Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos (GM-CSF) sobre a atividade fungicida de monócitos/macrófagos humanos in vitro contra o Paracoccidioides brasiliensis. Monócitos do sangue periférico (MO) e macrófagos derivados de monócitos humanos (M∅) foram ativados com diferentes concentrações de GM-CSF e, após 18 horas de incubação, foram desafiados com uma cepa de alta virulência do P. brasiliensis (Pb18). Em seguida, as células foram avaliadas quanto à atividade fungicida, pela técnica de plaqueamento e após 7-10 dias, foi realizada a contagem das Unidades Formadoras de Colônias (UFC). O GM-CSF ativou MO e M∅ para atividade fungicida contra o P. brasiliensis em uma maneira concentração-dependente, principalmente na concentração de 125 U/mL. Uma vez detectado esse papel, MO e M∅ ativados com GM-CSF foram desafiados novamente com o Pb18, desta vez na presença de inibidores de H2O2 (CAT) e de NO (L-NMMA) e, em seguida, submetidos à dosagem dos níveis de H2O2 e NO, para avaliação dos mecanismos efetores envolvidos. Os resultados permitem afirmar que houve uma associação entre a atividade fungicida apresentada e os níveis de H2O2 liberados. Além disso, o efeito sobre a atividade fungicida foi inibido pela CAT, confirmando o papel da H2O2 nesse processo. Em contrapartida, LNMMA não apresentou o mesmo efeito, sugerindo que o NO não está envolvido. Com base nesses dados, o papel do GM-CSF sobre as células fagocitárias humanas nos mecanismos de defesa contra o P. brasiliensis é discutido. / Abstract: The ability of recombinant human granulocyte-macrophage colonystimulating factor (GM-CSF) to activate human monocytes/macrophages for virulent Paracoccidioides brasiliensis killing was evaluated. Peripheral blood monocytes (MO) and monocyte-derived macrophages (M∅) were activated with different concentrations of GM-CSF. Afterwards, cells were challenged with P. brasiliensis strain 18 (Pb18) and the fungicidal activity was evaluated, plating and counting the Colony Forming Units (CFU) after 10 days. GM-CSF activated MO and M∅ for P. brasiliensis killling in a concentration-dependent manner. There was an association between this activity and the release of high levels of H2O2 by activated cells. Moreover, the killing effect was inhibited by Catalase (CAT), confirming the role of H2O2 in this process. On the contrary, L-Monomethyl- Arginine (L-NMMA) had no effect on fungicidal activity, suggesting that nitric oxide (NO) is not involved. Based on these data, the role of GM-CSF-activated human cells in the defense mechanisms against P. brasiliensis is discussed. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003Bitstream added on 2014-06-13T18:32:15Z : No. of bitstreams: 1 carmo_jpm_me_botfm.pdf: 303843 bytes, checksum: 6e9265ed2a58257ab001fe27aff138c6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos (GM-CSF) sobre a atividade fungicida de monócitos/macrófagos humanos in vitro contra o Paracoccidioides brasiliensis. Monócitos do sangue periférico (MO) e macrófagos derivados de monócitos humanos (M∅) foram ativados com diferentes concentrações de GM-CSF e, após 18 horas de incubação, foram desafiados com uma cepa de alta virulência do P. brasiliensis (Pb18). Em seguida, as células foram avaliadas quanto à atividade fungicida, pela técnica de plaqueamento e após 7-10 dias, foi realizada a contagem das Unidades Formadoras de Colônias (UFC). O GM-CSF ativou MO e M∅ para atividade fungicida contra o P. brasiliensis em uma maneira concentração–dependente, principalmente na concentração de 125 U/mL. Uma vez detectado esse papel, MO e M∅ ativados com GM-CSF foram desafiados novamente com o Pb18, desta vez na presença de inibidores de H2O2 (CAT) e de NO (L-NMMA) e, em seguida, submetidos à dosagem dos níveis de H2O2 e NO, para avaliação dos mecanismos efetores envolvidos. Os resultados permitem afirmar que houve uma associação entre a atividade fungicida apresentada e os níveis de H2O2 liberados. Além disso, o efeito sobre a atividade fungicida foi inibido pela CAT, confirmando o papel da H2O2 nesse processo. Em contrapartida, LNMMA não apresentou o mesmo efeito, sugerindo que o NO não está envolvido. Com base nesses dados, o papel do GM-CSF sobre as células fagocitárias humanas nos mecanismos de defesa contra o P. brasiliensis é discutido. / The ability of recombinant human granulocyte-macrophage colonystimulating factor (GM-CSF) to activate human monocytes/macrophages for virulent Paracoccidioides brasiliensis killing was evaluated. Peripheral blood monocytes (MO) and monocyte-derived macrophages (M∅) were activated with different concentrations of GM-CSF. Afterwards, cells were challenged with P. brasiliensis strain 18 (Pb18) and the fungicidal activity was evaluated, plating and counting the Colony Forming Units (CFU) after 10 days. GM-CSF activated MO and M∅ for P. brasiliensis killling in a concentration–dependent manner. There was an association between this activity and the release of high levels of H2O2 by activated cells. Moreover, the killing effect was inhibited by Catalase (CAT), confirming the role of H2O2 in this process. On the contrary, L-Monomethyl- Arginine (L-NMMA) had no effect on fungicidal activity, suggesting that nitric oxide (NO) is not involved. Based on these data, the role of GM-CSF-activated human cells in the defense mechanisms against P. brasiliensis is discussed.