierende und herunterregulierte Zellen wurden verwendet, um die potentielle Behinderung des nukleären Imports von Proteinen zu untersuchen, welche den Zellkern gegen oxidativen Stress schützen (z.B. Aprataxin, DNA-Ligase 1 und Ferritin Heavy Chain 1). Dazu wurden YFP-spezifische Vektoren transient in diese Zellen gebracht. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Herunterregulation von AAAS eine Verminderung der Genexpression von CYP17A1 und CYP21A2 und deren Elektronendonor Cytochrom P450 Oxidoreduktase bewirken. Die Biosynthese der Vorläufermetabolite von Kortisol und Aldosteron ist in diesen Zellen ebenfalls vermindert. Des Weiteren zeigen die ALADIN-defizienten NCIH295R1-Zellen eine erhöhte Sensitivität gegenüber oxidativem Stress und eine veränderte Redox-Homöostase nach der Behandlung mit Paraquat. Darüber hinaus konnte in dieser Studie auch gezeigt werden, dass herunterregulierte ALADIN NCI-H295R1-Zellen einen verminderten Zellkernimport von Aprataxin, DNA-Ligase 1 und Ferritin heavy chain 1 besitzen. Aus diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass ALADIN-defiziente Nebennierenzellen eine verminderte Stressantwort auf oxidativen Stress besitzen; dies führt schlussendlich zu einer veränderten Steroidogenese. Das beschriebene ALADIN knock-down Modell in NCI-H295R1-Zellen ist ein wichtiges in vitro Werkzeug, um die Pathogenese der Nebennierenveränderungen im Triple-A-Syndrom zu erforschen. Neue Interaktionspartner von ALADIN wurden mit Hilfe von Co-Immunpräzipitation gefolgt von Proteom-Analysen durch Massenspektrometrie in einem GFP-ALADIN Überexpressionsmodell in NCI-H295R charakterisiert. Die Ergebnisse wurden durch Experimente auf endogenem Niveau in NCI-H295R-Wildtypzellen verifiziert. Mit diesen Daten wird in dieser Arbeit erstmals eine Interaktion zwischen ALADIN und dem Flavoprotein Cytochrom P450 Oxidoreduktase und Progesterone Receptor Membrane Compartment 2 nachgewiesen. Diese Ergebnisse wurden mit Co-Lokalisierungsanalysen durch Immunfluoreszenzfärbung von ALADIN und Cytochrome P450 Oxidoreduktase ergänzt. Außerdem gibt die Arbeit Hinweise darauf, dass ALADIN als Nukleoporin an dem nuklearen Export mitochondrialer Vorläuferproteine beteiligt ist. Die Regulation der Steroidogenese in der Nebennierenrinde ist komplex und es existieren zahlreiche Hinweise darauf, dass oxidativer Stress aufgrund der Ansammlung reaktiver Sauerstoffradikale und. dass die Mitochondrien involviert sind. Außerdem ist ein funktionelles Zusammenspiel verschiedener Organellen, darunter Nukleus, ER und Mitochondrien, von großer Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung der Funktion von ALADIN in der zellulären oxidativen Stressantwort und die möglichen Konsequenzen für die Steroidogenese in der Nebennierenrinden in Triple-A-Syndrom-Patienten.

Autosomal recessive triple A syndrome is caused by mutations in the AAAS gene encoding the protein ALADIN. The disorder manifests with the triad of adrenocorticotropin-resistant adrenal insufficiency, achalasia of the stomach cardia and impaired tear production (alacrima) in combination with progressive neurological impairment of the central, peripheral and autonomic nervous systems. ALADIN is part of the nuclear pore complex acting as a scaffold nucleoporin. In this work the role of ALADIN in the human adrenocortical tumour cell line NCI-H295R1 was investigated. These cells were engineered to either over-express or down-regulate AAAS by inducible stable transfection. Alterations in steroidogenic gene expression and functional consequences were determined. In addition, the role of ALADIN on cell viability and oxidative stress response was analysed. Using both the human adrenal NCI-H295R1-TR AAAS knock-down and over-expression models the potential impairment of the nuclear import of aprataxin, DNA ligase 1 and ferritin heavy chain 1 was investigated. For this YFP-specific vectors transiently transfected into the cell lines were employed. The findings indicate that AAAS knock-down induces a down-regulation of genes coding for type II microsomal cytochrome P450 hydroxylases CYP17A1 and CYP21A2 and their electron donor enzyme cytochrome P450 oxidoreductase, thereby decreasing biosynthesis of precursor metabolites required for glucocorticoid and androgen production. Furthermore I demonstrate that ALADIN deficiency leads to increased susceptibility to oxidative stress and alteration in redox homeostasis after paraquat treatment. Finally, I show significantly impaired nuclear import of DNA ligase 1, aprataxin and ferritin heavy chain 1 in ALADIN knock-down cells. I conclude that down-regulating ALADIN results in decreased oxidative stress response leading to alteration in steroidogenesis, highlighting the knock-down cell model as an important in vitro tool for studying the adrenal phenotype in triple A syndrome. In an approach to identify new interaction partners of ALADIN, co-immunoprecipitation followed by proteome analyses using mass spectrometry was conducted