Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Wafa Hanna Koury Cabrera / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: A IL-15 é uma citocina próinflamatória produzida principalmente por monócitos e macrófagos em resposta a agentes infecciosos, desempenhando importante papel modulador na imunidade inata e adaptativa. No caso de infecções por microrganismos intracelulares como algumas bactérias, protozoários e fungos destaca-se o papel da IL-15 no mecanismo de ativação de monócitos/ macrófagos e neutrófilos, processo que representa um importante mecanismo de defesa já em períodos precoces da infecção durante o desenvolvimento da resposta imune inata. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da IL-15 sobre a atividade fungicida de neutrófilos humanos desafiados com cepa virulenta do P. brasiliensis (Pb 18). Adicionalmente, testamos se essa atividade seria mediada por produtos do metabolismo oxidativo como anion superóxido e H2O2 e se estaria associada a alterações nos níveis das citocinas IL-8 e TNF- alfa. Neutrófilos do sangue periférico de indivíduos saudáveis , foram incubados na ausência ou presença de IL-15 (12,5 a 250 ng/mL) por 18h a 370C em tensão de 5% de CO2, infectados com Pb 18 por 4h e avaliados quanto a atividade fungicida , produção de ânion superóxido, H2O2 e quantificação nos sobrenadantes das citocinas TNF-a e IL-8. A préincubação de neutrófilos com IL-15 induziu um aumento significativo na atividade fungicida dessas células de maneira dose dependente. Adicionalmente após a ativação, foi detectado um aumento na produção de 51 anion superóxido e H2O2 por essas células, sugerindo a participação desses metabólitos como moléculas efetoras da atividade fungicida. O desafio das células em presença de catalase, levou a uma diminuição significativa da atividade fungicida comprovando o papel da H2O2 nesse processo. No entanto, os níveis de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Interleukin-15 is a cytokine produced by a wide range of different cell types, including macrophages in response to lipopolysaccharide or microbial infection. This cytokine may play a crucial role in the activation of phagocytic cells against pathogens, mainly during innate immune response. The effects of IL-15 on human polimorphonuclear leukocyte fungicidal activity against high virulent P. brasiliensis strain were investigated. Prétreatment with IL-15 for 18h, increased neutrophils fungicidal activity in a concentration dependent manner. In addition, exposure to IL-15 induced enhanced neutrophil oxidative burst evaluated by superóxide anion and H2O2 release. Catalase inhibits fungicidal activity confirming a role for H2O2 in fungus Killing. In contrast, IL-8 and TNF-alfa levels were not affected by IL-15 suggesting that its effects were not mediated by these cytokines. Together, the results showed that IL-15 is a potent stimulant of antifungal activities of human neutrophils, at least in part, by a mechanism dependent on oxidative metabolism. / Doutor

Orientador: Julio Defaveri / Resumo: A paracoccidioidomicose (Pbmicose) é micose sistêmica na qual complexos eventos inflamatórios e imunológicos são desencadeados pela interação fungo-hospedeiro, resultando em duas características importantes da doença: freqüente instalação de distúrbios imunorregulatórios e reação inflamatória granulomatosa. Este trabalho teve por objetivo estudar em pacientes portadores da forma crônica multifocal da Pbmicose, na fase pré-tratamento, as características da resposta granulomatosa em lesões de pele e mucosa, considerando suas populações celulares e a presença in situ de citocinas de padrão Th1 e Th2. Estes achados foram correlacionados com a gravidade clínica, níveis de competência imunológica humoral e celular e níveis séricos dessas mesmas citocinas. Foram estudados 27 pacientes com gravidade clínica moderada (13 pacientes), moderada/grave (8 pacientes), grave (5 pacientes) e não avaliada (1 paciente). As biópsias foram realizadas por punch de lesões de pele ou mucosa. Os soros foram separados de sangue obtido por punção venosa, e o teste cutâneo realizado pela paracoccidioidina. Nas biópsias foram analisados o número e padrão de distribuição de neutrófilos, eosinófilos, células gigantes, plasmócitos, linfócitos T CD3+ e CD8+, linfócitos B e células NK (estes três últimos caracterizados pela imuno-histoquímica), contagem de fungos e a detecção imuno-histoquímica de IL-4, IFN- , IL-10, TNF- e TGF- . No soro dos pacientes foram realizadas dosagens de IL-2, IL-4, IL-10 e TGF- e de anticorpos específicos anti-Pb por ensaio imunoenzimático (ELISA)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioidomycosis (Pbmycosis) is a systemic mycosis in which a complex inflammatory and immunological events are unchained by the interaction of the fungus (Pb) with the host tissues, resulting in two important characteristics of the disease: frequent immunoregulatory disturbances and a granulomatous inflammation. The