Le diabète est une maladie chronique avec une progression alarmante. L’insuline-résistance et la diminution de la masse fonctionnelle des cellules beta, associée à l'inflammation des îlots, sont les principaux défauts impliqués dans la pathogenèse du diabète de type 2 (DT2). La compréhension des mécanismes impliqués dans l'inflammation des îlots pancréatiques, et l'identification de cibles moléculaires à visée anti-inflammatoire, sont des approches intéressantes pour le traitement du diabète. La glycogène synthase kinase 3 (GSK3), est une sérine-thréonine kinase qui régule des fonctions cellulaires essentielles. Cette enzyme a été récemment décrite comme un régulateur important de l'inflammation dans différentes conditions pathologiques. Cependant, l'implication potentielle de GSK3beta dans l'inflammation des îlots au cours du diabète reste inexplorée. Le but de ce travail était d'étudier l'implication de GSK3beta dans l'inflammation des îlots pancréatiques et d'évaluer l'impact de l'inhibition de GSK3beta dans l’amélioration de l’hyperglycémie du rat diabétique Goto-Kakizaki. Le rat Goto-Kakizaki (GK) est un modèle spontané de DT2, avec une hyperglycémie chronique apparaissant au sevrage, une masse beta cellulaire réduite et une altération profonde de la sécrétion d'insuline en réponse au glucose. Peu après le sevrage, l'inflammation se développe dans les îlots du rat GK et participe au dysfonctionnement des cellules beta. Nous avons traité les rat GK mâles avec du chlorure de lithium (LiCl), un inhibiteur de GSK3. Le traitement chronique de jeunes rats GK a permis d’éviter l’installation de l’hyperglycémie chronique qui se développe normalement dans ce modèle chez les adultes. A la fin du traitement, la glycémie basale des rats GK traités par le LiCl était fortement réduite, en comparaison avec celle des rats GK non traités. Ces améliorations étaient associées à une réduction de l'expression des cytokines et des chimiokines pro-inflammatoires dans les îlots. L’inhibition de GSK3 a également diminué la fibrose des îlots et rétabli partiellement la sensibilité à l’insuline et la sécrétion d'insuline induite par le glucose chez les rats GK. De plus, des études ex vivo sur des îlots humains et des îlots de rats Wistar, exposés à un environnement inflammatoire en culture, ont révélé l'implication directe de GSK3 dans la réponse inflammatoire autonome des îlots. Ceci était entre autres associée à l’activation du facteur de transcription STAT3. En conclusion, nous montrons pour la première fois que GSK3beta est impliquée dans l’inflammation des îlots pancréatiques humains et de rongeurs. L’inhibition de GSK3beta atténue fortement l’inflammation insulaire, et prévient l’installation de l’hyperglycémie chronique chez le rat GK. L’ensemble des résultats de ce travail nous permet de proposer GSK3beta comme une cible potentielle pour le développement de traitements anti-inflammatoires dans le contexte du diabète de type 2 / Diabetes Mellitus (DM) is a chronic disabling disease with epidemic dimension. It is now established that islet inflammation is associated with defective functional beta cell mass in type 2 diabetes. The understanding of the mechanisms that govern diabetes-associated inflammation in pancreatic islets, and the identification of molecular targets to dampen inflammation are important steps to address this pathological condition. GK rat is a spontaneous model of type 2 diabetes with impaired beta cell function and mass, closely associated with islet inflammation. Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3) is a multi-tasking serine-threonine kinase which regulates crucial cellular functions. In recent years, GSK3beta has been found to be an important regulator of inflammation in different diseased conditions. However, the potential role of GSK3beta in the context of islet inflammation remains unexplored. In this study, we tested the potential of lithium, an inhibitor of GSK3, in improving islet inflammation and glucose metabolism in the GK rat. In vivo, treatment of young GK rats prevented the development of overt diabetes which normally occurs in adult individuals. Lithium improved the glycemic status of the GK rats after few weeks of treatment. At the end of the protocol, GK rats treated with lithium had a blood glucose levels that were significantly lower than that of age-matched untreated GK rats, which were overtly diabetic at this stage. Lithium treatment resulted in reduced expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines, decreased fibrosis and reduced macrophage infiltration in the islets. Lithium partially restored the pancreatic insulin content, the insulin sensitivity and the glucose induced insulin secretion in the GK rats. Moreover, ex vivo studies in non-diabetic human and rat islets exposed to inflammatory environment in culture, revealed the direct implication of GSK3 in the islet autonomous inflammatory response. Moreover, we showed that GSK3 controls the islet inflammatory response at least in part by regulating the activity of the pro-inflammatory transcription factor STAT3. Taken together, our results identified GSK3 as a viable target to treat diabetes-associated inflammation, and could have potential clinical application in the treatment of diabetes and metabolic syndrome

La fonction endocrine du pancréas est essentielle pour l'homéostasie du glucose parce que les îlots pancréatiques contiennent le seul type des cellules endocrines, nommées cellules bêta, qui sont capable de produire et sécréter de l’insuline. Le facteur de transcription RFX6, maintenu dans toutes les cellules endocrines matures, est essentiel pour le développement, l'identité et la fonction des cellules bêta. Chez l'homme, des mutations de RFX6 causent le syndrome de Mitchell-Riley, un trouble du développement caractérisé par un diabète néonatal et des malformations du système gastro-intestinal. La recherche des cibles de RFX6 dans les îlots murins a révélé que le facteur de transcription Mlxipl est directement régulé par RFX6. Dans cette thèse, nous avons étudié le mécanisme de la régulation transcriptionnelle de Mlxipl par RFX6 ainsi que les rôles de RFX6 et MLXIPL dans les cellules bêta adultes. Nous avons démontré que RFX6 se lie au premier intron de Mlxipl qui contient un motif de liaison (xbox) critique, et nous avons identifié les cofacteurs de ce processus. En comparant l’effet de la répression de Rfx6 et Mlxipl dans des milieux riches ou faibles en glucose dans la lignée cellulaire bêta Ins-1 832/13 sur le transcriptome, nous avons déterminé les programmes génétiques contrôlés par RFX6 et MLXIPL. / Pancreatic endocrine function is critical for glucose homeostasis because pancreatic islets contain the only cells of the body, the beta cells, capable of producing and secreting insulin. The transcription factor RFX6 is maintained in all mature islet cells and is as an essential regulator of beta cell development, identity and function. In humans, RFX6 mutations cause Mitchell-Riley syndrome, a developmental disorder characterized by neonatal diabetes and malformations of the digestive tract. The search for RFX6 targets in murine islets revealed that the transcription factor Mlxipl is directly regulated by RFX6. In this thesis, we investigated the mechanism of Mlxipl transcriptional regulation by RFX6, and the respective roles of RFX6 and its downstream target MLXIPL in adult beta cells. We demonstrated that RFX6 binds to the first intron of Mlxipl that contains a critical RFX binding motif (xbox), and we identified cofactors of this process. By comparing the changes in the transcriptomes linked to the loss of RFX6 or MLXIPL in the pancreatic beta cell line Ins-1 832/13 and the glucose level, we determined the genetic programs controlled by RFX6 and MLXIPL.