in a GFP-ALADIN over-expression model using the human adrenocortical tumor cell line NCI-H295R. These results were verified in co-immunoprecipitation assays of endogenous ALADIN using NCI-H295R wild-type cells. The results suggest a possible interaction between ALADIN and microsomal flavoprotein cytochrome P450 oxidoreductase and progesterone receptor membrane compartment 2. Co-localisation analyses of these findings were done using immunofluorescence. The data are suggestive for an involvement of ALADIN in the export of nuclear-encoded mitochondrial proteins. Regulation of adrenocortical steroidogenesis is complex and there is increasing evidence that oxidative stress due to ROS accumulation and mitochondria are significantly involved. Furthermore, there may be an important cross-talk between functional organelles comprising nucleus, ER and mitochondria which presumably involves lipid metabolism. The goal of this work was to elucidate the function of ALADIN for the cellular oxidative stress response and its possible consequences for adrenocortical steroidogenesis in triple A syndrome patients. / Mutationen im AAAS Gen verursachen die autosomal rezessive Krankheit Triple-A-Syndrom. AAAS kodiert das Nukleoporin ALADIN, welches Bestandteil des nukleären Porenkomplexes ist. Phänotypische Charakteristika des Triple-A-Syndroms sind Nebennierenrinden-Insuffizienz, Achalasie des unteren Speiseröhrenschließmuskels und eine fehlende Tränenproduktion (Alakrimie). Diese Symptome sind kombiniert mit progredienten neurologischen Störungen des zentralen, peripheren und autonomen Nervensystems. In dieser Arbeit wurde die Rolle von ALADIN in der humanen Karzinom-Zelllinie NCI-H295R1 untersucht. Diese Nebennierenrinden-Zellen wurden stabil transfiziert und mit einem induzierbaren Expressionssystem modifiziert, so dass sie AAAS entweder überexprimierten oder herunterregulierten. In NCI-H295R1-Zellen wurden Veränderungen der Genexpression von Enzymen der Steroidogenese und funktionelle Konsequenzen der Überexpression oder Herunterregulation von ALADIN gemessen. Des Weiteren wurde die Rolle von ALADIN auf die Zellviabilität und die Redox-Homöostase analysiert. ALADIN überexprimierende und herunterregulierte Zellen wurden verwendet, um die potentielle Behinderung des nukleären Imports von Proteinen zu untersuchen, welche den Zellkern gegen oxidativen Stress schützen (z.B. Aprataxin, DNA-Ligase 1 und Ferritin Heavy Chain 1). Dazu wurden YFP-spezifische Vektoren transient in diese Zellen gebracht. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Herunterregulation von AAAS eine Verminderung der Genexpression von CYP17A1 und CYP21A2 und deren Elektronendonor Cytochrom P450 Oxidoreduktase bewirken. Die Biosynthese der Vorläufermetabolite von Kortisol und Aldosteron ist in diesen Zellen ebenfalls vermindert. Des Weiteren zeigen die ALADIN-defizienten NCIH295R1-Zellen eine erhöhte Sensitivität gegenüber oxidativem Stress und eine veränderte Redox-Homöostase nach der Behandlung mit Paraquat. Darüber hinaus konnte in dieser Studie auch gezeigt werden, dass herunterregulierte ALADIN NCI-H295R1-Zellen einen verminderten Zellkernimport von Aprataxin, DNA-Ligase 1 und Ferritin heavy chain 1 besitzen. Aus diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass ALADIN-defiziente Nebennierenzellen eine verminderte Stressantwort auf oxidativen Stress besitzen; dies führt schlussendlich zu einer veränderten Steroidogenese. Das beschriebene ALADIN knock-down Modell in NCI-H295R1-Zellen ist ein wichtiges in vitro Werkzeug, um die Pathogenese der Nebennierenveränderungen im Triple-A-Syndrom zu erforschen. Neue Interaktionspartner von ALADIN wurden mit Hilfe von Co-Immunpräzipitation gefolgt von Proteom-Analysen durch Massenspektrometrie in einem GFP-ALADIN Überexpressionsmodell in NCI-H295R charakterisiert. Die Ergebnisse wurden durch Experimente auf endogenem Niveau in NCI-H295R-Wildtypzellen verifiziert. Mit diesen Daten wird in dieser Arbeit erstmals eine Interaktion zwischen ALADIN und dem Flavoprotein Cytochrom P450 Oxidoreduktase und Progesterone Receptor Membrane Compartment 2 nachgewiesen. Diese Ergebnisse wurden mit Co-Lokalisierungsanalysen durch Immunfluoreszenzfärbung von ALADIN und Cytochrome P450 Oxidoreduktase ergänzt. Außerdem gibt die Arbeit Hinweise darauf, dass ALADIN als Nukleoporin an dem nuklearen Export mitochondrialer Vorläuferproteine beteiligt ist. Die Regulation der Steroidogenese in der Nebennierenrinde ist komplex und es existieren zahlreiche Hinweise darauf, dass oxidativer Stress aufgrund der Ansammlung reaktiver Sauerstoffradikale und. dass die Mitochondrien involviert sind. Außerdem ist ein funktionelles Zusammenspiel verschiedener Organellen, darunter Nukleus, ER und Mitochondrien, von großer Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung der Funktion von ALADIN in der zellulären oxidativen Stressantwort und die möglichen Konsequenzen für die Steroidogenese in der Nebennierenrinden in Triple-A-Syndrom-Patienten.