aim of this work was to study in patients with the chronic multifocal form of Pbmycosis, before treatment, the characteristics of the granulomatous response in skin and mucosal lesions, considering the cellular populations and the presence in situ of Th1 and Th2 cytokines patterns. These results were correlated with the clinical severity, the levels of humoral and cellular immune competence and serum levels of those cytokines. Twenty seven patients were studied, distributed accordingly to clinical severity: moderate (13 patients), moderate/severe (8 patients), severe (5 patients), and not evaluated (1 patient). Punch biopsies were collected from skin or mucosal lesions, the serum obtained from venous blood samples to measured antibodies levels, and the skin test accomplished by the paracoccidioidin. In biopsies the following parameters were evaluated: the number and distribution pattern of neutrophils, eosinophils, giant cells, plasma cells, T CD3+ and CD8+ cells, B cells and NK cells (the last three characterized by immunohistochemistry), number of fungi, and detection of IL-4, IFN- , IL-10, TNF- and TGF- by immunohistochemistry. It was also measured the serum levels of IL-2, IL-4, IL-10 and TGF- and the level of specific antibodies anti-Pb by ELISA test. Specific granulomatous lesions, composed with epithelioid, well organized granuloma together with epithelioid loose, ill organized granuloma were observed in the same lesion of the dermis and submucosa. Neutrophils... (Complete abstract, click electronic address below) / Doutor

Resumo: Na paracoccidioidomicose, os estudos sobre os mecanismos de defesa do hospedeiro destacam o papel das células fagocitárias que participam ativamente dos mecanismos efetores diretos contra o fungo e da modulação da resposta inflamatória. Dentre essas células, nos últimos anos, os estudos têm se voltado para os neutrófilos, que exercem um importante papel efetor e modulador principalmente durante os estágios iniciais da infecção. As funções dessas células, incluindo as antimicrobicidas, podem ser reguladas por citocinas pró e anti-inflamatórias. Apesar dos mecanismos celulares e moleculares desse processo não estarem completamente entendidos, trabalhos nos últimos anos têm mostrado de forma bastante consistente o envolvimento dos "Toll Like Receptors" (TLRs). Neste contexto, os objetivos do presente trabalho foram: 1- Avaliar a expressão de TLR2 e TLR4 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a ou IFN-g e desafiados com cepa virulenta de Paracoccidioides brasiliensis cepa 18 (Pb18). 2- Avaliar a participação desses receptores na atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas: IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a, IFN-g e desafiados com Pb18. Nos ensaios referentes ao primeiro objetivo, as células foram tratadas por 18 horas com cada uma das citocinas ou LPS, posteriormente desafiadas com Pb 18 por 4 horas e avaliadas quanto a expressão de TLR2 e TLR4 por citometria de fluxo. Nos referentes ao segundo objetivo, as células foram ativadas com os mesmos estímulos, submetidas ao bloqueio de TLR2 e TLR4, através da incubação das células com anticorpos monoclonais específicos, desafiadas com Pb18 por 4 horas e analisadas quanto a atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10, por Elisa. Os resultados... (REsumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In paracoccidioidomycosis, phagocytic cells appear to provide one of the major lines of host defense. In this context, in last years, various studies have focused on the role of neutrophils that are involved in primary response to the fungus. Neutrophil functions are regulated by pro and anti-inflammatory cytokines. The molecular and cellular mechanisms involved in this process are not fully understood, but there are strong evidences about the involvement of "Toll Like Receptors" (TLRs). In this context, we aimed to evaluate TLR2 and TLR4 expression on human neutrophils primed with the cytokines GM-CSF, IL- 15, TNF-a or IFN-g and challenged with a virulent strain of Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Moreover, we asked if these receptors have a role on fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by primed and challenged cells. In first assays, neutrophils were incubated with each of cytokines or LPS by 18 h, challenged with Pb18 by 4 h and evaluated by TLR2 and TLR4 expression by flow cytometry. In other assays, cells were incubated with each of cytokines or LPS by 18h, submitted to TLR2 and TLR4 blocking by specific monoclonal antibodies, challenged with Pb18 for 4 h and evaluated for fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by ELISA. All cytokines increased TLR2 and TLR4 expression. Pb18 increased TLR2 expression inducing an additional effect to that of cytokines. On the contrary, it inhibited TLR4 expression. All cytokines increased neutrophils fungicidal activity, but this process was not associated with TLR2 or TLR4 expression. All cytokines and Pb18 increased H2O2 production, but in the same manner to fungicidal activity, the process was not associated to TLR2 or TLR4 expression. Neutrophils activation with GM-CSF and TNF-a resulted in a significative increase on IL-8... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Luciene Alarcão Dias Melicio / Banca: José Maurício Sforci / Banca: Sueli Aparecida Calvi / Banca: Gil Bernardi / Banca: Wafa Hanna Koury Cabrera / Doutor