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:51:40Z : No. of bitstreams: 1 moreto_tc_me_botfm.pdf: 849370 bytes, checksum: d071bdf82901d445a21a6ee49c43f0c3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A identificação de exames laboratoriais adequados para a confirmação da hipótese clínica é importante em serviços de rotina para pacientes com paracoccidioidomicose (PCM) e foi o objetivo deste estudo. Realizou-se estudo retrospectivo de 401 pacientes com PCM atendidos de 1974 a 2008, na Área de Doenças Tropicais do Hospital das Clínicas – Faculdade de Medicina de Botucatu / UNESP. Foram analisadas, antes do tratamento, quatro técnicas diagnósticas - exame micológico direto (MD), citopatológico (CP), histopatológico (HP) e reação de imunodifusão dupla em gel de ágar (ID) para avaliação dos níveis de anticorpos séricos específicos. A comparação de duas proporções entre populações dependentes ou independentes foi feita pelo teste de Mc Nemar ou binomial.O grau de concordância entre dois testes foi avaliado através do Coeficiente Kappa. Para comparação de mais de duas populações dependentes foi utilizado o teste de Cochran. A comparação de múltiplas proporções para amostras seriadas foi feita pelo teste de Tukey e a comparação de duas proporções foi feita pelo teste Z. Para estudo da associação entre variáveis qualitativas foi utilizado o teste do qui-quadrado. Para as variáveis quantitativas, cujo objetivo era comparar grupos, foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. A rejeição da hipótese de nulidade foi vinculada a um erro tipo I ( ) igual ou menor que 0,05. Para a realização dos testes foi utilizado o programa computacional SAS-The Statistical Analysis System, versão 6.12. Homens (88,0%) e forma crônica (76,8%) predominaram. A distribuição de pacientes de acordo com o primeiro atendimento não apresentou diferença. Identificação da fase leveduriforme típica de P. brasiliensis foi possível em 86% dos pacientes enquanto 14% deles apresentaram apenas a sorologia positiva. O exame micológico direto foi realizado... / Identification of appropriate laboratory measurements to confirm a clinical hypothesis is important in a routine service for paracoccidioidomycosis patients and constituted the objective of this study. Clinical records and laboratory cards of 401 paracoccidioidomycosis patients seen at the Tropical Diseases Area – Botucatu Medical School (São Paulo, Brazil) from 1974 to 2008 were reviewed. Direct mycological examination (DM), cell block preparation (CB), histopathological examination (HP), and specific antibodies serum levels evaluated through double agar gel immunodiffusion test (ID) were evaluated before treatment. Statistical analysis: the comparison between proportions for dependent or independent populations was made by the McNemar test or Binomial. The agreement between methods was evaluated using the Kappa Coefficient. The comparison of more than two dependent populations was made by the Cochran Test. The comparison of multiple proportions was done by Tukey test and for two proportions by Z test. In order to study the association between qualitative variables the chi-square test was used. For quantitative variables, whose objective was to compare groups, the nonparametric Kruskal-Wallis test was used. The software SAS – The Statistical Analysis System, version 6.12, was used. The significance was set up at p<0.05. Males (88.0%) and chronic form (76.8%) predominated. Patients distribution according to period of assistance presented no differences. Typical P. brasiliensis yeast forms were identified in clinical specimens in 86% of the patients while 14% of them showed only a positive serological test. Direct mycological examination carried out in 51 different tissue specimens showed 74.5% of sensitivity. The sensitivity was 62.5% in 112 sputum samples. Cell block preparation carried out in 483 sputum samples showed 55.3% of sensitivity. Histopathological examination carried out... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003Bitstream added on 2014-06-13T20:31:22Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_dr_me_botfm.pdf: 316766 bytes, checksum: 5e468eb208affcc63849ee03a0e7f53c (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O papel de citocinas sobre a atividade antifúngica de polimorfonucleares (PMNs) humanos contra o Paracoccidioides brasiliensis não está ainda totalmente esclarecido. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o papel das citocinas: IFN-g, TNF-a e GM-CSF sobre a atividade fungicida e fungistática de neutrófilos humanos contra a cepa de alta virulência ( cepa 18) do P. brasiliensis. Estes efeitos foram testados em coculturas de curta (4h) e longa duração (24 e 48h). PMNs não ativados não apresentaram atividade antifúngica. Porém, células pré-ativadas com IFN-g apresentaram efeito fungicida em cocultura de curta duração (4h). Entretanto, não foi observada atividade fungicida ou fungistática nas coculturas de longa duração (24 e 48h).Os PMNs ativados com TNF-a exibiram atividade fungicida em coculturas de curta e longa duração (4 e 24h), enquanto GM-CSF estimulou PMNs tanto para atividade fungicida, como fungistática em coculturas de curta e longa duração (4, 24 e 48h). Os efeitos antifúngicos de IFN-g e TNF-a foram inibidos quando foram adicionadas às coculturas catalase (CAT) ou superóxido dismutase (SOD), demonstrando o papel de H2 O2 e do ânion superóxido no processo. Para as células ativadas com GM-CSF, o ânion superóxido foi o principal metabólito envolvido. Com base nestes dados, o papel das células polimorfonucleares nos estágios iniciais e tardios de desafio com o P. brasiliensis é discutido. / Fungicidal and fungistatic activity of human polymorphonuclear leukocytes (PMNs ) against high virulent strain of Paracoccidioides brasiliensis were studied. These effects were tested in short term ( 4h ) and long term cocultures ( 24h and 48h ). Nonactivated PMNs failed to exhibit antifungal activities in all studied periods. However if these cells were IFN-g activated they presented fungicidal effect at 4h of cocultures. However no activity, fungistatic or fungicidal, were detected in further times. TNF-a activated PMNs exhibit fungicidal activity at 4h and 24 h, while GMCSF stimulated PMN to fungicidal and fungistatic activities in short and long terms cocultures. The antifungal effects of IFN-g and TNF-a were inhibited or abrogated when P. brasiliensis challenge occurred in presence of catalase (CAT) and superoxide dismutase ( SOD ) showing the role of H2 O2 and superoxide anion in antifungal activities . For GM-CSF activated cells superoxide anion was the main metabolite involved. Based on these data the role of PMNs cells in early and later stages of P. brasiliensis is discussed.