Unfruchtbarkeit stellt heutzutage einen wichtigen Themenschwerpunkt der modernen Medizin dar. Häufig sind es gerade adipöse Frauen, die von Anovulation und Infertilität betroffen sind. Ein Grund hierfür ist der vermehrte oxidative Stress, welcher durch eine erhöhte Aktivität von Lipidperoxidasen, Anstieg der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) sowie frei zirkulierendem, oxidierten Low Densitiy Lipoprotein (oxLDL) verursacht wird. OxLDL wiederum kann über die Bindung an spezielle Scavenger-Rezeptoren, wie Lectin-like oxidierte LDL Rezeptor 1 (LOX-1), Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) und Cluster of Differentiation 36 (CD36), den „programmierten“ Zelltod u. a. von Granulosazellen (GCs) im Ovar induzieren. Damit stellt oxidativer Stress einen wichtigen Ansatzpunkt bei der Frage nach möglichen Therapiekonzepten bei der Infertilität dar. Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss von Antioxidantien auf den oxidativen Status in den Follikelzellen, sowie deren Wirkungsweise auf die oxLDL induzierte Zellschädigung von GCs zu untersuchen. Hierfür wurden die Follikelflüssigkeiten mit den darin enthaltenen GCs von Frauen, welche sich in einer IVF-Therapie befanden, isoliert und verwendet. Als Vertreter der Antioxidantien wurden Resveratrol (RES) und Desferoxamin (DFO) für unsere Untersuchungen genutzt. Die GCs wurden sowohl ausschließlich mit oxLDL als auch in Kombination mit einem der jeweiligen Antioxidantien behandelt. Die Effekte beider Antioxidantien auf die Reproduktion und die ovarielle Funktion ist bis jetzt noch ungeklärt. In unserer Studie konnten wir erstmalig zeigen, dass RES und DFO über unterschiedliche Mechanismen einen protektiven Effekt auf humane GC-Subtypen ausüben. In den in vitro Untersuchungen an humanen GCs konnten wir nachweisen, dass die Behandlung mit RES und DFO die oxLDL induzierte Degeneration verhindert und durch eine Senkung des oxidativen Stresses Schäden sogar präventiv vorbeugt. Dies konnte zum einen über eine stark reduzierte Apoptose-Rate bei gleichzeitiger Induktion einer protektiven Autophagie und damit einer gesteigerten Überlebensrate der oxLDL-behandelten GCs bei simultaner Behandlung mit beiden Antioxidantien gezeigt werden. Auch die Proliferationsrate stieg unter dem Einfluss von RES und DFO in allen 3 GC-Subtypen an. Untersuchungen des Einflusses beider Reagenzien auf Rezeptor-Ebene ergab eine deutlich verminderte Expression der Scavenger Rezeptoren (LOX-1, TLR4, CD36) und des 60-kDa-Hitzeschockproteins (Hsp60) trotz gleichzeitiger Behandlung mit oxLDL. Eine weitere Frage hinsichtlich des Einflusses von RES und DFO auf bekannte oxidative Stressmarker (8-iso-PGF2α, AGEs, Protein-Carbonyl) wurde durch Analysen im Lysat untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hochregulation dieser Marker unter oxidativen Stress durch die Antioxidantien auf „normalem“ Ausgangs-Niveau verblieb. Zusammenfassend konnten wir anhand dieser Ergebnisse demonstrieren, dass sowohl RES als auch DFO den oxidativen Stress in humanen GCs effektvoll senken und damit einen protektiven Effekt auf menschliche GCs in vitro ausüben. Auch konnten wir zeigen, dass die Steroid-Synthese in cytokeratin-positiven (CK+) GCs durch RES mittels einer signifikanten Induktion des Regulierungsproteins Steroidogenic acute regulatory protein (StAR) wiederhergestellt wird. Morita et al. (2012) haben bereits gezeigt, dass RES, u. a. über eine gesteigerte Expression von StAR, eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der Luteinisierung und damit bei der terminalen Differenzierung von GCs spielt. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die Steroidgenese eine wichtige Schlüsselfunktion bei den Überlebensmechanismen der GCs unter oxidativem Stress darstellt. In Zusammenschau der Ergebnisse stellen beide Antioxidantien daher einen potenziellen therapeutischen Ansatzpunkt gegen oxidativen Stress in GCs und damit in der Behandlung der bereits oben genannten zum Teil Adipositas-assoziierten Krankheitsbilder und Infertilitätsproblemen dar. Um diese Hypothese zu unterstützen, wird aktuell an einem Adipositas-induzierten Infertilitäts-Modell an Mäusen gearbeitet, um so die Wirkung von RES und DFO in vivo zu untersuchen. Aufgrund der vielversprechenden protektiven Wirkungen wäre zukünftig dann u. a. der Einsatz beider Substanzen bei der Behandlung von adipösen Frauen in der in vitro Fertilisation (IVF) denkbar. Schlussfolgernd lässt sich hypothetisch annehmen, dass eine frühzeitige, präventive Behandlung mit Antioxidantien Komplikationen vor, während und nach der Schwangerschaft reduzieren und sogar verhindern kann.