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Ana Paula Bordon-Graciani / Banca: Silvio Luiz de Oliveira / Banca: Carlos Artério Sorgi / Banca: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Banca: Dulce Helena Jardim Constantino / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. O estabelecimento da paracoccidioidomicose-infecção ou paracoccidioidomicose-doença depende das interações parasita-hospedeiro que podem resultar em uma resposta imune mais ou menos eficaz por parte deste último. Embora vários dos mecanismos decorrentes dessa interação já estejam descritos, estudos sobre a participação de outros fatores potenciais podem ampliar sobremaneira o nosso entendimento sobre a imunopatogênese da PCM. Nesse sentido, os eicosanóides como as prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs) devem ser avaliados. Em trabalhos anteriores detectamos que o fungo induz a produção de PGs e LTs por monócitos humanos que, de uma forma autócrina, suprimem ou aumentam respectivamente, as atividades antifúngicas dessas células. No entanto, os estudos têm mostrado que além de induzir a produção de eicosanóides, os próprios fungos podem produzir esses mediadores, revelando um mecanismo de virulência que tem potencialmente grandes implicações para o entendimento dos mecanismos das infecções fúngicas. Baseados nesses estudos detectamos que o P. brasiliensis produz tanto PGs como LTs, usando fontes endógenas e exógenas de ácido araquidônico, e que ambos são importantes para a manutenção da viabilidade do fungo. Adicionalmente, os resultados sugeriram que o fungo utiliza as vias metabólicas da ciclooxigenase (COX) para a produção de PGs e da lipoxigenase (5-LO) para LTs. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos objetivando avaliar se o fungo produz outras classes de eicosanóides, além da PGE2 e LTB4, se as PGs e LTs liberados pelo P. brasiliensis podem ser considerados como PGE2 e LTB4 autênticos, isto é semelhantes aos detectados para os mamíferos, assim como estabelecer de uma forma definitiva se a COX e a 5-LO são as vias metabólicas utilizadas ... / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The establishment of paracoccidioidomycosis-infection or the evolution to paracoccidioidomycosis-disease in its more or less severe forms, primarily depends on complex host-parasite interaction, in which immune response mechanisms play an essential role. While many of these mechanisms have been elucidated, studies on the participation of other potential factors can greatly expand our understanding of PCM immunopathogenesis. Accordingly, eicosanoids such as prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs) should be evaluated. In previous studies we found that the fungus induces the production of prostaglandins and leukotrienes by human monocytes that in an autocrine way suppress and increase, respectively, the antifungal activities of these cells. However, studies have shown that in addition to inducing the production of eicosanoids, fungi themselves can produce these mediators, showing a mechanism for virulence that has potentially important implications for understanding the mechanisms of fungal pathogenicity. Based on these studies, we found that P. brasiliensis produces both PGs and LTs, using exogenous and endogenous sources of arachidonic acid and that both are important for fungus viability. Additionally, the results suggested that the fungus uses cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (5-LO) metabolic pathways for PGs and LTs production, respectively. Here, we profound these studies evaluating whether PGs and LTs released by P. brasiliensis can be considered as authentic LTB4 and PGE2, i.e. similar to those detected for mammals. We also asked whether the fungus, in addition to PGE2 and LTB4, produces other classes of eicosanoids. Finally, we intended to definitively determine whether COX and 5-LO are the metabolic pathways used for this production. We found that fungus PGE2 and LTB4 ... / Doutor