Orientador: Oslei Paes de Almeida / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-23T14:15:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Villalba_Halbert_M.pdf: 2103763 bytes, checksum: ba11199d0d19d14c960d598d49731101 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica que freqüentemente envolve a mucosa bucal, provocando lesões de aspecto granular, eritematoso e ulcerado, chamado de moriforme. Embora os aspectos microscópicos da paracoccidioidomicose sejam bem conhecidos, não há descrições detalhadas e quantitativas das características histológicas da paracoccidioidomicose bucal. O objetivo deste trabalho foi descrever, quantificar e correlacionar as principais características microscópicas de 64 biópsias de paracoccidioidomicose bucal. Os cortes histológicos foram corados com H/E, P.A.S. e Gomori Grocott. Os parâmetros avaliados foram a inflamação crônica mononuclear, microabscessos, granulomas, células multinucleadas, Paracoccidioides brasiliensis, eosinófilos e hiperplasia pseudoepiteliomatosa. Na maioria dos casos predominou infiltrado mononuclear, com quantidade variável dos demais parâmetros avaliados. As partículas fúngicas, com ou sem brotamento, foram observadas principalmente no interior das células gigantes, dentro ou fora dos granulomas. A partir dos dados quantitativos, concluiu-se não haver correlação entre os vários parâmetros analisados, exceto entre a quantidade de fungos com e sem brotamentos. O mesmo material utilizado neste trabalho está sendo estudado com o auxílio de sistema de imagem, assim como por imunocitoquímica para confirmação ou não dos resultados descritos / Abstract: Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis that frequently involves the buccal mucosa, causing granular, eritematous and ulcerated lesions, called mulberry-like (framboesiform). Although the microscopic features of paracoccidioidomycosis are well-known, there are no detailed descriptions and quantitative evolution in the histological characteristics of the oral lesions. The aim of this work was to describe, quantify and correlate the main microscopic aspects of 64 biopsies of the oral mucosa. Paraffin sections were stained with H/E, P.A.S. and Gomor Grocott. The folowing parameters were analysed: mononuclear chronic inflammation, microabscess, granuloma, giant cells, Paracoccidioides brasiliensis, eosinophil and pseudoepitheliomatous hyperplasia. In most cases there was a mononuclear infiltrate predominance, with variable amounts of the other parameters considered. The fungic particles, with multiple or without budding, were observed mainly in the giant cells, in or out of the granulomas. The quantitative data, indicated that there was no correlation among the various parameters analysed, except between the quantity of fungi with and without budding. The same material used in this work is now being studied with the help of an image analysing system and by imunocytochemistry technics to confirm or not the results here described. / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental

Orientadores: Maria Heloisa Souza Lima Blotta, Ronei Luciano Mamoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T03:44:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfim_CamilaVicente_M.pdf: 3813230 bytes, checksum: eb3f394047f0186a26e4456a537b819c (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, que pode apresentar-se sob diferentes formas clínicas, dependendo da resposta imunológica do hospedeiro. Trabalhos recentes têm demonstrado a importância da resposta inata no direcionamento da resposta adaptativa. Células do sistema imune inato reconhecem patógenos por meio de receptores de reconhecimento padrão (PRRs). Dentre esses, podemos destacar a família dos receptores do tipo Toll (TLRs) e dos receptores de lectina do tipo C (CLRs), que possuem membros capazes de reconhecer antígenos fúngicos. Nosso trabalho teve por objetivo avaliar a expressão de TLR-1, TLR-2, TLR-4 e dectina-1 (CLR) em macrófagos e neutrófilos de indivíduos saudáveis, após exposição a células leveduriformes das cepas de alta (Pb 18) e baixa (Pb265) virulência de P. brasiliensis. Como controle positivo foram utilizados os ligantes específicos para TLR-4 (LPS) e TLR-2 e dectina-1 (zimosan). A análise por citometria de fluxo revelou a redução da expressão de TLRs e dectina-1, mais evidente em monócitos do que em neutrófilos e após 30 minutos de estimulação, indicando que o reconhecimento dos antígenos fúngicos resulta na rápida internalização dos receptores. Houve uma tendência a um aumento da expressão relativa do RNAm de TLR-2 e dectina-1 em resposta à estimulação fúngica, em especial à cepa Pb265. A análise da produção de citocinas (RNAm e proteína) mostrou que as células fúngicas induzem a produção de citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias, mas