Schädigungen im zentralen Nervensystem treten nicht nur bei der Multiplen Sklerose (MS), sondern auch bei einer Vielzahl weiterer entzündlicher Schadensparadigmen auf. Allgemeines Kennzeichen dieser primär wie auch sekundär entzündlichen neurodegenerativen Erkrankungen ist das Auftreten von oxidativem Stress in Verbindung mit einer eingeschränkten Regeneration von Nervenzellen und einem übermäßiges Auftreten von Astrozyten. Allerdings ist bislang nicht bekannt, welche Faktoren für eine frühe neuronale Schädigung verantwortlich sind, und welche Faktoren zu einem übermäßigen Auftreten von Astrozyten beitragen. Vorarbeiten belegten, dass Apoptose-regulierende Systeme, wie z.B. der TRAIL-Signalweg, sowohl an der Immunregulation als auch an Schädigungsprozessen im Gehirn beteiligt sein können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine auf das ZNS beschränkte Blockade des TRAIL-Signalwegs in der EAE, dem Tiermodell der MS, zu einer signifikanten Verminderung des Erkrankungsgrades führte. Darüber hinaus wurde eine reduzierte Enzephalitogenität von TRAIL-defiziente Myelin-spezifischen Lymphozyten belegt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der TRAIL-vermittelte Schädigungsmechanismus die Pathogenese der Neuroinflammation entscheidend mitbestimmt und die immunregulatorische Wirkung eine eher untergeordnete Rolle spielt. Dagegen stellte sich im Tiermodell der bakteriellen Meningitis heraus, dass TRAIL hier eine anti-inflammatorische Rolle im ZNS spielt, die vor allem durch eine TRAIL-R-abhängige apoptotische Minderung der Entzündungsreaktion vermittelt wird. Eine Beeinflussung der Migration von Effektorzellen durch TRAIL konnte in diesem Modell ausgeschlossen werden. Anscheinend hängt die therapeutische Modulation des TRAIL-Systems entscheidend von der jeweils zu Grunde liegenden Ätiopathogenese ab und kann nicht allgemein auf entzündliche ZNS-Erkrankungen übertragen werden. Als mögliche Ursache für eine verminderte Regenerationsfähigkeit endogener Stammzellen konnte hier ein endogener Mechanismus aufgedeckt werden, der als Antwort auf oxidativen Stress zu einem quantitativen Überwiegen von Astrozyten führt. Dabei zeigte sich, dass nicht toxische oxidative Bedingungen das Proliferationsvermögen von neuralen Stammzellen deutlich hemmten und dazu führten, dass anstelle von Neuronen vornehmlich Astrozyten entstehen. Dieses veränderte Differenzierungsvermögen ließ sich sowohl in vitro als auch in vivo experimentell nachvollziehen und wies darauf hin, dass durch milde Entzündungsprozesse hervorgerufene basale metabolische Veränderungen die neuronale und astrogliale Entwicklung aus neuralen Stammzellen reziprok reguliert wird. In weiteren Untersuchungen stellte sich heraus, dass die Histondeacetylase Sirt1 in neuralen Stammzellen als Sensor für das Redox-Potenzial dient. Schon geringe metabolische Änderungen induzierten die Bindung an den bHLH-Transkriptionsfaktor Hes1, die zu einer direkten Modulation des pro-neuronalen Transkriptionsfaktors Mash1 führten und die Differenzierung von neuralen Stammzellen zugunsten der astroglialen Entwicklung beeinflussten. Die Aufklärung dieses Mechanismus könnte somit zukünftig helfen, intrinsische Regenerationsprozesse nach Schädigung des ZNS zu verstärken und damit neue therapeutische Perspektiven bei neurologischen Erkrankungen zu öffnen. / Damage processes of the central nervous system (CNS) are not only found in Multiple sclerosis (MS) even in a variety of inflammatory diseases. A common feature of these inflammatory neurodegenerative disorders is the existence of oxidative stress in combination with a failure of neuronal replenishment and the predominant occurrence of astrocytes (known as astrogliosis). So far, factors, which are responsible for early neuronal damage and overwhelming generation of astrocytes, are not known. Recent studies could show that the tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) might be involved in immunregulation as well as damage processes in the CNS. Here, it could be shown that blockade of TRAIL in the CNS of animals suffering from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) significantly ameliorates the disease. Furthermore, transfer of myelin-specific TRAIL-deficient T cells into wild type recipients lead to a significantly attenuated disease score. These findings underline the contribution of TRAIL to irreversible CNS damage. In the adult mammalian brain, multipotent and self-renewing neural progenitor cells (NPCs) have the capacity to generate new neurons, astrocytes and oligodendrocytes. NPCs may thus serve as a regenerative tool by which brain damage could be compensated. However, repair processes in response to all forms of neuronal injury, be they inflammatory, ischemic, metabolic, traumatic or other, are characterized by the failure of neuronal replenishment and the predominant occurrence of astrocytes. The common molecular pathways underlying this phenomenon are only poorly understood. Here, it could be shown that subtle alterations of the redox state, found in different brain damage scenarios, substantially regulate the fate of murine NPCs via the histone deacetylase silent mating type information regulation 2 homolog 1 (Sirt1). Mild oxidative conditions suppress proliferation of NPCs and direct their differentiation towards the astroglial at the expense of the neuronal lineage (and vice versa). Under oxidative conditions, NPCs upregulate Sirt1 in vitro and in vivo, which then binds to the transcriptional repressor Hes1 and finally downregulates the pro-neuronal basic helix-loop-helix transcription factor Mash1. Furthermore, it could be shown that targeted modulation of Sirt1 activity mimics the effects of subtle redox alterations. The results provide evidence for an as yet unknown metabolic master switch, which determines the fate of NPCs. Targeting these mechanisms may minimize undesired aspects of reactive astrogliosis as well as improve the success of therapeutic neural stem cell implantation.

