A ruptura do aneurisma da aorta abdominal está entre as principais causas de óbito. A alta morbi-mortalidade associada à ruptura e tratamento dos aneurismas representa um grande desafio aos médicos e um alto risco aos pacientes. Apesar dos modelos experimentais serem úteis para compreendermos, treinarmos, testar novos métodos diagnósticos e terapêuticos para esta doença, os modelos existentes até o momento ainda não são os ideais. Nos modelos existentes, os animais são muito pequenos e não representam a doença nos humanos, ou o procedimento envolve laparotomia, ou o comportamento do aneurisma criado não é semelhante ao de um aneurisma verdadeiro. Desenvolvemos, a partir de uma abordagem minimamente invasiva, um método eficiente de induzirmos a formação de um aneurisma verdadeiro na aorta abdominal infrarrenal de porcos Large White. Os animais foram submetidos a indução química a partir de uma aplicação por via endovascular de cloreto de cálcio a 25% ou elastase pancreática suína. Os animais controles foram submetidos a tratamento com soro fisiológico (NaCl 0,9%). Todos os animais foram submetidos à mesma técnica operatória, sob anestesia geral. Os animais foram acompanhados com exames ultrassonográficos com Doppler semanalmente, e as aortas colhidas para testes biomecânicos e análise histológica após 4 semanas. Apesar das aortas tratadas com elastase apresentarem apenas dilatação, estudos de imagens, histológicos e biomecânicos mostraram que as aortas tratadas com cloreto de cálcio evoluíram para aneurismas verdadeiros, com comportamento biomecânico semelhante ao dos aneurismas de humanos. Estes resultados/achados indicam que a abordagem endovascular para a indução de aneurisma é factível e não ocasiona uma fibrose retroperitoneal / Abdominal aortic aneurysms rupture are among the main causes of death. The high morbidity and mortality associated with aneurysm rupture and repair represents a challenge for surgeons and high risk for patients. Although experimental models are useful to understand, train, and develop new treatment and diagnostic methods for this disease, animal models developed to date are far from ideal. Animals are either too small and do not represent the pathology of humans, or the procedures employ laparotomy, or the aortic behavior does not resemble that of a true aneurysm. We developed a novel, less invasive and effective method to induce true aortic aneurysms in Large White pigs. Animals were submitted to an endovascular chemical induction using either calcium chloride (25%) or swine pancreatic elastase. Controls were exposed to saline solution. All animals were operated on using the same surgical technique under general anesthesia. They were followed weekly with ultrasound examinations and at 4 weeks the aorta was harvested. Although elastase induced only arterial dilation, imaging, histological, and biomechanical studies of the aorta revealed the formation of true aneurysms in animals exposed to calcium chloride. Aneurysms in the latter group had biomechanical failure properties similar to those of human aneurysms. These findings indicate that the endovascular approach is viable and does not cause retroperitoneal fibrosis

O objetivo deste trabalho foi avaliar se a proteína bifuncional de planta, CrataBL, que tem lectina e as propriedades inibidoras de enzima, modula alterações de mecânica pulmonar, inflamatórias e remodelamento induzidas por elastase intratraqueal em camundongos. Métodos: 36 camundongos C57BL6 receberam elastase (0,025 mg) por instilação intratraqueal (grupo ELA e ELA-CrataBL). Os grupos controles receberam salina (grupo SAL e SAL-CrataBL). Os camundongos foram tratados com instilação intraperitoneal de CrataBL (2mg/kg) nos dias 1, 14 e 21 após a instilação intratraqueal de elastase (grupo SAL-CrataBL e ELA-CrataBL) os animais controle receberam salina no mesmo volume. No dia 28, os camundongos foram anestesiados, ventilados mecanicamente e foram analisados a resistência e elastância do sistema respiratório (Ers e Rrs), elastância e resistência tecidual (Htis e Gtis), resistência das vias aéreas (Raw) e óxido nítrico exalado (NOex). Após, o lavado broncoalveolar (LBA) foi realizado, os pulmões foram retirados e por morfometria, e foram quantificados o intercepto linear médio (Lm), a quantidade de neutrófilos, células positivas para TNF-alfa, fibras colágenas, elásticas, células positivas para MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS e iNOS e isoprostano no parênquima pulmonar e vias aéreas. No parênquima foram avaliados os macrófagos nos septos alveolares e nas vias aéreas, foram também avaliadas as células para MUC-5. Resultados: No grupo ELA houve um aumento na Ers, Raw, Gtis, Htis, Lm, NOex, nas células totais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e linfócitos no LBA em relação aos controles (p < 0,05), sendo que Raw, diminuiu também nos grupos SAL-CrataBL e ELA-CrataBL. Nos grupos tratados com CrataBL houve uma diminuição de Ers (37,0±2,2 cmH2O/L), Htis (37,9±3,5 cmH2O/ml/s), ENO (14,7±0,7 ppb), comparativamente ao grupo ELA (p < 0,05). No LBA houve atenuação de neutrófilos (0,003±0,001 104células/ml), linfócitos (0,003±0,001 104células/ml) e de Lm (54,6±6,0 mm). Complementando a avaliação, no