Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lorena Cardoso Cintra.pdf: 4143916 bytes, checksum: 422ca8b39c01e66c797228b6083cedf8 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / The termodimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a human systemic mycosis of high prevalence in Latin America. P. brasiliensis is exposed to oxidative stress (OS) caused by reactive oxygen species (ROS) produced by the defense cells of the human host. When the invasion by pathogens occurs, the host defense system generates ROS to fight the invader. Inside the human host, P. brasiliensis is phagocytosed by macrophages, facing an extremely hostile environment due to nitric oxide and hydrogen peroxide. The Trx1 is an intracellular redox protein, which participates in the maintenance of cell redox homeostasis, both in terms of OS as reducer. It is ubiquitous and is characterized by typical CXXC active site, responsible for oxidation, reduction, or isomerization of proteins disulfide bonds. In a previous work, it was isolated, characterized and cloned into expression vector pGEX-4T-3 cDNA coding for TRX1 of P. brasiliensis (accession number AY376435). The recombinant protein (recPbTRX1) was produced and partially purified and the yeast cells of P. brasiliensis showed increased expression of the gene coding for PbTRX1 in response to OS. This study aimed the heterologous expression of cDNA of a thioredoxin of the fungus P. brasiliensis in Pichia pastoris, in order to obtain it in larger amounts for their subsequent biochemical characterization and application in biotechnological processes. The P. brasiliensis thioredoxin 1 (trx1) cDNA was obtained via PCR using the plasmid pGEX-Trx1 as template and cloned into expression vector pHIL-D2 and pPIC9 (for intracellular and extracellular expression). The insertion of the interested gene in the correct orientation was verified by sequencing and the homology was observed with Trx1 P. brasiliensis. These vectors were used to transform the P. pastoris yeast strain SMD1168 with his4- genotype. The presence of the cassette s expression was confirmed in the yeast s genome. No transformants able to secrete the protein from the building with the vector pPIC9 were detected and the intracellular production was carried from the pHIL-D2 vector. / O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis é agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica humana, com alta prevalência na América Latina. P. brasiliensis está sujeito a estresse oxidativo (EO) causado pelas espécies reativas de oxigênio (EROs), produzidas pelas células de defesa do hospedeiro humano. O sistema de defesa do hospedeiro quando da invasão por patógenos gera EROs para combater este invasor. P. brasiliensis ao penetrar no hospedeiro humano é fagocitado pelos macrófagos, enfrentando um ambiente extremamente hostil devido ao oxido nítrico e peróxido de hidrogênio. A Trx1 é uma proteína redox, intracelular, que participa da manutenção da homeostase redox da célula, tanto em condições de EO quanto redutor. É ubiquitária e caracterizada pelo sítio ativo típico CXXC, responsável pela oxidação, redução, ou isomerização das pontes dissulfeto de proteínas. Em trabalho realizado anteriormente, foi isolado, caracterizado e clonado em vetor de expressão pGEX4T-3 o cDNA codificante para Trx1 de P. brasiliensis (número de acesso AY376435). A proteína recombinante (recPbTRX1) foi produzida e parcialmente purificada e as células leveduriformes de P. brasiliensis apresentaram expressão aumentada do gene codificante para Pbtrx1 em condições de EO. O presente trabalho teve como objetivo a expressão heteróloga de uma tiorredoxina do fungo P. brasiliensis em Pichia pastoris, visando sua obtenção em maior quantidade para sua a posterior caracterização bioquímica e aplicação em processos biotecnológicos. O cDNA do gene da tiorredoxina 1 (trx1) de P. brasiliensis foi obtido via PCR utilizando como molde o plasmídeo pGEX-Trx1 e clonado no vetor de expressão pHIL-D2 e pPIC9 (para expressão intracelular e extracelular). A inserção do gene de interesse na orientação correta foi verificada por seqüenciamento, apresentando homologia com a Trx1 de P. brasiliensis. Estes vetores foram utilizados para transformar a linhagem SMD1168 da levedura P. pastoris com genótipo his4-. A presença do cassete de expressão foi confirmada no genoma da levedura. Não foram detectados transformantes capazes de secretar a proteína a partir da construção com o vetor pPIC9 e a produção intracelular foi realizada a partir do vetor pHIL-D2.