Die Ätiologie von entzündlichen Pankreaserkrankungen, insbesondere bei den idiopathischen Pankreatitiden, ist weitgehend noch nicht verstanden. In der folgenden Arbeit sollen immunologische und molekularbiologische Aspekte zu Pankreaserkrankungen unter Berücksichtigung eigener Untersuchungen dargestellt werden. Zu Beginn unserer Arbeit haben wir untersucht inwieweit immunologische Veränderungen an der Entstehung einer chronischen Pankreatitis beteiligt sind. Wir fanden eine systemische Aktivierung des zellulären Immunsystems, ohne dass sich Unterschiede zwischen idiopathischer und alkoholtoxischer Pankreatitis ergaben. Im folgenden haben wir uns mit dem molekularbiologischen Hintergrund von entzündlichen und malignen Pankreaserkrankungen beschäftigt. Eine genetische Modellerkrankung ist die hereditäre Pankreatitis, deren genetische Ursache 1996 mit der Entdeckung zweier Mutationen im kationischen Trypsinogen entschlüsselt wurde. Mit der Identifizierung einer neuen Mutation im kationischen Trypsinogen und deren funktionellen Charakterisierung konnten wir hier zum weiteren Verständnis dieser Erkrankung beitragen. Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit dem genetischen Hintergrund bei Patienten mit idiopathischer Pankreatitis. Bei etwa 30% dieser Patienten fanden wir ein abnormales Allel im Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Gen und bei einzelnen Patienten einen Polymorphismus im Serine Proteasen Inhibitor (SPINK1) Gen. Das zunehmende Wissen um genetische Veränderungen und deren Folgen setzt auch eine kritische Auseinandersetzung mit ethischen und rechtlichen Fragen voraus. Daher wurden während einer internationalen Konsensus Konferenz Richtlinien zum Umgang mit diesen Fragen erarbeitet. Die Assoziation von UGT1A7*3 Polymorphismus, welches ein Phase II Protein mit niedriger katalytischer Entgiftungsaktivität im Xenobiotika Stoffwechsel kodiert, mit dem Auftreten von Pankreaserkrankungen war Gegenstand weiterer Untersuchungen. Hierzu untersuchten wir Patienten mit alkoholischer chronischer Pankreatitis, Patienten mit einer SPINK1 Mutation und gesunde Kontrollen. Darüberhinaus betrachteten wir ein Kollektiv von Patienten mit einem Pankreaskarzinom. Unsere Ergebnisse belegen einen synergistischen negativen Effekt von exogenen Risikofaktoren (Alkohol, Nikotin) und genetischer Prädisposition. Die Rolle des oxidativen Stresses in der Genese von Pankreaserkrankungen wird damit untermauert. Erste therapeutische Ansätze aus den gewonnenen Erkenntnisses haben wir in einer prospektiven Studie mit einer immunmodulierenden und antioxidativ wirksamen Glutaminsubstitution bei Patienten mit akuter Pankreatitis gezeigt. Die Glutaminsubstitution führte zu einem besseren Krankheitsverlauf. / The etiology of inflammatory and malignat pancreatic disease are poorly understood. This thesis will discuss our results of immunological and genetic investigations in patients with inflammatory and malignat pancreatic diseases. Especially the background of idiopathic pancreatitis will be discussed. We started our investigations with immunological investigations and demonstrated an evidence for a systemic activated cellular immune system in patients with chronic pancreatitis irrespectively of the aetiology of pancreatitis. Further studies deal with the genetic background of pancreatitis. The discovery of the association between a mutation of the cationic trypsinogen gene and the hereditary pancreatitis was a milestone in the modern pancreatology. We contribute to the understanding of this disease by detecting a new mutation (D22G). We were able to functional characterise this mutation. Mutation of the activation peptides (D22G, K23R) are related to an increased release of trypsin in hydrolisation studies in vitro. In addition, our further investigations confirmed and extended the knowledge of the role of mutation in the CFTR gene and the SPINK 1 gene in patients with 'idiopathic' pancreatitis. Cognisant of the ethical and clinical responsibilities guidelines for the genetic testing and managing of patients with genetic diseases of the pancreas were developed. The low detoxification activity UGT1A7*3 polymorphism has been identified as a novel risk factor of pancreatic inflammatory and malignant diseases defining the interaction of genetic predisposition and environmentally induced oxidative injury. Based on this data we conducted a prospective, randomised clinical trial on the supplementation with glutamine in patients with acute pancreatitis shedulded for total parenteral nutrition. The administration of glutamine, which has been shown to have an immune-modulating and antioxidative capacity, was associated with a favourable clinical course of the patiens receiving glutamine.

Sowohl in Süßwasserseen als auch in marinen Gewässern kommt es immer wieder zu Massenentwicklungen von Cyanobakterien, sogenannten “Blüten”. In Seen werden diese oftmals von Cyanobakterien der Gattung Microcystis dominiert, deren Arten häufig Toxine bilden. Die verbreitesten dieser Toxine sind die leberschädigen Microcystine, die eine Klasse nichtribosomal synthetisierter Peptide darstellen. Nachdem die toxische Wirkung der Microcystine bisher als deren Hauptfunktion angesehen wurde, deuten neuere Forschungsergebnisse darauf hin, dass Microcystine eine andere Primärfunktion für die Produzenten besitzen. Im Rahmen dieser Studie wurde Microvirin (Mvn), ein putatives Lektin aus Microcystis aeruginosa PCC 7806, von dem angnommen wurde, dass es funktional mit Microcystin assoziiert ist, charakterisiert. Zunächst konnte gezeigt werden, dass Mvn tatsächlich zuckerbindende Aktivität besitzt und spezifisch Mannan, ein Oligosaccharid aus Mannoseuntereinheiten, erkennt. Bindestudien zeigten, dass Zucker dieses Typs auf der Zelloberfläche von M. aeruginosa PCC 7806 lokalisiert sind und eine Bindestelle für das sekretierte Mvn darstellen. Mit Hilfe fluoreszenzmikroskopiebasierender Methoden wurde gezeigt, dass sowohl Mvn als auch das korrespondierende Mannanoligosaccharid stammspezifisch sind. Weiterhin konnte durch PCR gezeigt werden, dass das mvn-Gen in allen getesteten Microcystis-Stämmen vorkommt, die auch Gene für die Microcystinbiosynthese besitzen. Eine direkte Interaktion von Microcystin und Mvn konnte in vitro bestätigt werden. Microcystin bindet dabei über seinen N-Methyl-Dehydroalaninrest kovalent an die reduzierten Cysteinreste des Proteins. Ein Einfluss auf die Oligomerisierung des Proteins wurde festgestellt. Microcystin bindet an Cysteinreste von Proteinen, und es konnte gezeigt werden, dass dies besonders unter oxidativen Stressbedingungen geschieht. Die Daten liefern somit weitere Indizien für eine Rolle von Microcystin in der Stressadaptation. / Cyanobacteria frequently appear as so-called “water-blooms” during summer months. Cyanobacteria of the genus Microcystis, whose species often dominate freshwater lakes, produce toxins that represent a potential threat for humans and animals. The most prominent toxins are the non-ribosomally synthesised hepatotoxic microcystins. Toxicity has been considered the main function of these peptides, but recent studies propose different primary functions of microcystins for their producers. The involvement of microcystins in the response to oxidative stress was proposed recently. Within this study the putative lectin microvirin (Mvn), which was suggested to be functionally related to microcystin, was characterised. Initially it was shown that Mvn does indeed possess a carbohydrate binding activity, and specificity for mannan, an oligosaccharide made of mannose subunits, was proven. Binding studies using fluorescence-labelled Mvn and antibodies identified carbohydrates of this type at the cell surface of M. aeruginosa being a binding site for the secreted Mvn. Fluorescence microscopy techniques were employed to show that Mvn as well as the corresponding mannan oligosaccharide are strain-specific. Additionally it was shown by PCR that the mvn gene is present in all tested Microcystis strains possessing microcystin biosynthesis genes. A direct interaction of microcystin and Mvn was confirmed in vitro. Microcystin covalently binds to the reduced cysteine residues of the protein via its N-methyl-dehydroalanine moiety. An impact on the oligomerisation state of Mvn was observed. Microcystin seems to bind cysteine residues in an unspecific manner in vivo, and it was shown that this occurs especially under conditions of oxidative stress such as iron depletion and exposition to high light. Hence, the data provide further evidence for an involvement of microcystins in stress adaptation.