grupo que recebeu elastase houve um aumento no número de macrófagos (22,88 +- 2,24 células/104um2), neutrófilos (1,18 +- 0,15 células/10 4um2), células positivas para TNF-ala (12,52 +- 0,42 células/104um2) no parênquima pulmonar. Nas alterações de remodelamento no parênquima pulmonar, houve um aumento da proporção de volume de fibras colágenas (11,5 +- 0,11%), elásticas (0,5 +- 0,03%), na quantidade de células positivas para MMP-9 (18,59 +- 1,87 células/104?m2), MMP-12 (20,17 +- 1,92 células/104?m2), TIMP-1 (14,42 +- 2,05 células/104um2) em comparação com os controlos (p < 0,001). No estresse oxidativo, houve um aumento de eNOS (13,15 +- 0,40 células/104um2), iNOS (10,49 +- 0,65 células/104um2) e isoprostano (18,11 =- 5,38%). O tratamento CrataBL (grupo ELA-CrataBL) reduziu no parênquima pulmonar a quantidade de macrófagos (9,58 +- 1,36 células/104um2), neutrófilos (0,75 +- 0,1 células/104um2), células positivas para TNF-alfa (10.4±0,49 células/104?m2), fibras colágenas (10,8 +- 0,13%), elásticas (0,3 +- 0,02%), a quantidade de células positivas para a MMP-9 (10,35±0,65 células/104um2), MMP-12 (14,15±0,59 células/104um2), TIMP-1 (9,89 +- 2,79 células/104um2), MUC-5 (3,56 +- 0,54 células/104um2), eNOS (6.98 +- 0.32 células/104um2) e iNOS (6,21 +- 0,42 células/104um2) e isoprostano (8,96 +- 3,08 %) em relação ao grupo ELA (p < 0,001). Nas vias aéreas também ocorreu um aumento significativo de neutrófilos (5,97 +- 1,03 células/104um2), células positivas para TNF-alfa (15,82 +- 1,03 células/104um2). Nas alterações de remodelamento pulmonar nas vias aéreas também ocorreu um aumento da proporção de volume de fibras colágenas (8,73 +- 2,59%), elásticas (2,56 +- 0,18%), na quantidade de células positivas para MMP-9 (14,86 +- 1,77 células/104um2), MMP-12 (18,56 +- 1,79 células/104um2), TIMP-1 (1,31 +- 0,12 células/104um2) e MUC-5 (7,09 +- 1,71 células/104um2) em comparação com os controlos (p < 0,001). No estresse oxidativo, houve um aumento de células positivas para eNOS (3,09 +- 0,08 células/104um2), iNOS (5,4 +- 0,3 células/104um2) e isoprostano (18,11 +- 5,38%) em comparação com os controlos (p < 0,001). O tratamento CrataBL (grupo ELA-CrataBL) reduziu nas vias aéreas a quantidade de neutrófilos (4,62 +- 0,61 células/104um2), TNF- alfa (14,30 +- 1,28 células/104um2), fibras colágenas (7,80 +- 1,37%), elásticas (1,4 +- 0,13%), a quantidade de células positivas para a MMP-9 (9,93 +- 1,39 células/104um2), MMP-12 (12,06 +- 1,15 células/104um2), TIMP-1 (0,73 +- 0,05 células/104?m2), MUC-5 (3,56 +- 0,54 células/104um2), eNOS (1,89 +- 0,16 células/104um2) e iNOS (4,3 +- 0,31 células/104um2), isoprostano (7,34 +- 2,31%) em relação ao grupo ELA (p < 0,001). Conclusão: CrataBL atenua as alterações de mecânica pulmonar, lavado bronco alveolar, responsividade inflamatória, controle do remodelamento e estresse oxidativo induzidas pela elastase. Embora mais estudos devam ser realizados, esta proteína bifuncional pode contribuir como potencial ferramenta terapêutica para o tratamento da DPOC / The aim of this study was to evaluate whether the bifunctional protein plant, CrataBL, which has lectin and enzyme inhibitory properties, modulates changes in lung mechanics, inflammatory and remodeling induced by intratracheal elastase in mice.Methods : 36 C57/Bl6 mice received elastase (0.025 mg) by intratracheal (group ELA and ELA-CrataBL). Control groups received saline (group SAL and SAL-CrataBL).The mice were treated with intraperitoneal instillation of CrataBL (2mg/kg) on days 1, 14 and 21 after intratracheal instillation of elastase (group SAL-CrataBL and ELA-CrataBL), control animals received saline in the same volume. On day 28, the mice were anesthetized and mechanically ventilated were analyzed resistance and respiratory system elastance (Ers and Rrs), elastance and tissue resistance (Htis and Gtis), airway resistance (Raw) and exhaled nitric oxide (ENO). After the bronchoalveolar lavage (BAL) was performed, the lungs were removed and morphometry were quantified and the linear intercept mean (Lm), the number of neutrophils, positive cells for TNF-alfa, collagen fibers, positive cells for MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS, iNOS and isoprostane in lung parenchyma and airways. Parenchyma was also evaluated macrophages in the alveolar septa. Airway was also evaluated MUC-5 cells. Results: In group ELA was an increase in Ers, Raw, Gtis, Htis, Lm, ENO, in total cells, macrophages, neutrophils, eosinophils and lymphocytes in BAL compared to controls (p < 0.05), and Raw, decreased in both groups SAL-CrataBL and ELA-CrataBL. In the groups treated with CrataBL there was a decrease in Ers (37.0±2.2 cmH2O/L) Htis (37 9±3.5 cmH2O/ml/s) and ENO (14.7±0.7 ppb) compared to the ELA group (p < 0.05). In BAL there was attenuation of neutrophils (0.003±0.001 104cells/ml), lymphocytes (0.003±0.001 104cells/ml) and Lm (54.6±6.0 mm). Complementing the assessment, the group that received elastase was an increase in the number of macrophages (22.88±2.24 cells/104um2), neutrophils (1.18±0.15 cells/104um2), positive TNF-alfa cells (12.52±0.42 cells/104um2) in the lung parenchyma. In remodeling changes in lung parenchyma, there was an increase in the volume ratio of collagen fibers (11.5 ± 