razão TNF-a/IL-10 diminuída em resposta ao zimosan e leveduras Pb265 indica uma produção relativa maior IL-10 nestas condições, enquanto que o estímulo com Pb18 privilegia a produção de TNF-a. Leveduras de P. brasiliensis também estimulam a elevada produção de PGE2 tanto por macrófagos como por neutrófilos, indicando a importância deste mediador na relação parasita-hospedeiro. Em conjunto, nossos resultados sugerem a participação do TLR-2, TLR-4 e dectina-1 no reconhecimento e internalização do fungo, e conseqüente ativação da resposta imunológica ao P. brasiliensis. Além disso, no caso da infecção por Pb265 a indução de uma resposta inflamatória exacerbada seria contrabalançada pela maior produção de IL-10, o que levaria a um melhor controle da infecção pelo hospedeiro. / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is an endemic mycosis in Latin America caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The pattern of the immune responses to P. brasiliensis determines the disease progression and clinical outcome. Innate immune response is mediated by phagocytic cells, such as macrophage and neutrophils, which ingest and kill invading pathogens and then trigger the adaptive immune system through the secretion of cytokines and chemokines. The C-type like lectin receptors (CLR) and Toll-like receptors (TLRs) are the two main PRRs for fungal cells. The purpose of the present study was to evaluate the expression of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and dectin-1 (CLR) in monocytes and neutrophils from healthy individuals after stimulation with Pb18 (high virulence) and Pb265 (low virulence) yeasts of P. brasiliensis. As positive controls we used specific ligands to TLR-4 (LPS), TLR-2 and dectin-1 (zymosan). Our results demonstrated a decreased of TLRs and dectin-1 expression more evident on monocytes than on neutrophils as soon as 30 minutes after yeast cells stimulation. This decrease was similar to the one caused by zymosan stimulation and indicates that up binding the complexes are rapidly internalized. There was a tendency towards an increased TLR2 and dectin-1 mRNA expression in response to fungal cells, mainly Pb265. P. brasiliensis yeast cells induced the production of proinflammatory and antinflammatory cytokines (mRNA and protein) but the low ratio between TNF-a and IL-10 in response to zymosan and Pb265 point out to a preferential production of IL-10, while Pb18 predominantly induced TNF-a secretion. P. brasiliensis yeast cells also induced an elevated PGE2 production by monocytes and neutrophils showing the important role of this mediator in fungushost relationship. Altogether our results suggest the participation of TLR2, TLR-4 and dectin-1 in P. brasiliensis recognition and internalization and consequent activation of the immune response against the fungus. Moreover, concerning Pb265 stimulation the induction of an exacerbate inflammatory response could be counterbalanced by an increased IL-10 production, resulting in an efficient control of the infection by the host. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-12Bitstream added on 2014-06-13T20:21:27Z : No. of bitstreams: 1 takahagi_en_dr_botib.pdf: 614550 bytes, checksum: a7740b5af41df8726b1c4a6469ca54e5 (MD5) / Receptores Toll-like RECONHECER componentes distintos da FUNGOS para iniciar a resposta imune inata. Examinamos se Paracoccidioides brasiliensis OU SEUS gp43 antígenos imunodominantes pode modular IN VITRO E TLR2 TLR4 expressão e produção TRIGGER citocinas por monócitos humanos. Monócitos de indivíduos saudáveis ​​foram incubadas com gp43 LYPOPOLYSACCHARIDE, (LPS) ou mortas pelo calor FORMAS leveduriforme do P. brasiliensis em uma proporção de 50 monócitos por célula fúngica (Pb18) a 37 º C por 4h e 18h. A EXPRESSÃO DE TLR2 E TLR4 SOBRE SUPERFÍCIE monócitos, e TNF-alfa, IL-10 e IL-12p40 PRODUÇÃO foram determinados por citometria de fluxo e ELISA respectivamente. Os resultados mostraram que a estimulação de monócitos COM OU LPS Pb18 PROMOVIDO UP-regulação da expressão TLR2 E TLR4 SOBRE SUPERFÍCIE EM RELAÇÃO monócitos às células não-estimulados EM AMBAS AS 4H e 18h de cultura, e aumentaram os níveis de TNF-alfa, IL- 10 e IL-12p40 PRINCIPALMENTE EM 18H DA CULTURA. POR OUTRO LADO, E EXPRESSÃO TLR4 BAIXA ALTA TLR2 são evocados por gp43 AT 4H DA CULTURA, associadas a altos níveis de TNF-alfa. No entanto, após 18H UMA MUDANÇA DE ALTA E BAIXA TLR2 TLR4 EXPRESSÕES foi seguido por elevados níveis de IL-10 e IL-12p40. Estes resultados sugerem que a gp43 pode induzir um desequilíbrio entre RESPOSTAS pró e anti-inflamatório em FUNGOS-monócitos interações, um efeito modulatório na CAMINHO TLR. AS TNF-alfa pode estar envolvida na patogênese da paracoccidioidomicose, O EFEITO regulatórios induzidos por gp43, VIA upregulation de TLR2 EXPRESSÃO E IL-10 produção, pode