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A resposta imune adaptativa do tipo Th1 é necessária para proteção contra P. Brasiliensis. Sabendo que células dendrítica são APCs eficientes na ativação da resposta imune mediada por células, investigamos o potencial dessas células em iniciar a resposta imune inata em camundongos suscetíveis (B10.A) e resistentes (A/J) a PCM. Inicialmente, observamos que células dendríticas pulmonares de camundongos B10.A são mais fagocíticas quando comparadas com células de camundongos A/J. Além disso, observamos que a fagocitose na presença de laminarina foi inibida somente em células dendríticas pulmonares de animais B10.A. A produção de citocinas por células dendríticas pulmonares de camundongos A/J mostrou baixa concentração de IL-10, IL-12 e TNF-α. Ao contrário, células dendríticas pulmonares de camundongos B10.A produziram altas concentrações de TNF-α e IL-10, mas, a produção de IL-10 foi significativamente inibida na presença de laminarina. Nós também observamos que células dendríticas pulmonares de camundongos TLR-2KO foram deficientes na produção de IL-10. Além disso, a expressão gênica para TLR-2 aumentou após infecção em camundongos B10.A, mas não nos A/J. Posteriormente, observamos que a capacidade de células dendríticas pulmonares de camundongos suscetíveis em induzir ativação de células T foi diminuída. De acordo com nossos resultados, sugerimos que P. brasiliensis induz células dendríticas regulatórias em camundongos suscetíveis, os quais promovem a produção de IL-10, contribuindo para a suscetibilidade de camundongos B10.A contra a infecção por P. brasiliensis. / An adaptive Th1-type immune response is required for protection against P.brasiliensis. Knowing that DC are the most effective APCs for inducing cellmediated immune responses, it is thus important to investigate lung DC and their potential to initiate an immune response in mice susceptible and resistant to PCM. Initially, we observed that lung DC from susceptible mice were more phagocytic than cells from resistant mice and we observed that phagocytosis in the presence of laminarin was inhibited only in DC from susceptible mice. Cytokines produced by DC from resistant mice showed a low concentration of IL-10, IL-12 and TNF-α. In contrast, DC from susceptible mice produced a high concentration of TNF-α and IL-10, but IL-10 production was significantly inhibited in the presence of laminarin. We also observed that DC from TLR-2KO mice presented a defective production of IL-10. We found that the gene expression for TLR2 is increased after infection in B10.A, but not in A/J mice. Thus, the capacity of lung DC from susceptible mice in inducing T cell activation was decreased. In conclusion, our data suggest that P.brasiliensis induces regulatory DC in susceptible mice, which promotes IL-10 production contributing to the susceptibility of B10.A mice against P.brasiliensis infection.

A resposta imune adaptativa do tipo Th1 é necessária para proteção contra P. Brasiliensis. Sabendo que células dendrítica são APCs eficientes na ativação da resposta imune mediada por células, investigamos o potencial dessas células em iniciar a resposta imune inata em camundongos suscetíveis (B10.A) e resistentes (A/J) a PCM. Inicialmente, observamos que células dendríticas pulmonares de camundongos B10.A são mais fagocíticas quando comparadas com células de camundongos A/J. Além disso, observamos que a fagocitose na presença de laminarina foi inibida somente em células dendríticas pulmonares de animais B10.A. A produção de citocinas por células dendríticas pulmonares de camundongos A/J mostrou baixa concentração de IL-10, IL-12 e TNF-α. Ao contrário, células dendríticas pulmonares de camundongos B10.A produziram altas concentrações de TNF-α e IL-10, mas, a produção de IL-10 foi significativamente inibida na presença de laminarina. Nós também observamos que células dendríticas pulmonares de camundongos TLR-2KO foram deficientes na produção de IL-10. Além disso, a expressão gênica para TLR-2 aumentou após infecção em camundongos B10.A, mas não nos A/J. Posteriormente, observamos que a capacidade de células dendríticas pulmonares de camundongos suscetíveis em induzir ativação de células T foi diminuída. De acordo com nossos resultados, sugerimos que P. brasiliensis induz células dendríticas regulatórias em camundongos suscetíveis, os quais promovem a produção de IL-10, contribuindo para a suscetibilidade de camundongos B10.A contra a infecção por P. brasiliensis. / An adaptive Th1-type immune response is required for protection against P.brasiliensis. Knowing that DC are the most effective APCs for inducing cellmediated immune responses, it is thus important to investigate lung DC and their potential to initiate an immune response in mice susceptible and resistant to PCM. Initially, we observed that lung DC from susceptible mice were more phagocytic than cells from resistant mice and we observed that phagocytosis in the presence of laminarin was inhibited only in DC from susceptible mice. Cytokines produced by DC from resistant mice showed a low concentration of IL-10, IL-12 and TNF-α. In contrast, DC from susceptible mice produced a high concentration of TNF-α and IL-10, but IL-10 production was significantly inhibited in the presence of laminarin. We also observed that DC from TLR-2KO mice presented a defective production of IL-10. We found that the gene expression for TLR2 is increased after infection in B10.A, but not in A/J mice. Thus, the capacity of lung DC from susceptible mice in inducing T cell activation was decreased. In conclusion, our data suggest that P.brasiliensis induces regulatory DC in susceptible mice, which promotes IL-10 production contributing to the susceptibility of B10.A mice against P.brasiliensis infection.