0.11%), elastic (0.5±0.03%), the number of positive MMP-9 cells (18.59±1.87 cells/104um2), MMP-12 (20.17 ± 1.92 cells/104um2) TIMP-1 (14.42±2.05 cells/104um2) compared to controls (p < 0.001). Oxidative stress, was an increased of eNOS (13.15±0.40 cells/104um2), iNOS (10.49 ± 0.65 cells/104um2) and isoprostane (18.11±5.38%). Treatment CrataBL (ELA-CrataBL group) reduced the amount of parenchymal lung macrophages (9.58±1.36 cells/104um2), neutrophils (0.75±0.1 cells/104um2), positive TNF-alfa cells (10.4±0.49 cells/104um2), collagen (10.8±0.13%), elastic (0.3±0.02%), the number of positive MMP-9 cells (10.35±0.65 cells/104?m2), MMP-12 (14.15±0.59 cells/104um2), TIMP-1 (9.89±2.79 cells/104um2) MUC-5 (3.56±0.54 cells/104um2), eNOS (6.98±0:32 cells/104um2) and iNOS (6.21±0.42 cells/104um2) and isoprostane (8.96 ± 3.08%) compared to group ELA (p < 0.001). Airway was also a significant increase in neutrophils (5.97±1.03 cells/104um2), positive TNF-alfa cells (15.82±1.03 cells/104um2). Changes in lung airway remodeling also occurred an increase in the volume ratio of collagen fibers (8.73±2.59%), elastic (2.56±0.18%), the number of positive MMP-9 cells (14.86±1.77 cells/104um2), MMP-12 (18.56±1.79 cells/104um2) TIMP-1 (1.31±0.12 cells/104um2) and MUC-5 (7.09±1.71 cells/104um2) compared to controls (p < 0.001). Oxidative stress, an increase of eNOS (3.09 ± 0.08 cells/104um2), iNOS (5.4±0.3 cells/104um2) and isoprostane (18.11±5.38%) compared to controls (p < 0.001). Treatment CrataBL (ELA-CrataBL group) reduced the amount airway neutrophils (4.62±0.61 cells/104um2), TNF-alfa (14.30 ± 1.28 cells/104um2), collagen fibers (7 80±1.37%), elastic (1.4±0.13%), the number of positive MMP-9 cells (9.93±1.39 cells/104um2), MMP-12 (12.06±1.15), TIMP-1 (0.73±0.05 cells/104um2), MUC-5 (3.56±0.54 cells/104um2), eNOS (1.89±0,16 cells/104um2) and iNOS (4.3±0.31 cells/104um2), isoprostane (7.34±2.31%) compared to group ELA (p < 0.001). Conclusion: CrataBL attenuates changes in lung mechanics, broncho alveolar inflammatory responsiveness, control remodeling and oxidative stress induced by elastase. Although more studies should be conducted, this bifunctional protein may contribute as a potential therapeutic tool for the treatment of COPD

Introdução: O desequilibrio protease-antiprotease é fundamental para a fisiopatologia da doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC). No entanto, poucos estudos para a inibição da elastase têm sido investigados. Objetivo: O nosso estudo avaliou a capacidade do inibidor proteinase derivada da planta Bauhinia bauhinioides (BbKI) na modulação da inflamação pulmonar induzida pela elastase. Métodos: Camundongos C57BL receberam instilação intratraqueal de elastase (0,025 mg, ELA n=6) ou solução salina (SAL n=6) e foram tratados por via intraperitoneal com BbKI (2 mg/kg, de ELA-BbKI n=6, SAL-BbKI n=6) nos dias 1, 14 e 21. No dia 28 foram realizadas as seguintes análises: (I) avaliação da mecânica pulmonar (II) medida do óxido nítrico exalado (ENO), (III) a determinação do número de céluas no lavado broncoalveolar (FLBA), e ( IV) coloração imunohistoquímica do fluído pulmonar, (V) intercepto linear médio (Lm), Resultados: Além de diminuir alterações mecânicas e a lesão do septo alveolar (Lm), BbKI reduziu o número de células no fluido de FLBA e diminuiu a expressão celular de TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS e iNOS em vias aéreas e nas paredes alveolares em comparação com o grupo de ELA (p < 0,05). BbKI diminuiu a proporção de volume de 8-iso-PGF2, as fibras colagenas e as elásticas nas vias aéreas e paredes alveolares em comparação com o grupo de ELA (p < 0,05). Houve redução do número de células para positivas MUC-5 nas paredes das vias aéreas (p < 0,05). Houve redução do número de neutrófilos em vias aereas e parenquima e de macrófagosnas paredes alveolares. Conclusão: BbKI foi eficaz na redução da inflamação pulmonar, mecânica pulmonar e do remodelamento da matriz extracelular induzida por elastase. BbKI pode ser uma ferramenta farmacológica potencial para o tratamento da DPOC; no entanto, são necessárias análises adicionais / Introduction: The protease-antiprotease imbalance is essential to the pathophysiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). However, few studies for inhibition of elastase have been investigated. Objective: Our study evaluated the ability of proteinase inhibitor derived Bauhinia bauhinioides plant (BbKI) in modulating lung inflammation induced by elastase. Methods: Mice C57BL received intratracheal elastase instillation (0.025 mg, ELA n = 6) or saline (SAL n = 6) and were treated intraperitoneally with BbKI (2 mg/kg of ELA-BbKI n = 6, SAL-BbKI n = 6) on days 1, 14 and 21. On the 28th the following analyzes were performed: (i) assessment of pulmonary mechanics (II) measurement of exhaled nitric oxide (ENO), (III) determining the number of cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and (IV) immunohistochemical staining of lung fluid, (V) mean linear intercept (Lm) Results: In addition to reducing mechanical changes and Lm, BbKI reduced the number of cells in BALF fluid and decreased cellular expression of TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS and iNOS in the airway and alveolar walls compared with ELA group (p < 0.05). BbKI decreased volume proportion of 8-iso-PGF2, collagen fibers and elastic airway and alveolar walls compared with ELA group (p < 0.05). There was a reduction from MUC-5 positive cells in the airway walls (p < 0.05). There was a reduction in the number of neutrophils in airway and alveolar walls (p < 0.005) and a reduction in macrophages in alveolar walls (p < 0.005). Conclusion: BbKI was effective in reducing inflammation, pulmonary mechanics and remodeling of the extracellular matrix induced by elastase. BbKI may be a potential pharmacological agent for the treatment of COPD; however, additional tests are required

Os modelos experimentais têm sido utilizados para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC). O modelo que melhor mimetiza a doença em humanos é o que utiliza a exposição à fumaça de cigarro. No entanto, a utilização deste modelo experimental requer um longo tempo de exposição (6 meses) e a lesão do parênquima obtida é considerada leve. O desequilíbrio protease/anti-protease é considerado um importante mecanismo fisiopatológico envolvido no desenvolvimento da DPOC. Desta forma, neste estudo propomos o desenvolvimento de um modelo experimental no qual associamos a instilação de elastase previamente ao início da exposição ao fumo na tentativa de obter um maior grau de lesão tecidual em um menor espaço de tempo. Para tanto, camundongos C57Bl/6 foram divididos em quatro grupos: Controle, Elastase, Fumo, Fumo/Elastase 1 dose e Fumo/Elastase 2 doses e analisados após dois meses de exposição. Os animais do grupo Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses foram submetidos à instilação intranasal de elastase pancreática de porco (0,33UI) e expostos a fumaça de cigarro por dois meses. O grupo controle recebeu o mesmo tratamento com solução fisiológica (NaCl 0.9%). A exposição ao fumo foi feita por 30min, 2 vezes/dia, 5 dias da semana. Após dois meses, os animais foram sacrificados e observamos aumento de LM no grupo Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses comparado aos grupos Controle e Fumo; aumento de células positivas para MAC-2 no parênquima (Fumo/Elastase 2 doses) e vias aéreas (Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses), MMP-12 no parênquima pulmonar (Fumo/Elastase 2 doses), GP91 no parênquima (Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses) e vias aéreas (Fumo e Fumo/Elastase 1 dose) e aumento de proporção de fibras elásticas no parênquima pulmonar do grupo Fumo/Elastase 1 dose e do grupo Fumo, caracterizando presença de enfisema pulmonar. A instilação de elastase pancreática de porco juntamente com a exposição à fumaça de cigarro aumentou a susceptibilidade ao desenvolvimento do enfisema / Experimental models have been used to study the pathophysiological mechanisms involved in the development of COPD. Cigarette Smoke exposure (CS) is considered the best model to mimetize the disease in humans. However, the CS requires a long exposure time (6 months) and the parenchymal destruction obtained is considered mild. The protease / anti - protease imbalance is considered an important pathophysiological mechanism involved in the development of COPD. Thus, in this study we propose the development of an experimental model in which we associate instillation of elastase before the start of exposure to smoke, trying to increase the parenchymal destruction degree in a shorter time. For that, C57BL / 6 mice were divided into four groups: Control, Elastase, Smoke and Smoke/Elastase 1 dose and Smoke/Elastase 2 doses and analyzed in two months after the CS exposition. The Smoke/Elastase 1 dose and 2 doses animals group received an intranasal instillation of porcine pancreatic elastase (0.33 IU) and exposed to cigarette smoke for two months. The control group received the same treatment with saline (NaCl 0.9 %). Animals were exposed to CS for 30min, 2 times / day, 5 days a week. After two months, we observed increased mean linear intercept (LM) and positive cells for MAC-2, MMP-12 and GP91 in the airways and lung parenchyma and increase of elastic fibers in the lung parenchyma characterizing the presence of pulmonary emphysema. The instillation of porcine pancreatic elastase along the exposure to cigarette smoke increased susceptibility to the development of emphysema

Introdução: O desequilibrio protease-antiprotease é fundamental para a fisiopatologia da doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC). No entanto, poucos estudos para a inibição da elastase têm sido investigados. Objetivo: O nosso estudo avaliou a capacidade do inibidor proteinase derivada da planta Bauhinia bauhinioides (BbKI) na modulação da inflamação pulmonar induzida pela elastase. Métodos: Camundongos C57BL receberam instilação intratraqueal de elastase (0,025 mg, ELA n=6) ou solução salina (SAL n=6) e foram tratados por via intraperitoneal com BbKI (2 mg/kg, de ELA-BbKI n=6, SAL-BbKI n=6) nos dias 1, 14 e 21. No dia 28 foram realizadas as seguintes análises: (I) avaliação da mecânica pulmonar (II) medida do óxido nítrico exalado (ENO), (III) a determinação do número de céluas no lavado broncoalveolar (FLBA), e ( IV) coloração imunohistoquímica do fluído pulmonar, (V) intercepto linear médio (Lm), Resultados: Além de diminuir alterações mecânicas e a lesão do septo alveolar (Lm), BbKI reduziu o número de células no fluido de FLBA e diminuiu a expressão celular de TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS e iNOS em vias aéreas e nas paredes alveolares em comparação com o grupo de ELA (p < 0,05). BbKI diminuiu a proporção de volume de 8-iso-PGF2, as fibras colagenas e as elásticas nas vias aéreas e paredes alveolares em comparação com o grupo de ELA (p < 0,05). Houve redução do número de células para positivas MUC-5 nas paredes das vias aéreas (p < 0,05). Houve redução do número de neutrófilos em vias aereas e parenquima e de macrófagosnas paredes alveolares. Conclusão: BbKI foi eficaz na redução da inflamação pulmonar, mecânica pulmonar e do remodelamento da matriz extracelular induzida por elastase. BbKI pode ser uma ferramenta farmacológica potencial para o tratamento da DPOC; no entanto, são necessárias análises adicionais / Introduction: The protease-antiprotease imbalance is essential to the pathophysiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). However, few studies for inhibition of elastase have been investigated. Objective: Our study evaluated the ability of proteinase inhibitor derived Bauhinia bauhinioides plant (BbKI) in modulating lung inflammation induced by elastase. Methods: Mice C57BL received intratracheal elastase instillation (0.025 mg, ELA n = 6) or saline (SAL n = 6) and were treated intraperitoneally with BbKI (2 mg/kg of ELA-BbKI n = 6, SAL-BbKI n = 6) on days 1, 14 and 21. On the 28th the following analyzes were performed: (i) assessment of pulmonary mechanics (II) measurement of exhaled nitric oxide (ENO), (III) determining the number of cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and (IV) immunohistochemical staining of lung fluid, (V) mean linear intercept (Lm) Results: In addition to reducing mechanical changes and Lm, BbKI reduced the number of cells in BALF fluid and decreased cellular expression of TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS and iNOS in the airway and alveolar walls compared with ELA group (p < 0.05). BbKI decreased volume proportion of 8-iso-PGF2, collagen fibers and elastic airway and alveolar walls compared with ELA group (p < 0.05). There was a reduction from MUC-5 positive cells in the airway walls (p < 0.05). There was a reduction in the number of neutrophils in airway and alveolar walls (p < 0.005) and a reduction in macrophages in alveolar walls (p < 0.005). Conclusion: BbKI was effective in reducing inflammation, pulmonary mechanics and remodeling of the extracellular matrix induced by elastase. BbKI may be a potential pharmacological agent for the treatment of COPD; however, additional tests are required

O objetivo deste trabalho foi avaliar se a proteína bifuncional de planta, CrataBL, que tem lectina e as propriedades inibidoras de enzima, modula alterações de mecânica pulmonar, inflamatórias e remodelamento induzidas por elastase intratraqueal em camundongos. Métodos: 36 camundongos C57BL6 receberam elastase (0,025 mg) por instilação intratraqueal (grupo ELA e ELA-CrataBL). Os grupos controles receberam salina (grupo SAL e SAL-CrataBL). Os camundongos foram tratados com instilação intraperitoneal de CrataBL (2mg/kg) nos dias 1, 14 e 21 após a instilação intratraqueal de elastase (grupo SAL-CrataBL e ELA-CrataBL) os animais controle receberam salina no mesmo volume. No dia 28, os camundongos foram anestesiados, ventilados mecanicamente e foram analisados a resistência e elastância do sistema respiratório (Ers e Rrs), elastância e resistência tecidual (Htis e Gtis), resistência das vias aéreas (Raw) e óxido nítrico exalado (NOex). Após, o lavado broncoalveolar (LBA) foi realizado, os pulmões foram retirados e por morfometria, e foram quantificados o intercepto linear médio (Lm), a quantidade de neutrófilos, células positivas para TNF-alfa, fibras colágenas, elásticas, células positivas para MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS e iNOS e isoprostano no parênquima pulmonar e vias aéreas. No parênquima foram avaliados os macrófagos nos septos alveolares e nas vias aéreas, foram também avaliadas as células para MUC-5. Resultados: No grupo ELA houve um aumento na Ers, Raw, Gtis, Htis, Lm, NOex, nas células totais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e linfócitos no LBA em relação aos controles (p < 0,05), sendo que Raw, diminuiu também nos grupos SAL-CrataBL e ELA-CrataBL. Nos grupos tratados com CrataBL houve uma diminuição de Ers (37,0±2,2 cmH2O/L), Htis (37,9±3,5 cmH2O/ml/s), ENO (14,7±0,7 ppb), comparativamente ao grupo ELA (p < 0,05). No LBA houve atenuação de neutrófilos (0,003±0,001 104células/ml), linfócitos (0,003±0,001 104células/ml) e de Lm (54,6±6,0 mm). Complementando a avaliação, no grupo que recebeu elastase houve um aumento no número de macrófagos (22,88 +- 2,24 células/104um2), neutrófilos (1,18 +- 0,15 células/10 4um2), células positivas para TNF-ala (12,52 +- 0,42 células/104um2) no parênquima pulmonar. Nas alterações de remodelamento no parênquima pulmonar, houve um aumento da proporção de volume de fibras colágenas (11,5 +- 0,11%), elásticas (0,5 +- 0,03%), na quantidade de