Influence of stress factors on tunneling nanotubes in cultivated human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19). The eye as one of the most important sense organs of the human body is exposed to visible light radiation and other stress factors every day. Especially the retina (of the eye) is a sensible tissue for oxidative damage (Wu et al., 2006). The retinal pigment epithelium (RPE) is an important layer of the retina, which forms the outer layer and phagocytises the shed disc membranes of the photoreceptor outer segments. Furthermore, the RPE is involved in the maintenance of the visual cycle and regulates the retinal balance (Bok, 1993). To maintain those functions, a steady communication between the RPE-cells and the adjacent neighbour cells is necessary. Tunneling nanotubes (TNTs) build a newly discovered variety of cell communication and thus establish intercellular signal transduction and transport different cell components including pathogens (Rustom et al., 2004; Onfelt et al., 2006; Sherer und Mothes, 2008; Veranic et al., 2008). The formation of TNTs in the neuron-like pheochromocytoma cell line PC12 was first reported by Rustom et al in 2004. In the following years a growing number of cell types containing TNTs were described. For example a lot of TNT-reports were found between immune cells (Onfelt et al., 2004; Sowinski et al., 2008). Chinnery et al. first described TNTs in vivo in 2008. Here they found TNTs between dendritic cells in the cornea of the mouse. An important characteristic of TNTs is that they do not attach to the substratum. They contain F-actin as a characteristic feature of there structure (Rustom et al., 2004). Our study group detected the formation of TNTs between ARPE-19-cells, a human retinal pigment epithelial cell line. They contain F-actin, but no microtubules. Further it was observed an exchange of electrical signals, small molecules and even the transfer of organelles between cells via TNTs (see publication Wittig et al., 2012). It is often described in the literature, that TNTs are very sensitive against stress factors, like prolonged light excitation, mechanical and chemical stress, which then can result in rupture of the TNTs (Rustom et al., 2004; Koyanagi et al., 2005; Gurke et al., 2008a; Pontes et al., 2008; Sowinski et al., 2008; Domhan et al., 2011; Wang und Gerdes, 2012). Up to now it is widely unclear how pathological conditions influences TNTs. There are several studies, which report an induction but also an inhibition of TNT-formation by different factors. The reaction of cell-cell-interactions between RPE cells on stress factors is not jet analysed. So our motivation was, to analyse the influence of different stress factors on the number, the morphology and formation of TNTs. ARPE-19-cells were treated with blue light, with a wavelength of 470 and 405 nm, with 3000 μM glyoxal, with 200 μM H2O2, with medium without serum as well as with cytochalasin-D and latrunculin-B. With the help of differential interference contrast (DIC) microscopy the formed TNTs were counted and the morphology was evaluated. A 24 hours cultivation of untreated ARPE-19 cells resulted in 15 TNTs per 100 cells on average. After excitation of the ARPE-19-cells with blue light 470 and 405 nm the number of TNTs decreased 50 % and 28,5 % accordingly in comparison to untreated cells (100 %). Furthermore, the cell culture, which was treated with glyoxal and H2O2 resulted in a reduction of 17,5 % and 53 % TNTs in comparison to the untreated cell culture. Cells which were cultured with serum free medium had an decreased TNT-number of 56.8 % in comparison with serum containing medium. TNTs of untreated ARPE-19-cells have a diameter from 50 to 300 nm (Wittig et al., 2012). Every TNTs, which were formed under named stress factors had the same diameter like untreated cells. In this study an average TNT length of 23 +/- 16 μm was measured between cells without treatment. This correlated with the TNT-lengths of cells which excitated with blue light 405 and 470 nm with 26 +/- 13 μm and 24 +/- 14 μm. In contrast the TNT-lenghts of cells treated with glyoxal and H2O2 with 16 +/- 11 μm and 15 +/- 13 μm were less and from cells cultured without serum with 34 +/- 20 μm were above the average length of TNTs of untreated cells. TNTs of ARPE-19-cells without treatment and TNTs which were treated with stress factors contained F-actin but no microtubules. Depolymerisation of F-actin, induced by addition of cytochalasin-D or latrunculin-B, led to disappearance of TNTs. This is an evidence for the importance of F-actin as an essential component of TNTs between ARPE-19-cells. Under the influence of blue light excitation the TNTs formed as good as untreated cells after contact of migrating cells. Reason for the reduced TNT-formation under stress factors could be explained by the generation of oxidative stress due to reactive oxygen species (ROS). ROS induced under blue light- or glyoxal-treatment as well as H2O2 could influence cell function by inactivation of cell-mediated proteins or induction of F-actin oxidation with subsequent destruction of the actin-network and inhibition of the actin-polymerisation (Chen, 1993; Ballinger et al., 1999; Thornalley et al., 1999; Valen et al., 1999; Dalle-Donne et al., 2002; Nilsson et al., 2003; Shangari und O'Brien, 2004; Zhu et al., 2005; Knels et al. 2008; Roehlecke et al., 2009). The reduced actin-polymerisation as well as the disruption of the TNTs due to changes at the actin-cytoskeleton and at the membranes could explain the reduced TNT-formation (Valen et al., 1999; Dalle-Donne et al., 2002; Reber et al., 2002; Zhu et al., 2005; Knels et al., 2008). The inhibition of the cell growth under oxidative stress conditions and under nutritional deficiency by serum free medium could lead to a reduced TNT-formation too. In this study we found a reduction of TNT-number between ARPE-19-cells under different stress conditions. It is possible, that TNTs are formed between RPE- and photoreceptor-cells in vivo, where they can exchange useful or recyclable materials between cells (Wang et al., 2011; Wittig et al., 2012). Disruption of TNTs by reactive oxygen species could cause a decreased exchange of informations. It is possible, that the cells, RPE- as well as photoreceptor-cells, die due to a deficiency of nutrients. This could be another reason in the formation of age related macular degeneration, which shows a destruction of RPE-cells and secondary of the photoreceptorcells. / Das Auge ist als eines der wichtigsten Sinnesorgane des Menschen täglich sichtbarer Lichtstrahlung und weiteren Stressfaktoren ausgesetzt. Die Netzhaut des Auges ist besonders empfindlich für oxidative Schäden (Wu et al., 2006). Eine bedeutende Schicht der Netzhaut im Auge stellt das retinale Pigmentepithel (RPE) dar, welches die äußere Schicht der Retina bildet und täglich die abgeworfenen Photorezeptoraußensegmentscheiben phagozytiert. Zudem ist das RPE wesentlich am visuellen Prozess sowie der Aufrechterhaltung des retinalen Gleichgewichts beteiligt (Bok, 1993). Um diese Funktionen zu gewährleisten, ist eine ständige Kommunikation zwischen den RPEZellen sowie zu angrenzenden Nachbarzellen innerhalb der Netzhaut notwendig. So ist über Tunneling Nanotubes (TNTs), als neu entdeckte Kommunikationsform, ein interzellulärer Transport von Signalen und verschiedensten Zellkomponenten, aber auch von Pathogenen, möglich (Rustom et al., 2004; Onfelt et al., 2006; Sherer und Mothes, 2008; Veranic et al., 2008). Erstmals 2004 beschrieben Rustom et al. die Bildung von TNTs zwischen Rattennierenzellen in vitro. In den folgenden Jahren kam es zu einer Vielzahl weiterer TNT-Entdeckungen zwischen verschiedensten Zellen in vitro. So findet man zum Beispiel vermehrt TNTBeschreibungen zwischen Immunzellen (Onfelt et al., 2004; Sowinski et al., 2008). Ein erster Nachweis an TNTs in vivo erfolgte 2008 durch die Arbeitsgruppe Chinnery et al.. Hierbei fand man TNTs zwischen dendritischen Zellen in der Mauscornea. Ein wichtiges Merkmal von TNTs ist, dass sie sich als frei im Medium schwebende interzelluläre Verbindungen darstellen, ohne Kontakt zum Substrat zu haben. TNTs sind im Wesentlichen als stabilisierendes Hauptstrukturmerkmal aus Aktin aufgebaut (Rustom et al., 2004). In unserer Arbeitsgruppe wurde die Bildung von TNTs zwischen ARPE-19-Zellen, einer humanen Pigmentepithelzelllinie, entdeckt. Neben dem strukturellen Aufbau aus Aktin, konnte ein Austausch von elektrischen Signalen sowie molekularen Stoffen und der Transport von Organellen (Mitochondrien) durch TNTs zwischen ARPE-19-Zellen nachgewiesen werden (siehe Publikation Wittig et al., 2012). Wie schon mehrfach in der Literatur beschrieben, reagieren TNTs sehr sensibel auf Stressfaktoren, so zum Beispiel auf längere Lichtreizung, mechanischen und chemischen Stress, was jeweils zur Ruptur der Strukturen führen kann (Rustom et al., 2004; Koyanagi et al., 2005; Gurke et al., 2008; Pontes et al., 2008; Sowinski et al., 2008; Domhan et al., 2011; Wang und Gerdes, 2012). Weitgehend unklar ist bisher der Einfluss von pathologischen Bedingungen auf die TNTs. Es gibt mehrere Studien, in denen durch verschiedenste Faktoren über eine Induktion, aber auch über eine Hemmung der TNT-Bildung berichtet wurde. Die Reaktion von Zell-Zell-Interaktionen zwischen RPE-Zellen auf Stressfaktoren wurde bisher in wissenschaftlichen Arbeiten nicht untersucht. Dies nahmen wir zum Anlass, den Einfluss von unterschiedlichen Stressfaktoren auf die Anzahl von TNTs, ihre Morphologie und Bildung zu untersuchen. Es erfolgte eine Behandlung der ARPE-19-Zellen mit Blaulicht in den Wellenlängen 405 und 470 nm, mit 3000 μM Glyoxal, mit 200 μM H2O2, mit serumfreiem Medium sowie mit Cytochalasin D und Latrunculin B. Die gebildeten TNTs wurden anschließend mit Hilfe der Lichtmikroskopie ausgezählt sowie deren Morphologie beurteilt. So bildeten unbehandelte ARPE-19-Zellen nach 24 Stunden Kultivierung im Durchschnitt 15 TNTs pro 100 Zellen aus. Nach 24stündiger Bestrahlung der ARPE-19-Zellen mit Blaulicht 470 nm und 405 nm fiel die TNT-Anzahl auf 50 % und 28,5 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen (100 %). Weiterhin fanden sich in den Glyoxal- und H2O2-behandelten Kulturschalen 17,5 % und 53 % TNTs verglichen mit der unbehandelten Zellkultur. In der serumfreien Kulturschale verringerten sich die TNTs 24 Stunden nach Ausplattierung der Zellen auf 56,8 % im Vergleich zu in Medium mit Serum kultivierten Zellen. TNTs unbehandelter ARPE-19-Zellen besitzen einen Durchmesser von 50 bis 300 nm (Wittig et al., 2012). Alle unter oben genannten Stressfaktoren gebildeten TNTs befanden sich in Hinblick auf ihren Durchmesser im Bereich der TNTs unbehandelter Zellen. Bei TNTs unbehandelter Zellen wurde in dieser Arbeit eine durchschnittliche Länge von 23 +/- 16 μm gemessen. Dies entsprach dem TNT-Längendurchschnitt von mit Blaulicht 405 nm und 470 nm bestrahlter ARPE-19-Zellen mit 26 +/- 13 μm und mit 24 +/- 14 μm. Unter Glyoxal und H2O2 gebildete TNTs lagen im Gegensatz dazu mit 16 +/- 11 μm und 15 +/- 13 μm unterhalb und unter serumfreier Kultivierung mit 34 +/- 20 μm über dem TNTLängendurchschnitt unbehandelter Zellen. Alle TNTs, sowohl unbehandelter als auch mit Stressfaktoren behandelter ARPE-19-Zellen, sind aus Aktin aufgebaut. Jedoch ließ sich kein Tubulin nachweisen. Nach Zugabe von Aktinpolymerisationshemmern waren keine TNTs nachweisbar, was beweist, dass F-Aktin essentieller Bestandteil von TNTs zwischen ARPE-19-Zellen ist. Unter dem Einfluss von Blaulicht 470 und 405 nm bildeten sich die TNTs, wie auch bei unbehandelten Zellen, durch ein Zusammentreffen der Zellen mit anschließendem Auseinandergleiten. Die Ursache für die verminderte Bildung an TNTs unter verschiedenen Stressfaktoren könnte in der Entstehung von oxidativem Stress durch die Ausbildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) begründet sein. So können zum Beispiel die unter Blaulicht- und Glyoxalexposition entstehenden ROS sowie H2O2, als eine Hauptform der ROS, die Zellfunktion durch Inaktivierung zellulärer Proteine beeinflussen sowie eine direkte Oxidation an Aktin hervorrufen mit folglicher Aktinnetzwerkzerstörung und Hemmung der Aktinpolymerisation (Chen, 1993; Ballinger et al., 1999; Thornalley et al., 1999; Valen et al., 1999; Dalle-Donne et al., 2002; Nilsson et al., 2003; Shangari und O'Brien, 2004; Zhu et al., 2005; Knels, Worm et al. 2008; Roehlecke et al., 2009). Die verminderte Aktinpolymerisation, aber auch die Zerreißungen der TNTs durch Veränderungen am Aktinzytoskelett sowie an den Membranen könnten zu einer verringerten TNT-Bildung führen (Valen et al., 1999; Dalle-Donne et al., 2002; Reber et al., 2002; Zhu et al., 2005; Knels et al., 2008). Auch eine Hemmung des Zellwachstums unter oxidativen Stressbedingungen sowie unter Nährstoffmangel durch Serumentzug könnte mit einer verminderten TNT-Bildung einhergehen. Wir haben in unserer Untersuchung gezeigt, dass es durch verschiedene Stresseinflüsse zu einer Reduktion der TNTs zwischen ARPE-19-Zellen kommt. Es ist denkbar, dass solche TNTs in vivo zwischen RPE- und Photorezeptorzellen ausgebildet werden, wo sie nützliches oder recycelbares Material zwischen Zellen austauschen (Wang et al., 2011; Wittig et al., 2012). Bei Zerstörung der TNTs durch zum Beispiel oxidative Faktoren könnte es zu einer Verringerung des Informationsaustausches kommen. Es ist möglich, dass durch die Minderversorgung die Zellen absterben, sowohl RPE- als auch Photorezeptorzellen. Dies könnte ein weiterer möglicher Ursachenansatz in der Entstehung der altersabhängigen Makuladegeneration sein, welche als Erkrankungserscheinung den Untergang der RPEZellen und damit sekundär der Photorezeptorzellen aufweist.

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Mutations in the AAAS gene coding for the nuclear pore complex protein ALADIN lead to the autosomal recessive disorder triple A syndrome. Triple A patients present with a characteristic phenotype including alacrima, achalasia and adrenal insufficiency. Patient fibroblasts show increased levels of oxidative stress, and several in vitro studies have demonstrated that the nucleoporin ALADIN is involved in both the cellular oxidative stress response and adrenal steroidogenesis. It is known that ALADIN knock-out mice lack a phenotype resembling human triple A syndrome. The objective of this study was to determine whether the application of chronic oxidative stress by ingestion of paraquat would generate a triple A-like phenotype in ALADIN null mice. Adult male mice were fed either a paraquat (0.25 g/kg diet) or control diet for 11 days. After application of chronic oxidative stress, ALADIN knock-out mice presented with an unexpected compensated glutathione metabolism, but lacked a phenotype resembling human triple A syndrome. We did not observe increased levels of oxidative stress and alterations in adrenal steroidogenesis in mice depleted for ALADIN. This study stresses the species-specific role of the nucleoporin ALADIN, which in mice involves a novel compensatory mechanism for regulating the cellular glutathione redox response.