Orientador: Maria Teresinha Serrão Peraçoli / Banca: Maria de Lourder Ribeiro de Souza da Cunha / Banca: Vanessa Lara / Banca: Iracilda Z. Carlos / Banca: Sueli Calvi / Resumo: Receptores Toll-like RECONHECER componentes distintos da FUNGOS para iniciar a resposta imune inata. Examinamos se Paracoccidioides brasiliensis OU SEUS gp43 antígenos imunodominantes pode modular IN VITRO E TLR2 TLR4 expressão e produção TRIGGER citocinas por monócitos humanos. Monócitos de indivíduos saudáveis ​​foram incubadas com gp43 LYPOPOLYSACCHARIDE, (LPS) ou mortas pelo calor FORMAS leveduriforme do P. brasiliensis em uma proporção de 50 monócitos por célula fúngica (Pb18) a 37 º C por 4h e 18h. A EXPRESSÃO DE TLR2 E TLR4 SOBRE SUPERFÍCIE monócitos, e TNF-alfa, IL-10 e IL-12p40 PRODUÇÃO foram determinados por citometria de fluxo e ELISA respectivamente. Os resultados mostraram que a estimulação de monócitos COM OU LPS Pb18 PROMOVIDO UP-regulação da expressão TLR2 E TLR4 SOBRE SUPERFÍCIE EM RELAÇÃO monócitos às células não-estimulados EM AMBAS AS 4H e 18h de cultura, e aumentaram os níveis de TNF-alfa, IL- 10 e IL-12p40 PRINCIPALMENTE EM 18H DA CULTURA. POR OUTRO LADO, E EXPRESSÃO TLR4 BAIXA ALTA TLR2 são evocados por gp43 AT 4H DA CULTURA, associadas a altos níveis de TNF-alfa. No entanto, após 18H UMA MUDANÇA DE ALTA E BAIXA TLR2 TLR4 EXPRESSÕES foi seguido por elevados níveis de IL-10 e IL-12p40. Estes resultados sugerem que a gp43 pode induzir um desequilíbrio entre RESPOSTAS pró e anti-inflamatório em FUNGOS-monócitos interações, um efeito modulatório na CAMINHO TLR. AS TNF-alfa pode estar envolvida na patogênese da paracoccidioidomicose, O EFEITO regulatórios induzidos por gp43, VIA upregulation de TLR2 EXPRESSÃO E IL-10 produção, pode ser importante para proteger contra a lesão de tecido que é descrito neste micose. / Abstract: Toll-like receptors recognize distinct components of fungi to initiate the innate immune íesponse. We examined whether Paracoccidioides brasiliensis ar its immunodominant antigen gp43 can modulate in vitro TLR2 and TLR4 expression and trigger cytokine production by human monocytes. Monocytes from healthy individuaIs were incubated with gp43, IypopoIysaccharide (LPS) or heat-killed yeast forms of P. brasiliensis in a ratio of 50 monocytes per funga! cell (pb 18) at 37°C for 4h and I8h. The expression of TLR2 and TLR4 on monocyte surface, and TNF-alpha, IL-Io and IL-I2p4o production were determined by flow cytometry and ELISA respectiveIy. The results showed that monocyte stimuIation with LPS ar Pb18 promoted up-reguIation ofthe TLR2 and TLR4 expression on monocyte surface in reIation to the non-stimuIated cells at both 4h and I8h ofculture, and induced higher IeveIs ofTNF-aIpha, IL-Io and IL-12p4o mainly at I8h of culture. On the other hand, high TLR4 and low TLR2 expression were elicited by gp43 at 4h of cuIture, associated with higher Ievels of TNF-aIpha. However, after 18h a change to high TLR2 and !ow TLR4 expressions was followed by e1evated levels of IL-Io and IL-12p4o. These results suggest that gp43 might induce an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in fungal-monocyte interactions by a modulatory effect on TLR pathway. As TNF-alpha may be invoIved in the pathogenesis of paracoccidioidomycosis, the regulatory effect induced by gp43, via upregulation of TLR2 expression and IL-Io production, can be important to protect against tissue injury which is described in this mycosis. / Doutor

Resumo: A paracoccidioidomicose é uma das mais importantes micoses sistêmicas da América Latina e a resistência ao agente é fortemente dependente da resposta imune do hospedeiro. Devido à rica composição nutricional e suas propriedades medicinais o cogumelo comestível Agaricus blazei é amplamente utilizado na medicina tradicional. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se a suplementação nutricional de camundongos infectados por P. brasiliensis, com o cogumelo A. blazei, contribui para a manutenção de seu estado nutricional e de sua competência imunológica. Para isso, camundongos BALB/c foram infectados por via intratraqueal com leveduras de Pb 18 e suplementados dieteticamente com o cogumelo acrescentado à ração comercial. Os animais foram sacrificados aos 7 ou 14 dias pós-infecção para avaliar o grau de infecção no pulmão, baço e fígado e do efeito do tratamento sobre a capacidade de resposta imune celular. Os animais infectados apresentaram perda de peso no início da infecção, com recuperação após duas semanas. Os animais infectados e suplementados com ração 15% tiveram maior perda de peso, bem como menor nível de recuperação em relação ao peso inicial. Os parâmetros bioquímicos indicam que as funções hepáticas e renais sofreram alterações decorrentes da infecção mas os efeitos da suplementação nutricional foram de pouca relevância. O tratamento provocou exacerbação da infecção na fase inicial (7 dias), acompanhada de intensa redução da atividade linfoproliferativa. A resistência dos animais parece restaurada aos 14 dias nos animais que receberam 5% de cogumelo na ração, observando-se redução de fungos viáveis nos pulmões, restauração da capacidade de resposta proliferativa dos esplenócitos, aumento nos níveis de TNF-a e redução de IL-4 nos pulmões e discreto aumento de IFN-g no baço... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides is one of the main systemic mycosis in Latin America and the host resistance to the fungus Paracoccidioides brasiliensis, is strongly dependent on the immune responsiveness. Due to it rich nutritional composition and medicinal properties, the edible mushroom Agaricus blazei is widely used as traditional medicine. Then, our goal was to investigate whether the nutritional supplementation with A. blazei helps P. brasiliensis-infected mice to keep their nutritional status and immunocompetence. For this purpose, BALB/c mice were infected for intratracheal route with Pb 18 yeasts and fed with comercial chow supplemented with dried and powdered A. blazei fruiting bodies. Animals were evaluated at the 7th and 14th day on the infection levels, in lung, spleen and liver, and on cellular immunoresponsiveness. Infected mice showed weight loose in the beginning of the infection that was partially restored after 2 weeks. Infected animals, supplemented with 15% of A. blazei showed the higher weight loose, as well as lower restoring levels. Biochemical parameters indicate that the infection itself interfered in the liver and kidney functions but no relevant effect of nutritional supplementation was detected. The treatment induced infection exacerbation at the first week that was followed by intense decrease of lymphoproliferative activity of spleen cells. The resistance of mice against P. brasiliensis appears to be restored by the 14th day in those mice eating feed with 5% A. blazei. This view is supported by the observation that such animals have lower number of viable fungus inside the lungs than controls (group Pb), and also restored the lymphoproliferative activity. We also observed increased levels of TNF-a and decreased levels of IL-4 in the lungs and slight increase of INF-g in the spleen. Altogether, our results partially supported our initial hypothesis... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ramon Kaneno / Coorientador: Angela Maria V. C. Soares / Banca: Paulo Câmara Marques Pereira / Banca: Andrea Vanessa / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-20T17:01:06Z No. of bitstreams: 1 2012_MarcusDeMeloTeixeira.pdf: 2223016 bytes, checksum: 8d0a4310a9af7b34b66ff19b435e47f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-25T17:41:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MarcusDeMeloTeixeira.pdf: 2223016 bytes, checksum: 8d0a4310a9af7b34b66ff19b435e47f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T17:41:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MarcusDeMeloTeixeira.pdf: 2223016 bytes, checksum: 8d0a4310a9af7b34b66ff19b435e47f1 (MD5) / A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica que ocorre em vários países da América Latina, principalmente Brasil, Venezuela e Colômbia, afetando principalmente indivíduos da população rural. Por meio de estudos realizados nos campos da Biologia Molecular, Biologia Evolutiva e Ecologia no gênero Paracoccidioides, foi proposto neste trabalho uma nova espécie: Paracoccidioides lutzii sp. nov. Análises filogenéticas, estudos de genômica comparativa, análises de recombinação genética e análises morfológicas demonstram que P. lutzii representa uma linhagem altamente divergente monofileticamente separada de P. brasiliensis. P. lutzii é frequentemente encontrado nas regiões Centro-Oeste e Norte do Brasil. Os estudos comparativos entre os genomas de P. brasiliensis e P. lutzii revelaram uma alta divergência e diferenças significativas no tamanho do genoma, conteúdo gênico, elementos transponíveis, e repetições simples foram identificadas entre estas espécies. Estudos comparativos entre as espécies divergentes P. brasiliensis e P. lutzii geraram informações que podem ser utilizadas na clínica bem como no diagnóstico da PCM. Estudos de filogenia molecular indicaram que estas duas espécies de Paracoccidioides teriam um ciclo de vida sexuado devido à detecção de eventos de recombinação genética dentro destas populações. Estudos de genômica comparativa de todos os fungos dimórficos e patogênicos, usando como base os dados já classicamente descritos para a levedura Saccharomyces cerevisiae, revelaram a presença de genes relacionados à reprodução sexuada que incluem: o locus MAT e genes de receptores de feromônios, de feromônio-α, de enzimas de processamento de feromônios e reguladores de sinalização de resposta a feromônios. A expressão destes genes foi avaliada por PCR em tempo real em isolados de Paracoccidioides nas formas de micélio e levedura, demostrando-se ter uma expressão preferencial na forma filamentosa, similar ao que já foi descrito para Histoplasma capsulatum e Blastomyces dermatitidis. Além disto, a expressão dos genes relacionados ao ciclo sexual teve um aumento significativo quando na presença de feromônios obtidos de sobrenadantes de co-cultura de isolados de tipos sexuais opostos. Cruzamentos de diferentes tipos sexuais, tanto de P. brasiliensis como de P. lutzii, possibilitaram a identificação de ascocarpos jovens com presença de hifas enoveladas e constritas, relacionadas ao estágio inicial do acasalamento em fungos “Pezizomycotina”. Estes dados genômicos e morfológicos fortemente indicam a existência de ciclo sexual no gênero Paracoccidioides. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis that occurs in several Latin American countries, mainly Brazil, Venezuela and Colombia, affecting mostly the rural population. Through studies in the fields of Molecular Biology, Evolutionary Biology and Ecology in the genus Paracoccidioides, it was proposed in this work a new species: Paracoccidioides lutzii sp. nov. Phylogenetic analyzes, comparative genomics, analysis of genetic recombination and morphological analysis showed that P. lutzii represents a separate species, highly divergent from P. brasiliensis. P. lutzii is often found in the midwest and north part of Brazil. Comparative genomics studies between P. brasiliensis and P. lutzii revealed a high divergence and differences in genome size, gene content, transposable elements and DNA repeats were identified between these species. Comparative studies between the diverging species P. brasiliensis and P. lutzii generated information that can be useful in the clinical diagnosis of PCM. Evolutionary studies suggested that these two species of Paracoccidioides have a sexual phase in its life cycle due detection of recombination events within these populations. Studies of comparative genomics of all dimorphic fungal pathogens, using classically described genes for the yeast Saccharomyces cerevisiae, revealed the presence of genes related to sexual reproduction that include: the MAT locus, pheromone receptors and genes encoding for α-pheromone, processing enzymes and regulatory pheromone response to pheromone signaling cascade. The expression of these genes has been evaluated by real time PCR of Paracoccidioides isolates in yeast and mycelial forms, showing an increased expression in the filamentous form, similar to what was already described for Histoplasma capsulatum and Blastomyces dermatitidis. Moreover, the expression of genes related to sexual cycle increased significantly after exposure of pheromone taken from co-culture supernatants of strains of opposite sex type. Sexual crosses between different mating types, of P. brasiliensis and P. lutzii, enabled the identification of young ascocarps with hyphae reeled and constricted, related to the initial stage of mating in Pezizomycotina fungi. These genomic and morphological data strongly indicate the existence of sexual cycle in the genus Paracoccidioides.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-12-02T16:33:58Z No. of bitstreams: 1 2014_WaldeyrMendesCordeiroDaSilva.pdf: 7282235 bytes, checksum: 1cac8233b834aef263b3415e216ce1b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-12-02T17:40:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_WaldeyrMendesCordeiroDaSilva.pdf: 7282235 bytes, checksum: 1cac8233b834aef263b3415e216ce1b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-02T17:40:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_WaldeyrMendesCordeiroDaSilva.pdf: 7282235 bytes, checksum: 1cac8233b834aef263b3415e216ce1b1 (MD5) / Os fungos produzem uma variedade de metabólitos com aplicações na indústria e na medicina, ao mesmo tempo que podem ser patógenos humanos. O Paracoccidioides lutzii é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica autóctone da América Latina, onde cerca de 10 milhões de pessoas estão infectadas, inclusive no Brasil, o qual contribui com cerca de 80% dos casos, afetando principalmente indivíduos em áreas rurais. Neste trabalho, foi criado um método para identificar e organizar vias de metabolismo em fungos, com ênfase no metabolismo secundário. Para validar o método, foi realizado um estudo de caso para o fungo P. lutzii, cujos resultados obtidos identificaram 2.087 reações enzimáticas, 1.437 enzimas, 1.464 compostos e 335 vias metabólicas. As vias de metabolismo secundário representaram cerca de 4,5% do total de vias identificadas no P. lutzii. O método criado pode ser aplicado à reconstrução in silico de redes metabólicas de outros fungos. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fungi produce various metabolites with applications in industry and medicine, furthermore, can be human pathogens. Paracoccidioides lutzii is a dimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis in Latin America affecting approximately 10 million people, including Brazil, which contributes about 80% of cases, usually affecting individuals in rural areas. In this work, we create a method to identify and organize metabolic pathways in fungi, with emphasis on secondary metabolism. To validate this method, a case study was performed for the fungus P. lutzii. The results identified 2,087 enzymatic reactions, 1,437 enzymes, 1,464 compounds and 335 metabolic pathways. The secondary metabolism pathways represented around 4.5% of pathways identified in the P. lutzii. The method created can be applied to the in silico reconstruction of metabolic networks of other fungi.