células positivas para MMP-9 (18,59 +- 1,87 células/104?m2), MMP-12 (20,17 +- 1,92 células/104?m2), TIMP-1 (14,42 +- 2,05 células/104um2) em comparação com os controlos (p < 0,001). No estresse oxidativo, houve um aumento de eNOS (13,15 +- 0,40 células/104um2), iNOS (10,49 +- 0,65 células/104um2) e isoprostano (18,11 =- 5,38%). O tratamento CrataBL (grupo ELA-CrataBL) reduziu no parênquima pulmonar a quantidade de macrófagos (9,58 +- 1,36 células/104um2), neutrófilos (0,75 +- 0,1 células/104um2), células positivas para TNF-alfa (10.4±0,49 células/104?m2), fibras colágenas (10,8 +- 0,13%), elásticas (0,3 +- 0,02%), a quantidade de células positivas para a MMP-9 (10,35±0,65 células/104um2), MMP-12 (14,15±0,59 células/104um2), TIMP-1 (9,89 +- 2,79 células/104um2), MUC-5 (3,56 +- 0,54 células/104um2), eNOS (6.98 +- 0.32 células/104um2) e iNOS (6,21 +- 0,42 células/104um2) e isoprostano (8,96 +- 3,08 %) em relação ao grupo ELA (p < 0,001). Nas vias aéreas também ocorreu um aumento significativo de neutrófilos (5,97 +- 1,03 células/104um2), células positivas para TNF-alfa (15,82 +- 1,03 células/104um2). Nas alterações de remodelamento pulmonar nas vias aéreas também ocorreu um aumento da proporção de volume de fibras colágenas (8,73 +- 2,59%), elásticas (2,56 +- 0,18%), na quantidade de células positivas para MMP-9 (14,86 +- 1,77 células/104um2), MMP-12 (18,56 +- 1,79 células/104um2), TIMP-1 (1,31 +- 0,12 células/104um2) e MUC-5 (7,09 +- 1,71 células/104um2) em comparação com os controlos (p < 0,001). No estresse oxidativo, houve um aumento de células positivas para eNOS (3,09 +- 0,08 células/104um2), iNOS (5,4 +- 0,3 células/104um2) e isoprostano (18,11 +- 5,38%) em comparação com os controlos (p < 0,001). O tratamento CrataBL (grupo ELA-CrataBL) reduziu nas vias aéreas a quantidade de neutrófilos (4,62 +- 0,61 células/104um2), TNF- alfa (14,30 +- 1,28 células/104um2), fibras colágenas (7,80 +- 1,37%), elásticas (1,4 +- 0,13%), a quantidade de células positivas para a MMP-9 (9,93 +- 1,39 células/104um2), MMP-12 (12,06 +- 1,15 células/104um2), TIMP-1 (0,73 +- 0,05 células/104?m2), MUC-5 (3,56 +- 0,54 células/104um2), eNOS (1,89 +- 0,16 células/104um2) e iNOS (4,3 +- 0,31 células/104um2), isoprostano (7,34 +- 2,31%) em relação ao grupo ELA (p < 0,001). Conclusão: CrataBL atenua as alterações de mecânica pulmonar, lavado bronco alveolar, responsividade inflamatória, controle do remodelamento e estresse oxidativo induzidas pela elastase. Embora mais estudos devam ser realizados, esta proteína bifuncional pode contribuir como potencial ferramenta terapêutica para o tratamento da DPOC / The aim of this study was to evaluate whether the bifunctional protein plant, CrataBL, which has lectin and enzyme inhibitory properties, modulates changes in lung mechanics, inflammatory and remodeling induced by intratracheal elastase in mice.Methods : 36 C57/Bl6 mice received elastase (0.025 mg) by intratracheal (group ELA and ELA-CrataBL). Control groups received saline (group SAL and SAL-CrataBL).The mice were treated with intraperitoneal instillation of CrataBL (2mg/kg) on days 1, 14 and 21 after intratracheal instillation of elastase (group SAL-CrataBL and ELA-CrataBL), control animals received saline in the same volume. On day 28, the mice were anesthetized and mechanically ventilated were analyzed resistance and respiratory system elastance (Ers and Rrs), elastance and tissue resistance (Htis and Gtis), airway resistance (Raw) and exhaled nitric oxide (ENO). After the bronchoalveolar lavage (BAL) was performed, the lungs were removed and morphometry were quantified and the linear intercept mean (Lm), the number of neutrophils, positive cells for TNF-alfa, collagen fibers, positive cells for MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS, iNOS and isoprostane in lung parenchyma and airways. Parenchyma was also evaluated macrophages in the alveolar septa. Airway was also evaluated MUC-5 cells. Results: In group ELA was an increase in Ers, Raw, Gtis, Htis, Lm, ENO, in total cells, macrophages, neutrophils, eosinophils and lymphocytes in BAL compared to controls (p < 0.05), and Raw, decreased in both groups SAL-CrataBL and ELA-CrataBL. In the groups treated with CrataBL there was a decrease in Ers (37.0±2.2 cmH2O/L) Htis (37 9±3.5 cmH2O/ml/s) and ENO (14.7±0.7 ppb) compared to the ELA group (p < 0.05). In BAL there was attenuation of neutrophils (0.003±0.001 104cells/ml), lymphocytes (0.003±0.001 104cells/ml) and Lm (54.6±6.0 mm). Complementing the assessment, the group that received elastase was an increase in the number of macrophages (22.88±2.24 cells/104um2), neutrophils (1.18±0.15 cells/104um2), positive TNF-alfa cells (12.52±0.42 cells/104um2) in the lung parenchyma. In remodeling changes in lung parenchyma, there was an increase in the volume ratio of collagen fibers (11.5 ± 0.11%), elastic (0.5±0.03%), the number of positive MMP-9 cells (18.59±1.87 cells/104um2), MMP-12 (20.17 ± 1.92 cells/104um2) TIMP-1 (14.42±2.05 cells/104um2) compared to controls (p < 0.001). Oxidative stress, was an increased of eNOS (13.15±0.40 cells/104um2), iNOS (10.49 ± 0.65 cells/104um2) and isoprostane (18.11±5.38%). Treatment CrataBL (ELA-CrataBL group) reduced the amount of parenchymal lung macrophages (9.58±1.36 cells/104um2), neutrophils (0.75±0.1 cells/104um2), positive TNF-alfa cells (10.4±0.49 cells/104um2), collagen (10.8±0.13%), elastic (0.3±0.02%), the number of positive MMP-9 cells (10.35±0.65 cells/104?m2), MMP-12 (14.15±0.59 cells/104um2), TIMP-1 (9.89±2.79 cells/104um2) MUC-5 (3.56±0.54 cells/104um2), eNOS (6.98±0:32 cells/104um2) and iNOS (6.21±0.42 cells/104um2) and isoprostane (8.96 ± 3.08%) compared to group ELA (p < 0.001). Airway was also a significant increase in neutrophils (5.97±1.03 cells/104um2), positive TNF-alfa cells (15.82±1.03 cells/104um2). Changes in lung airway remodeling also occurred an increase in the volume ratio of collagen fibers (8.73±2.59%), elastic (2.56±0.18%), the number of positive MMP-9 cells (14.86±1.77 cells/104um2), MMP-12 (18.56±1.79 cells/104um2) TIMP-1 (1.31±0.12 cells/104um2) and MUC-5 (7.09±1.71 cells/104um2) compared to controls (p < 0.001). Oxidative stress, an increase of eNOS (3.09 ± 0.08 cells/104um2), iNOS (5.4±0.3 cells/104um2) and isoprostane (18.11±5.38%) compared to controls (p < 0.001). Treatment CrataBL (ELA-CrataBL group) reduced the amount airway neutrophils (4.62±0.61 cells/104um2), TNF-alfa (14.30 ± 1.28 cells/104um2), collagen fibers (7 80±1.37%), elastic (1.4±0.13%), the number of positive MMP-9 cells (9.93±1.39 cells/104um2), MMP-12 (12.06±1.15), TIMP-1 (0.73±0.05 cells/104um2), MUC-5 (3.56±0.54 cells/104um2), eNOS (1.89±0,16 cells/104um2) and iNOS (4.3±0.31 cells/104um2), isoprostane (7.34±2.31%) compared to group ELA (p < 0.001). Conclusion: CrataBL attenuates changes in lung mechanics, broncho alveolar inflammatory responsiveness, control remodeling and oxidative stress induced by elastase. Although more studies should be conducted, this bifunctional protein may contribute as a potential therapeutic tool for the treatment of COPD

Os modelos experimentais têm sido utilizados para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC). O modelo que melhor mimetiza a doença em humanos é o que utiliza a exposição à fumaça de cigarro. No entanto, a utilização deste modelo experimental requer um longo tempo de exposição (6 meses) e a lesão do parênquima obtida é considerada leve. O desequilíbrio protease/anti-protease é considerado um importante mecanismo fisiopatológico envolvido no desenvolvimento da DPOC. Desta forma, neste estudo propomos o desenvolvimento de um modelo experimental no qual associamos a instilação de elastase previamente ao início da exposição ao fumo na tentativa de obter um maior grau de lesão tecidual em um menor espaço de tempo. Para tanto, camundongos C57Bl/6 foram divididos em quatro grupos: Controle, Elastase, Fumo, Fumo/Elastase 1 dose e Fumo/Elastase 2 doses e analisados após dois meses de exposição. Os animais do grupo Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses foram submetidos à instilação intranasal de elastase pancreática de porco (0,33UI) e expostos a fumaça de cigarro por dois meses. O grupo controle recebeu o mesmo tratamento com solução fisiológica (NaCl 0.9%). A exposição ao fumo foi feita por 30min, 2 vezes/dia, 5 dias da semana. Após dois meses, os animais foram sacrificados e observamos aumento de LM no grupo Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses comparado aos grupos Controle e Fumo; aumento de células positivas para MAC-2 no parênquima (Fumo/Elastase 2 doses) e vias aéreas (Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses), MMP-12 no parênquima pulmonar (Fumo/Elastase 2 doses), GP91 no parênquima (Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses) e vias aéreas (Fumo e Fumo/Elastase 1 dose) e aumento de proporção de fibras elásticas no parênquima pulmonar do grupo Fumo/Elastase 1 dose e do grupo Fumo, caracterizando presença de enfisema pulmonar. A instilação de elastase pancreática de porco juntamente com a exposição à fumaça de cigarro aumentou a susceptibilidade ao desenvolvimento do enfisema / Experimental models have been used to study the pathophysiological mechanisms involved in the development of COPD. Cigarette Smoke exposure (CS) is considered the best model to mimetize the disease in humans. However, the CS requires a long exposure time (6 months) and the parenchymal destruction obtained is considered mild. The protease / anti - protease imbalance is considered an important pathophysiological mechanism involved in the development of COPD. Thus, in this study we propose the development of an experimental model in which we associate instillation of elastase before the start of exposure to smoke, trying to increase the parenchymal destruction degree in a shorter time. For that, C57BL / 6 mice were divided into four groups: Control, Elastase, Smoke and Smoke/Elastase 1 dose and Smoke/Elastase 2 doses and analyzed in two months after the CS exposition. The Smoke/Elastase 1 dose and 2 doses animals group received an intranasal instillation of porcine pancreatic elastase (0.33 IU) and exposed to cigarette smoke for two months. The control group received the same treatment with saline (NaCl 0.9 %). Animals were exposed to CS for 30min, 2 times / day, 5 days a week. After two months, we observed increased mean linear intercept (LM) and positive cells for MAC-2, MMP-12 and GP91 in the airways and lung parenchyma and increase of elastic fibers in the lung parenchyma characterizing the presence of pulmonary emphysema. The instillation of porcine pancreatic elastase along the exposure to cigarette smoke increased susceptibility to the development of emphysema

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É possível que as alterações inflamatórias e estruturais nos pulmões com enfisema alterem a resposta dos mesmos à sepse influenciando no desenvolvimento da síndrome do desconforto respiratório agudo. Objetivo: Comparar a lesão pulmonar secundária à sepse, induzida por lipopolissacarídeo (LPS) intraperitoneal, em ratos com e sem enfisema induzido pela administração intratraqueal de elastase. Métodos: Vinte e quatro ratos Wistar adultos foram randomizados para quatro grupos de seis animais: controle (C-C), enfisema (E-C), controle com sepse (C-LPS) e enfisema com sepse (E-LPS). O enfisema foi induzido pela injeção intratraqueal de elastase pancreática de porco (12 UI/ animal). Após três semanas deste procedimento, a sepse foi induzida pela injeção intraperitoneal de LPS da Escherichia coli (10 mg/Kg). Vinte e quatro horas após a indução da sepse, os animais foram submetidos à ventilação mecânica por 10 minutos para posterior coleta da gasometria arterial. A seguir, foram eutanasiados e as seguintes análises foram realizadas: lavado broncoalveolar (LBA), permeabilidade pulmonar e histologia. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão ou mediana (intervalo interquartil), quando apropriado, e comparados por ANOVA seguida do teste de Tukey, ou por Kruskal-Wallis seguido do teste de Mann-Whitney. Resultados: O escore de lesão pulmonar foi significativamente maior nos grupos C-LPS [0,62 (0,19)] e E-LPS [0,59 (0,13)] em comparação com os grupos C-C [0,11 (0,09)] e E-C [0,15 (0,05)] (p < 0,05). A contagem total de células (C-LPS=2,37 ± 0,74; E-LPS=5,37 ± 0,13; C-C=0,73 ± 0,36; E-C=3,09 ± 7,53 x 105) e de neutrófilos [C-LPS=1,39 (1,48); E-LPS=4,39 (1,95); C-C=0,07 (0,11); E-C=0,68 (0,61) x 105] no LBA foi significativamente maior nos grupos C-LPS e E-LPS comparado aos grupos C-C e E-C (p < 0,05). Animais do grupo E-LPS apresentaram maior contagem de células totais e de neutrófilos no LBA em comparação com o grupo C-LPS (p < 0,05). Na avaliação da razão albumina LBA/soro, o grupo E-LPS apresentou aumento significativo quando comparado ao C-LPS [0,069 (1,243) vs. 0,007 (0,002), respectivamente, p < 0,05]. Não foram observadas diferenças significativas nas trocas gasosas entre os grupos. Conclusões: A presença de enfisema foi acompanhada de maior inflamação pulmonar em resposta à agressão sistêmica induzida pela injeção intraperitoneal de LPS, levando a uma maior lesão da barreira alvéolo-capilar. Palavras-chave: enfisema pulmonar, sepse, lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, elastase pancreática, lipopolissacarídeos. / Introduction: The response of lungs with emphysema to a systemic insult such as sepsis is not known. Structural and inflammatory abnormalities in lungs caused by emphysema might alter their response to sepsis and thus influence the incidence and severity of acute respiratory distress syndrome. We therefore aimed to compare the severity and extension of acute lung injury in response to intraperitoneal lipopolysaccharide (LPS) injection in rats with and without emphysema induced by elastase. Methods: Twenty four adult Wistar rats were randomized into 4 groups, each of them with 6 animals: control (C-C), emphysema without sepsis (E-C), control with sepsis (C-LPS) and emphysema with sepsis (E-LPS). Emphysema was induced by intratracheal instillation of pancreatic porcine elastase (12 IU/animal). Three weeks later, sepsis was induced by intraperitoneal Escherichia coli LPS injection (10 mg/kg). Twenty four hours after sepsis induction, animals underwent mechanical ventilation for 10 minutes and then blood was sampled for gasometric analysis. Thereafter, euthanasia and the following analysis were performed: BAL, lung permeability and histology. Results were expressed as mean ± standard deviation or median (interquartile range), when appropriate, and compared using ANOVA followed by Tukey test or Kruskal-Wallis followed by Mann-Whitney test. Results: Significant increase in lung injury score was observed in the C-LPS [0.62 (0.19)] and E-LPS [0.59 (0.13)] compared to the groups C-C [0.11 (0.09)] and E-C [0.15 (0.05)] (p < 0.05). Total cell (C-LPS=2.37 ± 0.74; E-LPS=5.37 ± 0.13; C-C=0.73 ± 0.36; E-C=3.09 ± 7.53 x 105) and neutrophil counts [C-LPS=1.39 (1.48); E-LPS=4.39 (1.95); C-C=0.065 (0.11); E-C=0.68 (0.61) x 105] in the BAL were significantly higher in the groups that received LPS (p < 0.05). Significantly higher total cell and neutrophil counts in the BAL were also observed in the E-LPS group compared to C-LPS (p < 0.05). The group E-LPS showed a significant increase in the BAL/serum albumin ratio compared to C-LPS [0.069 (1.243) vs. 0.007 (0.002), respectively] (p < 0.05). There were no significant differences in the gas exchange levels among the groups. Conclusions: The presence of emphysema increases the inflammatory response in the lungs to a systemic stimulus, represented in this model by the intraperitoneal injection of LPS.