ser importante para proteger contra a lesão de tecido que é descrito neste micose. / Toll-like receptors recognize distinct components of fungi to initiate the innate immune íesponse. We examined whether Paracoccidioides brasiliensis ar its immunodominant antigen gp43 can modulate in vitro TLR2 and TLR4 expression and trigger cytokine production by human monocytes. Monocytes from healthy individuaIs were incubated with gp43, IypopoIysaccharide (LPS) or heat-killed yeast forms of P. brasiliensis in a ratio of 50 monocytes per funga! cell (pb 18) at 37°C for 4h and I8h. The expression of TLR2 and TLR4 on monocyte surface, and TNF-alpha, IL-Io and IL-I2p4o production were determined by flow cytometry and ELISA respectiveIy. The results showed that monocyte stimuIation with LPS ar Pb18 promoted up-reguIation ofthe TLR2 and TLR4 expression on monocyte surface in reIation to the non-stimuIated cells at both 4h and I8h ofculture, and induced higher IeveIs ofTNF-aIpha, IL-Io and IL-12p4o mainly at I8h of culture. On the other hand, high TLR4 and low TLR2 expression were elicited by gp43 at 4h of cuIture, associated with higher Ievels of TNF-aIpha. However, after 18h a change to high TLR2 and !ow TLR4 expressions was followed by e1evated levels of IL-Io and IL-12p4o. These results suggest that gp43 might induce an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in fungal-monocyte interactions by a modulatory effect on TLR pathway. As TNF-alpha may be invoIved in the pathogenesis of paracoccidioidomycosis, the regulatory effect induced by gp43, via upregulation of TLR2 expression and IL-Io production, can be important to protect against tissue injury which is described in this mycosis.

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Silvio Luis de Oliveira / Banca: José Maurício Sforcin / Banca: Sueli Aparecida Calvi / Banca: Carlos Artério Sorgi / Banca: Wafa Hanna Koury Cabrera / Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. Dentre os vários mecanismos da resposta inata contra esse fungo, os envolvendo as células fagocitárias desempenham papel central na contenção do processo infeccioso, com destaque para a participação na atividade fungicida e modulação da resposta inflamatória. As funções das células fagocitárias contra os diversos microrganismos, incluindo os fungos, são iniciadas a partir de mecanismos de ativação dessas células, gerados após o reconhecimento dos mesmos por receptores de reconhecimento de estruturas moleculares padrões (PRRs) que reconhecem estruturas moleculares compartilhadas por determinados grupos de microrganismos, os chamados padrões moleculares associados à patógenos (PAMPS). Nosso estudo objetivou estudar a participação dos receptores TLR2, TLR4, receptor de manose (MR) e dectina-1, na produção de citocinas pró e anti-inflamatórias e dos eicosanóides PGE2 e LTB4, por monócitos e neutrófilos humanos em resposta a cepas de P. brasiliensis de alta (Pb18) e baixa virulência (Pb265). Verificamos que as duas cepas do fungo, mas principalmente a Pb265 são capazes de induzir a produção de TNF- por monócitos. TLR2 e TLR4 foram os receptores que se mostraram mais envolvidos nesse processo. Adicionalmente, mostramos a capacidade de essas células liberarem IL-12 em resposta ao fungo, sendo os maiores níveis detectados para a cepa Pb265 e ocorrendo um importante papel do TLR4 e MR. Altos níveis de IL-10 também foram detectados, principalmente em resposta à cepa Pb18 para a qual houve um envolvimento do TLR2 e do MR. Para a cepa 265, o receptor de maior envolvimento foi o TLR2. As duas cepas, de forma semelhante, foram capazes de induzir uma maior produção de PGE2 e LTB4 pelos monócitos. No entanto, nenhum dos PRRs mostrou-se envolvido na produção dos ... / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidiodomycosis, the most prevalent deep mycosis in Latin America. During the innate immune response of the host against this fungus, phagocytic cells play an essential role, highlighting their participation in fungicidal activity and modulation of the inflammatory response. The functions of phagocytic cells against various microorganisms, including fungi, are initiated by the recognition of patterns molecular structures, shared by a group of microorganisms, called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), by pattern recognizing receptors (PRRs) expressed by these cells. In this study, we assessed the involvement of the PRRs : TLR2, TLR4, mannose receptor (MR) and dectin-1, in the production of pró and anti-inflammatory cytokines and the eicosanoid PGE2 and LTB4, by human monocytes and neutrophils in response to high- (Pb18) and a low- (Pb265) virulence strain of P. brasiliensis. We showed that monocytes produce TNF-alpha and IL-12 in response to both strains, but with higher levels to Pb 265. TLR2 and TLR4 were the main receptors involved in TNF-alpha production, while for IL-12, the participation of TLR4 and MR was detected. High levels of IL-10 were also observed, mainly in response to Pb18, with involvement of TLR2 and MR. For Pb265, the receptor responsible was TLR2. Boths strains were able to induce PGE2 and LTB4 by monocytes. However, none of the studied receptors was shown to be involved in this production. Neutrophils did not produce TNF-alpha in response to both strains. On the other hand, these cells produce IL-12, mainly in response to Pb265, with participation of TLR2, dectin-1 and TLR4. These cells also produce L-10, whose levels were higher for Pb18 with involvement of TLR2 and MR and only TLR2 for Pb265. The production of PGE2 and LTB4 was also detected for these cells, similarly for the two strains. For PGE2, it ... / Doutor

A esquistossomose, doença causada pelo parasito Schistosoma mansoni, é um problema de saúde mundial. A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica humana, causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, e pode coinfectar o hospedeiro portador de S. mansoni. Na confecção por S. mansoni, o sistema imune do hospedeiro pode estar suprimido, o que acarreta uma defesa insuficiente para eliminação de outros microrganismos. Até o momento, existem poucos trabalhos que descrevem a evolução da esquistossomose e da paracoccidioidomicose em casos de coinfecção. Além disto, devido a correntes migratórias, indivíduos de áreas endêmicas para esquistossomose podem se instalar em áreas endêmicas para PCM e vice versa. Considerando estes antecedentes, este trabalho teve como objetivo analisar aspectos histopatológicos e imunológicos do desenvolvimento do granuloma esquistossomótico durante a coinfecção Para isto, camundongos Swiss fêmeas foram separados em 4 grupos para fase aguda e 4 grupos para fase crônica, com 10 animais em cada: controle não infectado - CNI, infectado com S. mansoni - Sm, infectado com P. brasiliensis - Pb, coinfectado - Sm+Pb, ambos em fase crônica, e coinfectados sendo Sm fase crônica e Pb fase aguda - Sm(c)+Pb(a). Os camundongos foram necropsiados após 50 (fase aguda) e 120 dias (fase crônica) para análise quanto ao peso, sobrevida, desenvolvimento do granuloma e produção de citocinas. Em relação ao peso, observou-se que não houve alterações no peso dos camundongo após 50 dias. Já para a fase crônica, foi observado ganho significativo de peso no grupo Pb. Para a sobrevida, em fase aguda, observou-se 10% de óbitos no grupo Sm. Já para fase crônica, 50% de óbitos para o grupo Sm, 60% do grupo Sm+Pb e 50% do grupo Sm(c)+Pb(a) foram observados ao final do experimento. A ocorrência da coinfecção foi evidenciada a partir da visualização de granulomas no fígado e no pulmão, e a presença de fungo no epiplon. A contagem de granulomas no fígado (fase aguda e crônica) e pulmão (fase crônica), não apresentou diferenças significativas. Em relação ao diâmetro dos granulomas no fígado em fase aguda, estes foram significativamente maiores no grupo Sm (0,08±0,05 mm²) quando comparado ao grupo Sm+Pb (0,06±0,05mm²). Na fase crônica, o diâmetro foi significativamente maior quando comparados os grupos Sm+Pb (0,03±0,01mm²) ao Sm(c)+Pb(a) (0,02±0,01mm²). Em relação ao pulmão, houve diferenças significativas elevadas quando comparados os grupos Sm (0,01±0,009mm²) com Sm+Pb (0,03±0,01mm²) e Sm(C)+Pb(A) (0,03±0,02mm²). Foram evidenciadas células mononucleares e polimorfonucleares nos granulomas de fígado e pulmão em todos os grupos estudados, tanto em fase aguda e crônica. Em fase aguda, a contagem de eosinófilos e neutrófilos não obteve diferenças significativas em relação aos tipos celulares, apesar de um número maior de neutrófilos serem observados no grupo Sm+Pb (7,82±5,95). Na fase crônica, verificamos que no grupo Sm houve um predomínio significativo de eosinófilos (17,34±6,71), enquanto nos grupos Sm+Pb e Sm(c)+Pb(a) o predomínio foi de neutrófilos (18,82±8,18 e 12,72±4,44, respectivamente). No pulmão, não houve diferença em relação ao número de eosinófilos presentes nos granulomas, já o número de neutrófilos no grupo Sm(c)+Pb(a) (2,66±2,71) que foi significativamente menor em comparação aos grupos Sm (9,62±7,76) e Sm+Pb (8,06±5,40). Os resultados da análise de citocinas nos diferentes grupos mostram um aumento significativo de IFN-γ nos grupos Sm (8,05±3,52ng/ml) e Pb (10,40±3,549ng/ml) em relação ao CNI (1,14±0,48 ng/ml). A citocina IL-2 apresentou níveis significativamente mais elevados nos grupos Sm (6,71±1,50ng/ml), Pb (10,40±3,54ng/ml) e Sm+Pb (7,32±2,93ng/ml), quando comparados ao grupo CNI (2,01± 0,39ng/ml). Para IL-4, houve diferenças significativas elevadas entre os grupo Sm (10,45±3,67ng/ml) quando comparados ao grupo CNI (0,85±0,15ng/ml). Para IL-5, diferenças significativas foram encontradas nos grupos Sm (3,91±0,61ng/ml), Pb (3,98±1,76 ng/ml) e Sm+Pb (4,28±2,22ng/ml), quando comparados ao CNI (0,67±0,21ng/ml). Em fase crônica, foram observados níveis significativamente elevados de IFN-γ no grupo Sm (10,45± 3,67ng/ml) comparado ao CNI (1,14±0,48ng/ml). Para IL-2, houve diferenças significativas elevadas nos grupos Sm (7,90±3,16ng/ml) e Pb (7,54±1,41ng/ml), quando comparados ao CNI (2,01±0,39ng/ml). Para IL-4 e IL-5, diferenças significativas elevadas foram observadas para o grupo Sm (8,46±3,71ng/ml e 4,47±1,88ng/ml, respectivamente) quando comparados ao CNI (0,85±0,15ng/ml e 0,67± 0,21 ng/ml, respectivamente). Em relação a MIP-2, não foram observados diferenças significativas entre os grupos, tanto para fase aguda e crônica. Sendo assim, os dados sugerem que a coinfecção por P. brasiliensis pode influenciar na composição celular dos granulomas esquistossomóticos e nos níveis de citocinas. / Schistosomiasis, also known as snail fever, a disease caused by the parasite Schistosoma mansoni, is a worldwide health issue. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a human systemic mycosis caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis and it may coinfect the bearing host of S. mansoni. In the coinfection by S. mansoni, the host immune system may be suppressed which results in an insufficient defense in order to obliterate other microorganisms. There are few studies so far describing the evolution of schistosomiasis and paracoccidioidomycosis in the case of coinfection. Furthermore, due to migration, people from schistosomiasis endemic areas may settle down in PCM endemic areas and vice versa. Considering the given background, this study had as main goal the analysis of histopathological and immunological aspects of the development of schistosomotic granuloma under the coinfection. Thereunto, Swiss female mice were separated in four groups for acute phase and five groups for chronic phase containing ten animals each: control not infected - CNI, infected with S. mansoni - Sm, infected with P. brasiliensis - Pb, coinfected – Sm+Pb, both in chronic phase, and coinfected Sm in chronic phase and Pb in acute phase – Sm(c)+Pb(a). The mice were necropsied after 50 days (acute phase) and 120 days (chronic phase) for analysis concerning their weight, survival rate, granuloma development and cytokine production. Regarding the weight, it was observed the Pb group had gained significantly weight (26,23±5,36g). Concerning the survival rate, in acute phase, it was observed 10% of deaths in the Sm group; as for the chronic phase, 50% of deceased for Sm group, 60% for Sm+Pb group and 50% for Sm(c)+Pb(a) by the end of the experiment. The coinfection occurrence was demonstrated by granuloma visualization in the liver and lung, and presence of the fungus in the omentum. The granuloma count in the liver (acute and chronic phases) and lung (chronic phase) did not display any meaningful differences. Regarding the diameter of the granulomas in the liver in acute phase, it was meaningfully bigger than Sm group (0,08±0,05 mm²) when compared to Sm+Pb group (0,06±0,05mm²). In the chronic phase, the diameter was quite bigger when compared to Sm+Pb (0,03±0,01mm²) and Sm(c)+Pb(a) (0,02±0,01mm²) groups. Toward the lung , there were high significant differences when compared Sm groups (0.01 ± 0,009mm²) with Sm+Pb (0.03 ± 0,01mm² ) and Sm(C)+Pb(A) (0.03 ± 0,02mm²) .Mononuclear and polymorphnuclear cells of liver and lung granulomas were evidenced in all groups both in acute and chronic phases. In acute phase, the eosinophil and neutrophils counts did not have meaningful distinctions regarding the cell types, although a bigger number of neutrophils were observed in Sm+Pb group (7,82±5,95). In chronic phase, it was verified a distinguished prevalence of eosinophils (17,34±6,71) in Sm group, whilst Sm+Pb and Sm(c)+Pb(a) groups neutrophils prevailed (18,82±8,18 e 12,72±4,44, respectively). In the lung, there were not any differences in regard of eosinophil number in granulomas, while the number of neutrophils in Sm(c)+Pb(a) group (2,66±2,71) was really smaller than Sm (9,62±7,76) and Sm+Pb (8,06±5,40) groups. The results of cytokine analysis from those different groups display a distinguished augmentation of IFN-γ in Sm (8,05±3,52ng/ml) and Pb (10,40±3,549ng/ml) groups regarding the CNI (1,14±0,48 ng/ml), however this increase observed in Sm+Pb group (4,96±1,73ng/ml) wasn’t meaningful at all. The cytokine IL-2 displayed notably higher levels in Sm (6,71±1,50ng/ml), Pb (10,40 3,54±ng/ml) and Sm+Pb groups (7,32±2,93ng/ml) when compared to CNI (2,01± 0,39ng/ml). As for IL-4, there were expressive high differences between Sm (10,45±3,67ng/ml), Pb (3,98±1,76 ng/ml) and Sm+Pb groups (4,28±2,22ng/ml) regarding CNI (0,67±0,21ng/ml). For IL-5, significant differences were found in groups Sm (3.91 ± 0,61ng / ml), Pb (3.98 ± 1.76 ng / ml) and Sm + Pb (4.28 ± 2,22ng / ml) compared to the CNI (0.67 ± 0,21ng / ml). In chronic phase, it was observed denoting high levels of IFN-γ in Sm group (10,45± 3,67ng/ml) when compared to CNI (1,14±0,48ng/ml). Concerning IL-2, there were compelling differences from Sm (7,90±3,16ng/ml) and Pb groups (7,54±1,41ng/ml), in regard of CNI (2,01±0,39ng/ml). As for IL-4 and IL-5, expressively high distinctions were observed in Sm (8,46±3,71ng/ml and 4,47±1,88ng/ml, respectively) concerning CNI (0,85±0,15ng/ml and 0,67± 0,21 ng/ml, respectively). Regarding MIP-2, it was not observed any important differences among the groups as for the acute or chronic phases, nevertheless these display higher levels in acute phase rather than in chronic phase. Thus, the data suggest the coinfection by P. brasiliensis may affect the cellular composition from schistosomotic granulomas and cytokine levels.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:41:50Z : No. of bitstreams: 1 000741932.pdf: 2507197 bytes, checksum: f30c63e246b50ee2a82790109f418fe8 (MD5) / O Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. Dentre os vários mecanismos da resposta inata contra esse fungo, os envolvendo as células fagocitárias desempenham papel central na contenção do processo infeccioso, com destaque para a participação na atividade fungicida e modulação da resposta inflamatória. As funções das células fagocitárias contra os diversos microrganismos, incluindo os fungos, são iniciadas a partir de mecanismos de ativação dessas células, gerados após o reconhecimento dos mesmos por receptores de reconhecimento de estruturas moleculares padrões (PRRs) que reconhecem estruturas moleculares compartilhadas por determinados grupos de microrganismos, os chamados padrões moleculares associados à patógenos (PAMPS). Nosso estudo objetivou estudar a participação dos receptores TLR2, TLR4, receptor de manose (MR) e dectina-1, na produção de citocinas pró e anti-inflamatórias e dos eicosanóides PGE2 e LTB4, por monócitos e neutrófilos humanos em resposta a cepas de P. brasiliensis de alta (Pb18) e baixa virulência (Pb265). Verificamos que as duas cepas do fungo, mas principalmente a Pb265 são capazes de induzir a produção de TNF- por monócitos. TLR2 e TLR4 foram os receptores que se mostraram mais envolvidos nesse processo. Adicionalmente, mostramos a capacidade de essas células liberarem IL-12 em resposta ao fungo, sendo os maiores níveis detectados para a cepa Pb265 e ocorrendo um importante papel do TLR4 e MR. Altos níveis de IL-10 também foram detectados, principalmente em resposta à cepa Pb18 para a qual houve um envolvimento do TLR2 e do MR. Para a cepa 265, o receptor de maior envolvimento foi o TLR2. As duas cepas, de forma semelhante, foram capazes de induzir uma maior produção de PGE2 e LTB4 pelos monócitos. No entanto, nenhum dos PRRs mostrou-se envolvido na produção dos... / Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidiodomycosis, the most prevalent deep mycosis in Latin America. During the innate immune response of the host against this fungus, phagocytic cells play an essential role, highlighting their participation in fungicidal activity and modulation of the inflammatory response. The functions of phagocytic cells against various microorganisms, including fungi, are initiated by the recognition of patterns molecular structures, shared by a group of microorganisms, called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), by pattern recognizing receptors (PRRs) expressed by these cells. In this study, we assessed the involvement of the PRRs : TLR2, TLR4, mannose receptor (MR) and dectin-1, in the production of pró and anti-inflammatory cytokines and the eicosanoid PGE2 and LTB4, by human monocytes and neutrophils in response to high- (Pb18) and a low- (Pb265) virulence strain of P. brasiliensis. We showed that monocytes produce TNF-alpha and IL-12 in response to both strains, but with higher levels to Pb 265. TLR2 and TLR4 were the main receptors involved in TNF-alpha production, while for IL-12, the participation of TLR4 and MR was detected. High levels of IL-10 were also observed, mainly in response to Pb18, with involvement of TLR2 and MR. For Pb265, the receptor responsible was TLR2. Boths strains were able to induce PGE2 and LTB4 by monocytes. However, none of the studied receptors was shown to be involved in this production. Neutrophils did not produce TNF-alpha in response to both strains. On the other hand, these cells produce IL-12, mainly in response to Pb265, with participation of TLR2, dectin-1 and TLR4. These cells also produce L-10, whose levels were higher for Pb18 with involvement of TLR2 and MR and only TLR2 for Pb265. The production of PGE2 and LTB4 was also detected for these cells, similarly for the two strains. For PGE2, it ...