Pacientes com paracoccidioidomicose (PCM) podem apresentar comorbidades de natureza não infecciosa, tais como a doença de Hodgkin, leucemias e carcinomas. Neste sentido, o presente trabalho tem como objetivo avaliar clinicamente a associação entre paracoccidioidomicose e neoplasia. Foi realizado um estudo retrospectivo durante um período de 35 anos (1972- 2007), das fichas clínicas de 802 pacientes com diagnóstico da micose, provenientes dos arquivos do Laboratório de Micologia, Santa Casa - Complexo Hospitalar, Porto Alegre. Vinte e quatro casos (3,18%) apresentaram concomitantemente algum tipo de neoplasia. Foram estudados aspectos demográficos, hábitos de vida, manifestações clínicas, radiológicas e laboratoriais, evolução e tratamento realizado em ambas as doenças. O diagnóstico da paracoccidioidomicose foi feito através do exame micológico direto, histopatologia e/ou soromicologia; todos os casos de neoplasia tiveram confirmação histopatológica e/ou citopatológica. Todos os pacientes eram do sexo masculino, com idade entre 40 e 65 anos, com uma mediana de 53 anos. Manifestações relacionadas ao aparelho respiratório foram as principais queixas quando do diagnóstico da micose. Predominou o envolvimento pulmonar seguido por tegumentar e ganglionar. Em 12 pacientes o diagnóstico da PCM precedeu o da neoplasia, em 10 foram simultâneos, e em dois a neoplasia foi identificada anteriormente à micose. Houve concomitância de lesões entre as duas doenças em 66,6% dos casos. Os carcinomas representaram 95,8% das neoplasias, dos quais o de pulmão foi o mais freqüente, com 15 casos (62,5%); um paciente tinha doença de Hodgkin. A diferença entre a freqüência de carcinoma brônquico na população estudada e na população sem a micose foi estatisticamente significante (p = 0,0015). A terapêutica da PCM consistiu, isoladamente, de sulfas (29,2%), sulfametoxazol-trimetoprim (20,8%), cetoconazol (12,5%), itraconazol (12,5%) e anfotericina B (4,2%); houve combinação entre drogas em dois casos e substituição em uma oportunidade. A conduta antineoplásica mais empregada foi cirúrgica (11/24) seguida da radioterápica (9/24), quimioterápica (3/24) de um não se obteve relato. Cura micológica foi observada em doze casos, em nove a evolução é desconhecida e três pacientes foram ao óbito. Em conjunto, os resultados mostraram que existe uma associação entre a paracoccidioidomicose e neoplasia. / Patients with paracoccidioidomycosis may have comorbidities of non-infectious, such as Hodgkin's disease, leukaemia and cancers. Thus, the present study aims to evaluate the clinical association between the paracoccidioidomycosis and neoplasia. A retrospective study was conducted over a period of 35 years (1972-2007) through the revision of chips clinics from 802 patients with clinical diagnosis of mycosis, from the archives of Mycology Laboratory, Santa Casa - Complex Hospital, Porto Alegre. Twenty-four cases (3.18%) had some form of cancer concurrently. They were studied demographics, habits of life, leading clinical, radiological and laboratory, as well as developments in treatment done in both diseases. Paracoccidioidomycosis was diagnosed based on direct mycological exam, serologic and/or histopathologic evidence. All cases of cancer were confirmed by histopathologic and/or cytopathologic examination. All patients were male, aged between 40 and 65 years, with a median of 53 years. Disturbs related to the respiratory system were the main complaints. Lung involvement was the most predominant, followed by the tegumentary and lymphatic. In 12 patients the diagnosis of paracoccidioidomycosis preceded that of neoplasia, 10 were simultaneous, and in two to neoplasia was identified prior to mycosis. There was a concomitance between both of the illnesses in 66,6% of the cases. The cancers accounted for 95.8% of the cancers of the lung, which was the most frequent, with 15 cases (62.5%); one patient had Hodgkin's disease. The difference between the frequency of bronchial carcinoma in the studied population and the population without mycosis was statistically significant (p = 0.0015). The paracoccidioidomycosis therapy consisted alone of sulfas (29,2%), sulfamethoxazoletrimethoprim (20,8%), ketoconazole (12,5%), itraconazole (12,5%) and amphotericin B (4,2%); there was a drug combination in both cases and a substitution in a given opportunity as well. The most used antineoplastic procedure was the surgical one (11/24), followed by radiotherapy (9/24) and chemotherapy (3/24). The mycological cure was noticed in twelve cases; in nine of the cases the evolution is unknown and three patients died. Together, the results showed that there is an association between paracoccidioidomycosis and cancer.