Implication du PTP dans la mort cellulaire β pancréatique L'hyperglycémie, l'hyperfructosémie et l'ischémie-reperfusion sont délétères pour la viabilité cellulaire β pancréatique, jouant un rôle majeur dans la perte de la masse cellulaire β. Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (PTP) est un canal mitochondrial impliqué dans le déclenchement de la mort cellulaire. Des données récentes montrent l'implication du PTP et du stress oxydant dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur cardiomyocytes et également dans la glucotoxicité induite sur cellules endothéliales. La première partie de notre étude a visé à étudier l'implication de l'ouverture du PTP dans la mort cellulaire des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains soumis à de fortes concentrations de glucose et de fructose. Nous démontrons que l'incubation des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains en présence de 30 mM de glucose ou 2,5 mM de fructose déclenche une ouverture du PTP et induit la mort cellulaire. La metformine et la Cyclosporine A (CsA) préviennent l'ouverture du PTP et la mort cellulaire induite par le glucose et le fructose. La deuxième partie de notre travail montre que l'exposition des INS-1 à une heure de carence en substrat concomitante d'une hypoxie, suivie d'une restauration des conditions basales conduit à l'ouverture du PTP et à une majoration drastique de la mort cellulaire. Ces deux évènements sont totalement prévenus par l'incubation préalable par la CsA et la metformine mais aussi par la N-Acétyl-Cystéine (NAC) ou par l'exposition à une anoxie, soulignant ainsi le rôle fondamental du stress oxydant dans le déclenchement de l'ouverture du PTP et de la mort cellulaire. Nous montrons qu'au cours de l'ischémie-reperfusion simulée, la production de superoxide est bi-phasique : nous décrivons un premier pic de production au cours de la carence en substrat, lié à un flux reverse d'électrons au sein du complexe I de la chaîne respiratoire. Ce premier pic est suivi d'un deuxième pic de production après la restauration du niveau de substrats et d'O2, lié à l'ouverture du PTP. La NAC, l'anoxie ou la metformine préviennent les deux pics de production de superoxide tandis que la CsA prévient seulement le second pic. Enfin, nous montrons que l'hypoxie seule n'induit ni stress oxydant, ni ouverture du PTP ni mortalité cellulaire. L'ensemble de notre travail démontre le rôle central du PTP dans la gluco-fructotoxicité et dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur la cellule β pancréatique. Ainsi, prévenir l'ouverture du PTP peut-être une approche intéressante pour préserver la viabilité cellulaire β.

Cette thèse présente les adaptations spécifiques des hibernants ‘food-storing’ qui s’alimentent au cours de l’hibernation, et les conséquences de la qualité du régime alimentaire sur leur cycle annuel. Tandis que les espèces ‘fat-storing’ jeûnent pendant toute l’hibernation, les ‘food-storing’ alternent jeûnes courts et réalimentations. L’adiponectine stimulerait la lipolyse pendant l’hibernation contribuant ainsi à la cétogenèse. Le maintien d’un système digestif fonctionnel conduisant à la sécrétion d’incrétines, permet l’absorption optimale de nutriments lors des courtes euthermies inter-torpeurs. Une absorption accrue de glucose en particulier permettrait de restaurer la glycémie et les réserves de glycogène. Par ailleurs, un régime appauvri en protéines et enrichi en lipides induit un engraissement augmenté en période pré-hibernatoire provoquant une moindre utilisation de la torpeur donc une perte de masse accrue lors de l’hibernation, et une baisse du succès reproducteur. / This thesis presents the specific adaptations of food-storing hibernators that feed during hibernation, and the impact of diet quality on their annual cycle. In contrast to the fat-Storing species which fast during hibernation, the food-storing presents metabolic responses to an alternation of short fasting phases and hyperphagia. These responses involve one hand use of fat reserves during hibernation contributing to ketogenesis, which would be induced by adiponectin. On the other hand, maintaining a functional digestive system leading to the secretion of incretins, permits optimal nutrient absorption in the short inter-torpor euthermia. Increased glucose uptake in particular would restore body reserves to spare. Moreover, a lean protein diet enriched in fat and induces increased in body mass in pre-hibernation period causing reduced use of torpor thus an increased loss of mass during hibernation, and decreased reproductive success.

ABSTRACTThe prevalence of diabetes is increasing dramatically, incurring a major health and socioeconomic burden. Type 2 diabetes (T2D), the most prevalent form of diabetes, results from a variable combination of insulin resistance and insulin deficiency, secondary to pancreatic β-cell failure. These defects are caused by a complex interplay between genetic and environmental/ lifestyle factors. Among the latter, poor dietary quality is a crucial driver of T2D development. Although adopting healthy dietary habits is considered as a mainstay for T2D prevention, what constitutes a healthy diet remains controversial. Epidemiological studies examining the association of dietary fat quality with T2D incidence have yielded equivocal results and may suffer from confounding. On the other hand, randomized trials assessing the impact of dietary fat saturation on glucose homeostasis have major methodological shortcomings, precluding reliable conclusions. In order to elucidate this question, we compared the effects of palm oil vs olive oil on glucose homeostasis and other relevant metabolic parameters, in a mouse model of high-fat diet-induced obesity. The saturated fatty acid-rich palm oil is the most abundantly used oil worldwide. Olive oil is a staple food of the Mediterranean diet, rich in monounsaturated fatty acids and widely regarded as healthful. In this model, palm oil was not more harmful than olive oil with regard to glucose/insulin homeostasis. However, palm oil was associated with increased visceral adiposity and triglyceridemia compared to olive oil. Circulating and tissue free fatty acid (FFA) concentration and composition are determined by dietary factors, as well as genetic and metabolic factors. There is accumulating evidence indicating that increased FFA levels and/or an unbalanced FFA composition with excess palmitate, induce β-cell dysfunction and apoptosis (lipotoxicity). To characterize the mechanisms underlying lipotoxicity, we combined RNA-sequencing with proteomics of β-cells exposed to palmitate, the most prevalent SFA in humans. This cross-omics study showed that palmitate altered lipid and amino-acid metabolism, and affected amplifying pathways of insulin secretion and exocytosis. Furthermore, palmitate induced stress pathways, including mitochondrial dysfunction, oxidative stress and endoplasmic reticulum (ER) stress. ER stress is triggered when protein folding demand exceeds ER folding capacity. This response aims to restore ER homeostasis but if unresolved, it can become deleterious. Islets from T2D patients display signs of ER stress, pointing to a potentially pathogenic role of the latter.Monogenic and neonatal diabetes are rare forms of diabetes caused by single gene mutations. These forms are of particular interest, as they can serve as ‘human knockout’ models of diabetes. Recent evidence shows that there is overlap in the genetic basis of monogenic diabetes and T2D, suggesting that they may be part of a pathologic continuum. To explore the role of ER stress in diabetes pathogenesis, we studied two different genetic syndromes involving neonatal or early-onset diabetes, caused by mutations in genes related to ER function (DNAJC3 and YIPF5). Using in vitro knockdown models, we showed that ER stress elicited by impaired chaperone function (DNAJC3) or by impaired ER-to-Golgi protein transport (YIFP5) causes β-cell apoptosis. Altogether, our findings support that lipotoxic and genetic ER stress contribute to diabetes pathogenesis. Preventing or modulating ER stress thus holds anti-diabetic therapeutic potential. Future research should focus on defining optimal strategies to restore a balanced FFA profile and enhance ER function, aiming to prevent ER-stress induced β-cell failure. RésuméLa prévalence du diabète progresse constamment, posant un défi sanitaire et socioéconomique majeur. Le diabète de type 2 (DT2), la forme la plus courante de diabète, résulte de la résistance à l’insuline, en association avec un déficit insulinique dû à la défaillance des cellules β pancréatiques. Ces anomalies découlent d’une interaction complexe entre des facteurs génétiques et des facteurs liés au mode de vie. Parmi ces derniers, la qualité du régime alimentaire est un facteur crucial pour le développement du DT2. Bien que le suivi d’un régime alimentaire sain est considéré comme le pilier pour la prévention du DT2, ce qui constitue un régime sain demeure un sujet de controverse.Les études épidémiologiques examinant l’association entre la qualité de la graisse alimentaire et l’incidence du DT2 ont donné des résultats équivoques, affectés éventuellement par des facteurs confondants. En outre, les études randomisées évaluant l’impact du degré de saturation de la graisse alimentaire sur l’homéostasie du glucose comportent des limitations méthodologiques majeures. Afin d’élucider cette question, on a comparé les effets de l’huile de palme aux effets de l’huile d’olive sur l’homéostasie du glucose et d’autres paramètres métaboliques pertinents. Dans ce but, on a utilisé un modèle murin d’obésité induite par un régime riche en graisse. L’huile de palme est riche en acides gras saturés et elle est l’huile la plus utilisée globalement. L’huile d’olive est un aliment phare du régime Méditerranéen, riche en acides gras monoinsaturés et généralement reconnu comme un aliment sain. Dans notre modèle murin, la consommation d’huile de palme n’était pas plus néfaste que celle de l’huile d’olive sur l’homéostasie du glucose, la sensibilité à l’insuline et l’insulinosécrétion. Par contre, l’huile de palme était associée à une adiposité viscérale et une triglycéridémie plus élevée comparée à l’huile d’olive.La concentration et la composition des acides gras libres (AGL) sont déterminées par des facteurs alimentaires, génétiques et métaboliques. Des données abondantes démontrent que la présence des niveaux élevés d’AGL et/ou d’une composition déséquilibrée d’AGL induit la dysfonction et l’apoptose des cellules β (lipotoxicité). Pour caractériser les mécanismes sous-jacents de la lipotoxicité, on a combiné un séquençage ARN à une étude protéomique des cellules β exposées au palmitate, l’AGL saturé le plus courant chez l’homme. Cette étude conjointe a montré que le palmitate altère le métabolisme des lipides et des acides aminés, les voies d’amplification de la sécrétion d’insuline et l’exocytose. Le palmitate induit également des voies de stress cellulaires, telles que la dysfonction mitochondriale, le stress oxydatif et le stress du réticulum endoplasmique (RE). Le stress du RE est activé quand les besoins en sécrétion protéique dépassent les capacités de l’organite. Cette réponse a pour but de rétablir l’homéostasie du RE mais si le stress reste non résolu, ceci peut s’avérer délétère. Des îlots des patients avec un DT2 montrent des signes de stress du RE, évoquant un rôle potentiellement pathogénique de ce dernier.Le diabète monogénique et néonatal sont des formes rares de diabète causées par des mutations d’un seul gène. Ces formes sont particulièrement intéressantes sur le plan physiopathologique car elles représentent des ‘knockout’ humains. Des données récentes montrent que la base génétique du diabète monogénique n’est pas complètement distincte de celle du diabète de type 2 et les deux entités pourraient faire partie d’un continuum. Afin d’explorer le rôle du stress du RE dans la pathogénèse du diabète, on a étudié deux syndromes génétiques entraînant un diabète néonatal ou à début très précoce. Ces syndromes sont causés par des mutations dans des gènes impliqués dans la fonction du RE (DNAJC3 et YIPF5). En silençant ces gènes in vitro, on a montré que le stress du RE, déclenché soit par une dysfonction des chaperones (DNAJC3), soit par un retard du trafic de protéines du RE vers le Golgi (YIPF5), induit l’apoptose des cellules β.Ces résultats suggèrent que le stress du RE génétique et lipotoxique contribuent à la pathogénèse du diabète. La prévention ou modulation du stress du RE présente donc un potentiel thérapeutique anti-diabétique. Des études futures pourraient permettre de définir des stratégies optimales pour rétablir un profil d’AGL équilibré ou renforcer la fonction du RE, en vue de prévenir la défaillance des cellules β. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le diabète est une maladie chronique de l’homéostasie du glucose caractérisée par une hyperglycémie non contrôlée qui est le résultat d’une défaillance de la sécrétion d’insuline en combinaison ou non avec une altération de l’action de l’insuline. La surnutrition et le manque d’activité physique chez des individus qui ont des prédispositions génétiques donnent lieu à la résistance à l’insuline. Pendant cette période dite de compensation où la concentration d’acides gras plasmatiques est élevée, l’hyperinsulinémie compense pleinement pour la résistance à l’insuline des tissus cibles et la glycémie est normale. Le métabolisme du glucose par la cellule pancréatique bêta entraîne la sécrétion d’insuline. Selon le modèle classique de la sécrétion d’insuline induite par le glucose, l’augmentation du ratio ATP/ADP résultant de la glycolyse et de l’oxydation du glucose, induit la fermeture des canaux KATP-dépendant modifiant ainsi le potentiel membranaire suivi d’un influx de Ca2+. Cet influx de Ca2+ permet l’exocytose des granules de sécrétion contenant l’insuline. Plusieurs nutriments comme les acides gras sont capables de potentialiser la sécrétion d’insuline. Cependant, le modèle classique ne permet pas d’expliquer cette potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Pour expliquer l’effet potentialisateur des acides gras, notre laboratoire a proposé un modèle complémentaire où le malonyl-CoA dérivé du métabolisme anaplérotique du glucose inhibe la carnitine palmitoyltransférase-1, l’enzyme qui constitue l’étape limitante de l’oxydation des acides gras favorisant ainsi leur estérification et donc la formation de dérivés lipidiques signalétiques. Le modèle anaplérotique/lipidique de la sécrétion d'insuline induite par le glucose prédit que le malonyl-CoA dérivé du métabolisme du glucose inhibe la bêta-oxydation des acides gras et augmente la disponibilité des acyl-CoA ou des acides gras non-estérifiés. Les molécules lipidiques agissant comme facteurs de couplage du métabolisme des acides gras à l'exocytose d'insuline sont encore inconnus. Des travaux réalisés par notre laboratoire ont démontré qu’en augmentant la répartition des acides gras vers la bêta-oxydation, la sécrétion d’insuline induite par le glucose était réduite suggérant qu’un des dérivés de l’estérification des acides gras est important pour la potentialisation sur la sécrétion d’insuline. En effet, à des concentrations élevées de glucose, les acides gras peuvent être estérifiés d’abord en acide lysophosphatidique (LPA), en acide phosphatidique (PA) et en diacylglycérol (DAG) et subséquemment en triglycérides (TG). La présente étude a établi l’importance relative du processus d’estérification des acides gras dans la production de facteurs potentialisant la sécrétion d’insuline. Nous avions émis l’hypothèse que des molécules dérivées des processus d’estérification des acides gras (ex : l’acide lysophosphatidique (LPA) et le diacylglycerol (DAG)) agissent comme signaux métaboliques et sont responsables de la modulation de la sécrétion d’insuline en présence d’acides gras. Afin de vérifier celle-ci, nous avons modifié le niveau d’expression des enzymes clés contrôlant le processus d’estérification par des approches de biologie moléculaire afin de changer la répartition des acides gras dans la cellule bêta. L’expression des différents isoformes de la glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT), qui catalyse la première étape d’estérification des acides gras a été augmenté et inhibé. Les effets de la modulation de l’expression des isoenzymes de GPAT sur les processus d’estérifications, sur la bêta-oxydation et sur la sécrétion d’insuline induite par le glucose ont été étudiés. Les différentes approches que nous avons utilisées ont changé les niveaux de DAG et de TG sans toutefois altérer la sécrétion d’insuline induite par le glucose. Ainsi, les résultats de cette étude n’ont pas associé de rôle pour l’estérification de novo des acides gras dans leur potentialisation de la sécrétion d’insuline. Cependant, l’estérification des acides gras fait partie intégrante d’un cycle de TG/acides gras avec sa contrepartie lipolytique. D’ailleurs, des études parallèles à la mienne menées par des collègues du laboratoire ont démontré un rôle pour la lipolyse et un cycle TG/acides gras dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Parallèlement à nos études des mécanismes de la sécrétion d’insuline impliquant les acides gras, notre laboratoire s’intéresse aussi aux effets négatifs des acides gras sur la cellule bêta. La glucolipotoxicité, résultant d’une exposition chronique aux acides gras saturés en présence d’une concentration élevée de glucose, est d’un intérêt particulier vu la prépondérance de l’obésité. L’isoforme microsomal de GPAT a aussi utilisé comme outil moléculaire dans le contexte de la glucolipotoxicité afin d’étudier le rôle de la synthèse de novo de lipides complexes dans le contexte de décompensation où la fonction des cellules bêta diminue. La surexpression de l’isoforme microsomal de la GPAT, menant à l’augmentation de l’estérification des acides gras et à une diminution de la bêta-oxydation, nous permet de conclure que cette modification métabolique est instrumentale dans la glucolipotoxicité. / Diabetes is a chronic disease of glucose homeostasis characterized by hyperglycemia and the result of a failure of insulin secretion in combination or not with impaired insulin action. Overnutrition and lack of physical activity in individuals who have acquired or inherited genetic predispositions lead to insulin resistance. During the period of compensation where the concentration of plasma fatty acids is high, hyperinsulinemia fully compensates for the insulin resistance of target tissues and blood sugar is normal. Glucose promotes insulin secretion through its metabolism by the pancreatic β cell. According to the classical model of glucose-induced insulin secretion, the increase in the ATP/ADP ratio resulting from glycolysis and glucose oxidation induces the closure of KATP channels thus changing membrane potential followed by an influx of Ca2+. This influx of Ca2+ allows the exocytosis of secretory granules containing insulin. Several nutrients like fatty acids are capable of potentiating insulin secretion. However, the classical model does not explain the potentiation of insulin secretion by fatty acids. To explain the potentiating effect of fatty acids, our laboratory has proposed a complementary model in which malonyl-CoA derived from glucose anaplerotic metabolism inhibits carnitine palmitoyltransferase 1, the enzyme catalyzing the limiting step of fatty acid oxidation, thereby promoting their esterification and thus the formation signaling derivatives. The anaplerotic model of insulin secretion predicts that malonyl-CoA derived from glucose metabolism inhibits β-oxidation of fatty acids and increases the availability of acyl-CoA or non esterified fatty acids. Thus, lipid molecules can act as coupling factors for insulin exocytosis. Fatty acid-derived signalling molecules that are active remain to be identified. Work performed by our laboratory has shown that increasing the partition of fatty acids toward β-oxidation reduced glucose-induced insulin secretion, suggesting that derivatives of fatty acid esterification are important for the potentiation of insulin secretion. Indeed, at high concentrations of glucose, fatty acids are esterified into lysophosphatidic acid (LPA), phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG) and subsequently in triglycerides (TG). The present study established the relative importance fatty acid esterification in the production of factors potentiating insulin secretion. We hypothesized that molecules derived from the process of esterification of fatty acid (eg lysophosphatidic acid (LPA) and diacylglycerol (DAG)) act as metabolic signals and are responsible for the modulation of the secretion of insulin in the presence of fatty acids. Thus, the level of expression of key enzymes controlling the process of esterification has been altered by molecular biology approaches to increase distribution of fatty acids toward esterification in the β cell. The expression of various isoforms of glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT), which catalyzes the first step of esterification of fatty acids was increased and inhibited. The effects of GPAT isoenzyme modulation on the esterification process, on β-oxidation and on glucose-induced insulin secretion were investigated. The various approaches we used have changed the levels of DAG and TG without altering insulin secretion induced by glucose in the presence or absence of fatty acids. Thus, the results of this study do not suggest a role for de novo synthesis of glycerolipid intermidiates via esterification of fatty acids in the potentiation of insulin secretion. However, the esterification of fatty acids is an integral part of a TG/fatty acid cycle with its counterpart lipolysis. Moreover, parallel studies conducted by colleagues of the laboratory have demonstrated a role for lipolysis and a cycle TG/fatty acid in the potentiation of insulin secretion by fatty acids. In parallel with our studies of the mechanisms of insulin secretion involving fatty acids, our laboratory is also interested in the negative effects of fatty acids on the β cell. The glucolipotoxicity resulting from chronic exposure to saturated fatty acids in the presence of high glucose concentrations is of particular interest in the context of obesity rates. The microsomal isoform of GPAT was also used as a molecular tool under glucolipotoxicity conditions to study the role of de novo synthesis of complex lipids in the context of decompensation when β-cell function decreases. Increased esterification of fatty acids by the overexpression of microsomal isoform of GPAT has increased the toxic effects of fatty acids in the context of glucolipotoxicity. Thus, our results allow us to conclude that the distribution of lipids toward esterification and a decrease in β-oxidation is instrumental in glucolipotoxicity.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’[alpha]-casozépine, décapeptide issu de l’hydrolysat trypsique de la caséine [alpha]s1, possède in vitro une affinité pour le site benzodiazépine des récepteurs GABAA centraux (Lecouvey et al., 1997 ; Miclo et al., 2001). Des résultats attestent du potentiel anxiolytique de ce décapeptide seul ou au sein de son hydrolysat, in vivo, en administration intrapéritonéale et per os chez le rat Wistar (Guesdon et al., 2006 ; Miclo et al., 2001 ; Violle et al., 2007) et chez l’Homme en administration orale (Kim et al., 2007 ; Messaoudi et al., 2005). Pour déterminer la sensibilité de l’[alpha]-casozépine à différentes attaques protéolytiques, des cinétiques d’hydrolyses gastriques, pancréatiques et intestinales, ont été réalisées in vitro avec les enzymes et systèmes enzymatiques suivants ; pepsine, trypsine, [alpha]-chymotrypsine, CorolasePP®, vésicules membranaires de bordure en brosse d’entérocytes de rats et épithélium entérocytaire reconstitué par les cellules de la lignée Caco-2. Pour chacune des conditions d’hydrolyses étudiées, l’ensemble des fragments peptidiques libérés ont été séparés par chromatographie liquide haute performance en phase inversée et caractérisés par spectrométrie de masse. Ces analyses mettent en évidence la résistance partielle de l’[alpha]-casozépine à certaines enzymes et systèmes enzymatiques. L’hydrolyse pepsique de l’[alpha]-casozépine libère notamment deux fragments : 91YLGYLEQ97 et 91YLGYL95, nommés F97 et F95 qui s’avèrent être plus résistants que [alpha]-casozépine à certaines enzymes employées. Ainsi pour permettre une meilleure compréhension de la relation entre la structure de l’[alpha]-casozépine et la fonction benzodiazépine mimétique obtenu in vivo, ces peptides tronqués dans leur partie carboxy-terminale ont été testés in vivo chez le rat Wistar en injection intrapéritonéale. Ils s’avèrent être également détenteurs d’activité anxiolytique. Cependant aucun transfert de l’[alpha]-casozépine et des fragments F97 et F95 n’a pu être observé au travers de l’épithélium entérocytaire reconstitué par le modèle cellulaire de la lignée Caco-2 et ce malgré les différentes conditions de cultures et d’analyses testées / [alpha]-Casozepine, a tryptic decapeptide from bovine [alpha]s1-casein, have in vitro an affinity for the benzodiazepine site of the central receptor GABAA (Lecouvey et al., 1997; Miclo et al., 2001). Some results display the anxiolytic potential of this peptide alone or within its hydrolysat, in vivo, in intra peritoneal administration and per os in Wistar rats (Guesdon et al., 2006; Miclo et al., 2001; Violle et al., 2007) and in human in oral administration (Kim et al., 2007; Messaoudi et al., 2005). To determine the sensitivity of [alpha]-casozepine in various proteolytic attacks, kinetics of gastric, pancreatic and intestinal hydrolyses, were realized in vitro with enzymes and following enzymatic systems; pepsin, trypsin, [alpha]-chymotrypsin, CorolasePPTm, brush border membranar vesicles rats enterocytes and enterocytes epithelium reconstituted by the Caco-2 cell line. For each of the conditions of studied hydrolysis, all the peptides fragments released were separated by liquid chromatography high-performance in inverted phase and characterized by mass spectrometry. These analyses underline the partial resistance of [alpha]-casozepine in some enzymes and enzymatic systems. [alpha]-Casozepine pepsic hydrolysis release in particular two peptide fragments: 91YLGYLEQ97 and 91YLGYL95, named F97 and F95 who turn out to be more resistant than [alpha]-casozepine in some used enzymes. So to allow a better understanding of the relation between structure of [alpha]-casozepine and the benzodiazepine mimetic function obtained in vivo, these peptides truncated in their carboxy-terminal party were tested in vivo with Wistar rat in intra peritoneal injection. They turn out to be also holders of anxiolytic activity. However no transfer of [alpha]-casozepine and fragments F97 and F95 was observed through the enterocyte epithelium reconstituted by the cellular model Caco-2 and this in spite of the various conditions of cultures and tested analyses

Le diabète de type 2 est une pathologie chronique complexe associant une altération de sécrétion de l'insuline par le pancréas et une résistance à l'insuline au niveau des tissus périphériques, notamment au niveau du foie et du muscle squelettique. Son origine est multifactorielle, alliant des anomalies génétiques et environnementales, en particulier nutritionnelles. Un des mécanismes par lesquels les facteurs nutritionnels (comme les glucides et les lipides en excès) contribuent au développement du diabète et à son aggravation est la glucolipotoxicité. En effet, l'élévation de la glycémie et des lipides plasmatiques, ainsi que l'accumulation ectopique de lipides dans les tissus, participent au développement de l'insulinorésistance hépatique et musculaire et aux dysfonctions des cellules bêta, en partie via l'induction d'un stress métabolique, impliquant notamment le stress oxydant, le stress du réticulum endoplasmique (RE) et la perturbation de l'homéostasie calcique. Nous avons étudié les effets de la glucotoxicité et de la lipotoxicité dans les cellules bêta pancréatiques et les mécanismes impliqués. Nous nous sommes aussi intéressés à des traitements potentiellement protecteurs de la fonction bêta-pancréatique. Nous avons fait l'hypothèse que les effets bénéfiques de l'inhibition du système rénine-angiotensine sur l'incidence du diabète de type 2 chez l'homme étaient médiés par une action directe sur les cellules bêta. Nos résultats montrent que le glucose chronique à une dose élevée entraine une réduction de la sécrétion d'insuline des cellules bêta des îlots de Langerhans humains par une action conjointe sur le stress du RE, le stress oxydant et l'homéostasie calcique. L'inhibition du SRA a permis de restaurer cette fonction grâce notamment à une action inhibitrice sur la voie Phospholipase C-IP3-Calcium / This study addressed the hypothesis that inhibiting the soluble epoxide hydrolase (sEH)-mediated degradation of epoxy-fatty acids, notably epoxyeicosatrienoic acids, has an additional impact against cardiovascular damage in type 2 diabetes, beyond its previously demonstrated beneficial effect on glucose homeostasis. The cardiovascular and metabolic effects of the sEH inhibitor t- AUCB (10 mg/l in drinking water) were compared to those of the sulfonylurea glibenclamide (80 mg/l), both administered for 8 weeks in FVB mice subjected to a high-fat diet (HFD, 60% fat) for 16 weeks. Mice on control chow diet (10% fat) and non-treated HFD mice served as controls. Glibenclamide and t-AUCB similarly prevented the increased fasting glycemia in HFD mice but only t-AUCB improved glucose tolerance and decreased gluconeogenesis, without modifying weight gain. Moreover, t-AUCB reduced adipose tissue inflammation, plasma free fatty acids and LDL cholesterol, and prevented hepatic steatosis. Furthermore, only the sEH inhibitor improved endothelium-dependent relaxations to acetylcholine, assessed by myography in isolated coronary arteries. This improvement was related to a restoration of epoxyeicosatrienoic acid and nitric oxide pathways, as shown by the increased inhibitory effects of the NO-synthase and cytochrome P450 epoxygenase inhibitors, L-NA and MSPPOH, on these relaxations. Moreover, t-AUCB decreased cardiac hypertrophy, fibrosis and inflammation, and improved diastolic function, as demonstrated by the increased E/A ratio (echocardiography) and decreased slope of the enddiastolic pressure-volume relation (invasive hemodynamics). These results demonstrate that she inhibition improves coronary endothelial function and prevents cardiac remodeling and diastolic dysfunction in obese type 2 diabetic mice

Le diabète est une maladie chronique de l’homéostasie du glucose caractérisée par une hyperglycémie non contrôlée qui est le résultat d’une défaillance de la sécrétion d’insuline en combinaison ou non avec une altération de l’action de l’insuline. La surnutrition et le manque d’activité physique chez des individus qui ont des prédispositions génétiques donnent lieu à la résistance à l’insuline. Pendant cette période dite de compensation où la concentration d’acides gras plasmatiques est élevée, l’hyperinsulinémie compense pleinement pour la résistance à l’insuline des tissus cibles et la glycémie est normale. Le métabolisme du glucose par la cellule pancréatique bêta entraîne la sécrétion d’insuline. Selon le modèle classique de la sécrétion d’insuline induite par le glucose, l’augmentation du ratio ATP/ADP résultant de la glycolyse et de l’oxydation du glucose, induit la fermeture des canaux KATP-dépendant modifiant ainsi le potentiel membranaire suivi d’un influx de Ca2+. Cet influx de Ca2+ permet l’exocytose des granules de sécrétion contenant l’insuline. Plusieurs nutriments comme les acides gras sont capables de potentialiser la sécrétion d’insuline. Cependant, le modèle classique ne permet pas d’expliquer cette potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Pour expliquer l’effet potentialisateur des acides gras, notre laboratoire a proposé un modèle complémentaire où le malonyl-CoA dérivé du métabolisme anaplérotique du glucose inhibe la carnitine palmitoyltransférase-1, l’enzyme qui constitue l’étape limitante de l’oxydation des acides gras favorisant ainsi leur estérification et donc la formation de dérivés lipidiques signalétiques. Le modèle anaplérotique/lipidique de la sécrétion d'insuline induite par le glucose prédit que le malonyl-CoA dérivé du métabolisme du glucose inhibe la bêta-oxydation des acides gras et augmente la disponibilité des acyl-CoA ou des acides gras non-estérifiés. Les molécules lipidiques agissant comme facteurs de couplage du métabolisme des acides gras à l'exocytose d'insuline sont encore inconnus. Des travaux réalisés par notre laboratoire ont démontré qu’en augmentant la répartition des acides gras vers la bêta-oxydation, la sécrétion d’insuline induite par le glucose était réduite suggérant qu’un des dérivés de l’estérification des acides gras est important pour la potentialisation sur la sécrétion d’insuline. En effet, à des concentrations élevées de glucose, les acides gras peuvent être estérifiés d’abord en acide lysophosphatidique (LPA), en acide phosphatidique (PA) et en diacylglycérol (DAG) et subséquemment en triglycérides (TG). La présente étude a établi l’importance relative du processus d’estérification des acides gras dans la production de facteurs potentialisant la sécrétion d’insuline. Nous avions émis l’hypothèse que des molécules dérivées des processus d’estérification des acides gras (ex : l’acide lysophosphatidique (LPA) et le diacylglycerol (DAG)) agissent comme signaux métaboliques et sont responsables de la modulation de la sécrétion d’insuline en présence d’acides gras. Afin de vérifier celle-ci, nous avons modifié le niveau d’expression des enzymes clés contrôlant le processus d’estérification par des approches de biologie moléculaire afin de changer la répartition des acides gras dans la cellule bêta. L’expression des différents isoformes de la glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT), qui catalyse la première étape d’estérification des acides gras a été augmenté et inhibé. Les effets de la modulation de l’expression des isoenzymes de GPAT sur les processus d’estérifications, sur la bêta-oxydation et sur la sécrétion d’insuline induite par le glucose ont été étudiés. Les différentes approches que nous avons utilisées ont changé les niveaux de DAG et de TG sans toutefois altérer la sécrétion d’insuline induite par le glucose. Ainsi, les résultats de cette étude n’ont pas associé de rôle pour l’estérification de novo des acides gras dans leur potentialisation de la sécrétion d’insuline. Cependant, l’estérification des acides gras fait partie intégrante d’un cycle de TG/acides gras avec sa contrepartie lipolytique. D’ailleurs, des études parallèles à la mienne menées par des collègues du laboratoire ont démontré un rôle pour la lipolyse et un cycle TG/acides gras dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Parallèlement à nos études des mécanismes de la sécrétion d’insuline impliquant les acides gras, notre laboratoire s’intéresse aussi aux effets négatifs des acides gras sur la cellule bêta. La glucolipotoxicité, résultant d’une exposition chronique aux acides gras saturés en présence d’une concentration élevée de glucose, est d’un intérêt particulier vu la prépondérance de l’obésité. L’isoforme microsomal de GPAT a aussi utilisé comme outil moléculaire dans le contexte de la glucolipotoxicité afin d’étudier le rôle de la synthèse de novo de lipides complexes dans le contexte de décompensation où la fonction des cellules bêta diminue. La surexpression de l’isoforme microsomal de la GPAT, menant à l’augmentation de l’estérification des acides gras et à une diminution de la bêta-oxydation, nous permet de conclure que cette modification métabolique est instrumentale dans la glucolipotoxicité. / Diabetes is a chronic disease of glucose homeostasis characterized by hyperglycemia and the result of a failure of insulin secretion in combination or not with impaired insulin action. Overnutrition and lack of physical activity in individuals who have acquired or inherited genetic predispositions lead to insulin resistance. During the period of compensation where the concentration of plasma fatty acids is high, hyperinsulinemia fully compensates for the insulin resistance of target tissues and blood sugar is normal. Glucose promotes insulin secretion through its metabolism by the pancreatic β cell. According to the classical model of glucose-induced insulin secretion, the increase in the ATP/ADP ratio resulting from glycolysis and glucose oxidation induces the closure of KATP channels thus changing membrane potential followed by an influx of Ca2+. This influx of Ca2+ allows the exocytosis of secretory granules containing insulin. Several nutrients like fatty acids are capable of potentiating insulin secretion. However, the classical model does not explain the potentiation of insulin secretion by fatty acids. To explain the potentiating effect of fatty acids, our laboratory has proposed a complementary model in which malonyl-CoA derived from glucose anaplerotic metabolism inhibits carnitine palmitoyltransferase 1, the enzyme catalyzing the limiting step of fatty acid oxidation, thereby promoting their esterification and thus the formation signaling derivatives. The anaplerotic model of insulin secretion predicts that malonyl-CoA derived from glucose metabolism inhibits β-oxidation of fatty acids and increases the availability of acyl-CoA or non esterified fatty acids. Thus, lipid molecules can act as coupling factors for insulin exocytosis. Fatty acid-derived signalling molecules that are active remain to be identified. Work performed by our laboratory has shown that increasing the partition of fatty acids toward β-oxidation reduced glucose-induced insulin secretion, suggesting that derivatives of fatty acid esterification are important for the potentiation of insulin secretion. Indeed, at high concentrations of glucose, fatty acids are esterified into lysophosphatidic acid (LPA), phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG) and subsequently in triglycerides (TG). The present study established the relative importance fatty acid esterification in the production of factors potentiating insulin secretion. We hypothesized that molecules derived from the process of esterification of fatty acid (eg lysophosphatidic acid (LPA) and diacylglycerol (DAG)) act as metabolic signals and are responsible for the modulation of the secretion of insulin in the presence of fatty acids. Thus, the level of expression of key enzymes controlling the process of esterification has been altered by molecular biology approaches to increase distribution of fatty acids toward esterification in the β cell. The expression of various isoforms of glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT), which catalyzes the first step of esterification of fatty acids was increased and inhibited. The effects of GPAT isoenzyme modulation on the esterification process, on β-oxidation and on glucose-induced insulin secretion were investigated. The various approaches we used have changed the levels of DAG and TG without altering insulin secretion induced by glucose in the presence or absence of fatty acids. Thus, the results of this study do not suggest a role for de novo synthesis of glycerolipid intermidiates via esterification of fatty acids in the potentiation of insulin secretion. However, the esterification of fatty acids is an integral part of a TG/fatty acid cycle with its counterpart lipolysis. Moreover, parallel studies conducted by colleagues of the laboratory have demonstrated a role for lipolysis and a cycle TG/fatty acid in the potentiation of insulin secretion by fatty acids. In parallel with our studies of the mechanisms of insulin secretion involving fatty acids, our laboratory is also interested in the negative effects of fatty acids on the β cell. The glucolipotoxicity resulting from chronic exposure to saturated fatty acids in the presence of high glucose concentrations is of particular interest in the context of obesity rates. The microsomal isoform of GPAT was also used as a molecular tool under glucolipotoxicity conditions to study the role of de novo synthesis of complex lipids in the context of decompensation when β-cell function decreases. Increased esterification of fatty acids by the overexpression of microsomal isoform of GPAT has increased the toxic effects of fatty acids in the context of glucolipotoxicity. Thus, our results allow us to conclude that the distribution of lipids toward esterification and a decrease in β-oxidation is instrumental in glucolipotoxicity.