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T10:37:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Longhi_LarissaNaraAlegrini_M.pdf: 6631958 bytes, checksum: 45b4fc2e64262b037302e0269ebd8f71 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Tradicionalmente o papel das células NK na resposta imunológica tem sido associado com a resistência à infecção viral e tumores, porém estudos recentes apontam para a participação destas células na resposta imunológica contra outras doenças infecciosas. O objetivo deste estudo foi avaliar a possível participação de células NK (CD56+CD3-) na resposta imunológica ao fungo Paracoccidioides brasiliensis. Foram utilizadas células CD56+ isoladas por meio imunomagnético provenientes de pacientes com paracoccidioidomicose e de indivíduos controle. As células CD56+ foram avaliadas quanto à capacidade citotóxica direta contra leveduras de P. brasiliensis (cepa virulenta - Pb18 e avirulenta - Pb265) e contra células-alvo (monócitos) infectadas com leveduras de ambas as cepas. Também foi avaliada a expressão dos constituintes dos grânulos citotóxicos (granzima A, B, perforina e granulisina), receptores de ativação (NKG2D) e de inibição (KIR2DL2/L3/S2 e KIR3DL1), marcadores de ativação (CD69 e CD25), assim como a produção de citocinas (IFN-g e TNF-a) por meio de PCR em tempo real e por citometria de fluxo. A participação da IL-15 na ativação das células NK foi avaliada pela adição da citocina recombinante em alguns experimentos. Para avaliar a participação dos grânulos na atividade citotóxica direta e contra células-alvo em alguns experimentos as células foram tratadas com inibidores específicos (SrCl, concanamicina A ou EGTA). Os resultados demonstraram que células de pacientes apresentam resposta citotóxica (direta e contra células-alvo) inferior àquela observada nos indivíduos controle. A citotoxicidade direta foi dependente de grânulos, mas independente de perforina, enquanto que a citotoxicidade contra células-alvo foi dependente de perforina. A expressão de granulisina (RNAm e proteína) foi maior nas células de indivíduos controle. Além disso, observamos que células CD56+ apresentam a capacidade de secretar essa proteína após o estímulo com leveduras de P. brasiliensis. Também observamos que as células CD56+ de doadores normais são ativadas (aumentam a expressão de CD69 e CD25) quando estimuladas com o fungo, enquanto as células NK de pacientes não mostraram esse aumento, a não ser quando estimuladas com IL-15. Estes resultados demonstraram que as células CD56+ podem participar ativamente da resposta imunológica contra o P. brasiliensis, podendo contribuir tanto para a morte direta do fungo como de células infectadas, e que a granulisina pode desempenhar um papel preponderante no controle da infecção pelo P. brasiliensis. Outro fato importante observado foi que as células CD56+ quando estimuladas por células leveduriformes de P. brasiliensis produzem e secretam IFN-g, uma citocina com atuação importante na ativação de outras células do sistema imunológico como macrófagos e linfócitos, e dessa forma pode contribuir para o desenvolvimento da resposta imunológica adquirida subseqüente à infecção. / Abstract: Besides their role in viral infection and tumor resistance, recent studies have showed that NK cells also participate in the immune response against other infectious diseases. The aim of this study was to evaluate the possible role for NK cells (CD56+) in the immune response against the fungi Paracoccidioides brasiliensis. CD56+ cells from patients with paracoccidioidomycosis and healthy individuals were isolated by immmunomagnetic columms and antibodies. We evaluated the capacity of the direct killing of P. brasiliensis yeast cells (Pb18 virulent strain and Pb285 avirulent strain), as well as, the ability to kill infected target cells (monocytes infected with either virulent or avirulent strains). The CD56+ cells also were assessed in order to evaluate the expression of citotoxic granules (granzyme A, B, perforin and granulysin) and the expression of the activation receptor NKG2D, the inhibition receptors KIR2DL2/L3/S2 and KIR3DL1 and the activation molecules CD69 and CD25. We also determine the capability of production and release of cytokines (IFN-g and TNF-a) using Real Time PCR, flow cytometry and ELISA. The role of IL-15 was analyzed by the addition of recombinant cytokine in some experiments. To determine if the cytotoxic activity was dependent of granules, cell cultures were supplemented with specific inhibitors which prevent granule release. The results showed that cells from patients present a lower citotoxic response when compared to healthy individuals. The direct citotoxicity seems to be granule-dependent but independent on perforin, whereas the citotoxicity against target cells showed to be perforin dependent. It was observed an augmented expression of granulysin (mRNA and protein) in cells from controls, and that CD56+ cells are able to produce and release granulysin after stimulation with P. brasiliensis yeast cells. Furthermore, the analyses of CD56+ cells from controls showed elevated expression of CD25 and CD69 after the stimulus with yeast cells, while cells from patients are only activated in the presence of IL-15. These results demonstrated that CD56+ cells can participate actively of the immune response against the P. brasiliensis infection either by destroying directly yeast cells or by the recognition and killing of infected cells. Granulysin is the possible mediator of the cytotoxic effect observed in this study, once this protein is produced and released by CD56+ cells. Another important data is the finding that CD56+ cells are able to produce IFN-g after the stimulus, which could influence the subsequent acquired immunological response by stimulating others cells as macrophages and lymphocytes. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas