Düsseldorf, Universiẗat, Diss., 2001.

Lipases (E.C. 3.1.1.3) são serina-hidrolases e agem em sobre ésteres de ácidos graxos de cadeia curta. Elas exibem atividade específica e enantiosseletiva, e sendo assim, há vasto interesse comercial, em pesquisa e indústria de biotecnologia. Lipases microbianas são interessantes para indústria, devido à facilidade de purificação e alta produção que permitem. Muitas leveduras possuem capacidade de produzir naturalmente estas enzimas, permitindo a obtenção de lipases não-transgênicas e com maior rapidez. Este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de lipase em leveduras selvagens e otimizar a sua produção em uma linhagem selecionada, bem como caracterizar esta enzima. Uma varredura inicial foi realizada em placas de Tween 80 e Ágar-óleo. Leveduras com crescimento positivo foram então cultivadas em meio mínimo sob agitação, suplementado com óleo de soja, e o sobrenadante teve a sua atividade enzimática testada sobre p-nitrofenil palmitato (pNPP). Foram testadas 133 linhagens provenientes de diferentes substratos, e treze apresentaram uma atividade lipolítica significativamente alta em comparação com as demais (p <0,001). Otimizações preliminares mostram condições ótimas de secreção da enzima produzida pela levedura selecionada, Candida parapsilosis QU110, em meios de cultura com pH inicial em torno de 6,0, contendo triptona e óleo de oliva como fontes de nitrogênio e carbono, respectivamente. O extrato bruto (sobrenadante livre de células) apresenta estabilidade a surfactantes não-iônicos e n-hexano, mas não a etanol ou metanol. Condições ótimas de atividade da enzima, avaliadas pela metodologia de superfície de resposta, foram observadas a 36 °C e pH 8,0. / Lipases (E.C. 3.1.1.3) are serine-hydrolases, and act on long chain fatty acid ester bonds. They exhibit specific and enantioselective activities, and as such there is plenty of interest for industry. Microbial lipases are interesting for industry, because its ease of purification and high yelds it permits. Several yeasts possess the ability of naturallly produce these enzymes, allowing the fast production of non-transgenic lipases. This work aimed at evaluating lipase production in wild yeast strains and optimizing its production, as well as characterizing this enzyme. An initial screening was made on Tween 80 and oil-agar plates. Growing yeasts were then cultivated under agitation in oil-supplemented minimum medium, and the supernatant had its enzymatic activity tested over p-nitrophenyl palmitate (pNPP). One-hundred and thirty-three strains isolated from different substrates were tested, and thirteen showed significantly high lipolytic activity when compared to the others (p<0,05). Preliminary optimization of lipase production by the selected yeast, Candida parapsilosis QU110, showed optimal enzyme secretion in media with initial pH 6.0, containing olive oil and tryptone as carbon and nitrogen sources, respectively. The crude extract (cell-free supernatant) showed stability against surfactants and n-hexan, but not against ethanol or methanol. Optimal enzyme activity conditions, evaluated through surface response methodology, were observed at 36 °C and pH 8.0.

Lipases (E.C. 3.1.1.3) são serina-hidrolases e agem em sobre ésteres de ácidos graxos de cadeia curta. Elas exibem atividade específica e enantiosseletiva, e sendo assim, há vasto interesse comercial, em pesquisa e indústria de biotecnologia. Lipases microbianas são interessantes para indústria, devido à facilidade de purificação e alta produção que permitem. Muitas leveduras possuem capacidade de produzir naturalmente estas enzimas, permitindo a obtenção de lipases não-transgênicas e com maior rapidez. Este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de lipase em leveduras selvagens e otimizar a sua produção em uma linhagem selecionada, bem como caracterizar esta enzima. Uma varredura inicial foi realizada em placas de Tween 80 e Ágar-óleo. Leveduras com crescimento positivo foram então cultivadas em meio mínimo sob agitação, suplementado com óleo de soja, e o sobrenadante teve a sua atividade enzimática testada sobre p-nitrofenil palmitato (pNPP). Foram testadas 133 linhagens provenientes de diferentes substratos, e treze apresentaram uma atividade lipolítica significativamente alta em comparação com as demais (p <0,001). Otimizações preliminares mostram condições ótimas de secreção da enzima produzida pela levedura selecionada, Candida parapsilosis QU110, em meios de cultura com pH inicial em torno de 6,0, contendo triptona e óleo de oliva como fontes de nitrogênio e carbono, respectivamente. O extrato bruto (sobrenadante livre de células) apresenta estabilidade a surfactantes não-iônicos e n-hexano, mas não a etanol ou metanol. Condições ótimas de atividade da enzima, avaliadas pela metodologia de superfície de resposta, foram observadas a 36 °C e pH 8,0. / Lipases (E.C. 3.1.1.3) are serine-hydrolases, and act on long chain fatty acid ester bonds. They exhibit specific and enantioselective activities, and as such there is plenty of interest for industry. Microbial lipases are interesting for industry, because its ease of purification and high yelds it permits. Several yeasts possess the ability of naturallly produce these enzymes, allowing the fast production of non-transgenic lipases. This work aimed at evaluating lipase production in wild yeast strains and optimizing its production, as well as characterizing this enzyme. An initial screening was made on Tween 80 and oil-agar plates. Growing yeasts were then cultivated under agitation in oil-supplemented minimum medium, and the supernatant had its enzymatic activity tested over p-nitrophenyl palmitate (pNPP). One-hundred and thirty-three strains isolated from different substrates were tested, and thirteen showed significantly high lipolytic activity when compared to the others (p<0,05). Preliminary optimization of lipase production by the selected yeast, Candida parapsilosis QU110, showed optimal enzyme secretion in media with initial pH 6.0, containing olive oil and tryptone as carbon and nitrogen sources, respectively. The crude extract (cell-free supernatant) showed stability against surfactants and n-hexan, but not against ethanol or methanol. Optimal enzyme activity conditions, evaluated through surface response methodology, were observed at 36 °C and pH 8.0.

Lipases (E.C. 3.1.1.3) são serina-hidrolases e agem em sobre ésteres de ácidos graxos de cadeia curta. Elas exibem atividade específica e enantiosseletiva, e sendo assim, há vasto interesse comercial, em pesquisa e indústria de biotecnologia. Lipases microbianas são interessantes para indústria, devido à facilidade de purificação e alta produção que permitem. Muitas leveduras possuem capacidade de produzir naturalmente estas enzimas, permitindo a obtenção de lipases não-transgênicas e com maior rapidez. Este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de lipase em leveduras selvagens e otimizar a sua produção em uma linhagem selecionada, bem como caracterizar esta enzima. Uma varredura inicial foi realizada em placas de Tween 80 e Ágar-óleo. Leveduras com crescimento positivo foram então cultivadas em meio mínimo sob agitação, suplementado com óleo de soja, e o sobrenadante teve a sua atividade enzimática testada sobre p-nitrofenil palmitato (pNPP). Foram testadas 133 linhagens provenientes de diferentes substratos, e treze apresentaram uma atividade lipolítica significativamente alta em comparação com as demais (p <0,001). Otimizações preliminares mostram condições ótimas de secreção da enzima produzida pela levedura selecionada, Candida parapsilosis QU110, em meios de cultura com pH inicial em torno de 6,0, contendo triptona e óleo de oliva como fontes de nitrogênio e carbono, respectivamente. O extrato bruto (sobrenadante livre de células) apresenta estabilidade a surfactantes não-iônicos e n-hexano, mas não a etanol ou metanol. Condições ótimas de atividade da enzima, avaliadas pela metodologia de superfície de resposta, foram observadas a 36 °C e pH 8,0. / Lipases (E.C. 3.1.1.3) are serine-hydrolases, and act on long chain fatty acid ester bonds. They exhibit specific and enantioselective activities, and as such there is plenty of interest for industry. Microbial lipases are interesting for industry, because its ease of purification and high yelds it permits. Several yeasts possess the ability of naturallly produce these enzymes, allowing the fast production of non-transgenic lipases. This work aimed at evaluating lipase production in wild yeast strains and optimizing its production, as well as characterizing this enzyme. An initial screening was made on Tween 80 and oil-agar plates. Growing yeasts were then cultivated under agitation in oil-supplemented minimum medium, and the supernatant had its enzymatic activity tested over p-nitrophenyl palmitate (pNPP). One-hundred and thirty-three strains isolated from different substrates were tested, and thirteen showed significantly high lipolytic activity when compared to the others (p<0,05). Preliminary optimization of lipase production by the selected yeast, Candida parapsilosis QU110, showed optimal enzyme secretion in media with initial pH 6.0, containing olive oil and tryptone as carbon and nitrogen sources, respectively. The crude extract (cell-free supernatant) showed stability against surfactants and n-hexan, but not against ethanol or methanol. Optimal enzyme activity conditions, evaluated through surface response methodology, were observed at 36 °C and pH 8.0.

MACIEL, Antônio Auberson Martins. Avaliação da atividade sinérgica entre miconazol e nanopartículas de prata produzidas por síntese verde contra cepas de candida parapsilosis. 2016. 60 f. Dissertação (Mestrado em Química)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2017-01-13T18:38:21Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_aammaciel.pdf: 2326328 bytes, checksum: d4a77411031e2026a32f9ae412e61e56 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-19T13:10:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_aammaciel.pdf: 2326328 bytes, checksum: d4a77411031e2026a32f9ae412e61e56 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-19T13:10:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_aammaciel.pdf: 2326328 bytes, checksum: d4a77411031e2026a32f9ae412e61e56 (MD5) Previous issue date: 2016 / The study of nanoparticles on biological activity of microorganisms is becoming more popular and important as there is the emergence of resistance as well as the ineffectiveness of some antimicrobials against these microorganisms. In particular, the silver nanoparticles gained expansion in the new field of nanomedicine through their development and incorporation into a range of products and technologies. Candidemia and candidiasis are among the most common infections and which have significant morbidity and mortality. The candidemia corresponds to bloodstream infection and candidiasis refers to infection with Candida yeasts in any body site. The objective of this study was to evaluate the in vitro activity of synergy silver nanoparticles (AgNP) with the antifungal azole class of imidazole, Miconazole, against strains of Candida parapsilosis. The green AgNP were synthesized via synthesis with varying the concentration of the stabilizer, sodium dodecyl sulfate (SDS), 0,5g; 0,25g and 0,1g. The AgNP were characterized by spectroscopy UV / visible, infrared Fourier transform spectroscopy, X-ray diffraction, light scattering and scanning electron microscopy with microanalysis. In assessing the synergistic activity were used 50 strains of Candida parapsilosis. The AgNP with 0,5g of SDS reached an average size of 77,58 nm and zeta potential of -49,2 while NPAg with 0,25 g of SDS reached an average size of 91,22 nm and zeta potential of -47,2. No stabilization AgNP with 0,1g SDS. The AgNP-G-SDS showed high antifungal activity when combined with Miconazole. / O estudo de nanopartículas com atividade biológica em microorganismos vem ganhando espaço devido ao aparecimento da resistência e ineficácia de alguns antimicrobianos. Em especial, as nanopartículas de prata (AgNPs) ganharam expansão no novo campo da nanomedicina através do seu desenvolvimento e incorporação em uma gama de produtos e tecnologias. Candidemia e candidíase estão entre as infecções mais comuns e que apresentam significante morbidade e mortalidade. A candidemia corresponde à infecção da corrente sanguínea e a candidíase refere-se à infecção por leveduras do gênero Candida em qualquer sítio corpóreo. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade in vitro da sinergia de AgNPs com o antifúngico azólico da classe dos imidazólicos, Miconazol, contra cepas de Candida parapsilosis. As AgNPs foram sintetizadas via síntese verde com variação da concentração do estabilizante, Dodecil-Sulfato de Sódio (SDS) 0,5g; 0,25g e 0,1g. As AgNP foram caracterizadas por espectroscopia Ultravioleta/visível, Infravermelho com transformada de Fourier, Difração de raios-X, Espalhamento de luz e Microscopia eletrônica de varredura com a microanálise. Na avaliação da atividade sinérgica foram utilizadas 50 cepas de Candida parapsilosis. As AgNPs com 0,5g de SDS apresentaram tamanho médio de 77,58 nm e potencial zeta de -49,2 enquanto as AgNP com 0,25g de SDS apresentaram tamanho médio de 91,22 nm e potencial zeta de -47,2. Não houve estabilização de AgNP com 0,1g de SDS. As AgNP -G-SDS mostraram elevada atividade antifúngica quando associadas ao Miconazol.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-01-27T16:27:50Z No. of bitstreams: 2 Tese - Fábio Silvestre Ataides - 2014.pdf: 2285867 bytes, checksum: 7c53025bcd16ddc4bc411b6f0415905a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-28T11:43:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Fábio Silvestre Ataides - 2014.pdf: 2285867 bytes, checksum: 7c53025bcd16ddc4bc411b6f0415905a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-28T11:43:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Fábio Silvestre Ataides - 2014.pdf: 2285867 bytes, checksum: 7c53025bcd16ddc4bc411b6f0415905a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-08-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Candida species are associated with clinical manifestations that can characterize from superficial infections up to systemic involvement. Non-albicans species are considered emerging, and Candida parapsilosis is the main etiological agent in several casuistics. The secondary alcohol dehydrogenase (SADH) gene amplification and restriction fragment analysis by enzyme digestion BanI allows differentiation of C. parapsilosis in a species complex formed by C. parapsilosis sensu stricto, C. orthopsilosis and C. metapsilosis that may present behaviors different virulence and response to antifungal agents. Thus, this study aims to identify the species of the C. parapsilosis complex, obtained from mycology collection of the Mycology Laboratory of the Institute of Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goiás, using molecular methods, as well as the characterization of factors virulence and in vitro susceptibility to different antifungal agents. For the distinction between the species, was performed a polymerase chain reaction followed by digestion with restriction enzyme BanI. After the identification of 87 isolates from blood (54) and nails (33), the determination of virulence factors such as proteases, esterase, phospholipase, hemolysins, adhesion, biofilm formation and switching phenomenon were performed. The profile of in vitro susceptibility to amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole, posaconazole and caspofungin were performed using the Etest® method. The results showed that C. parapsilosis sensu stricto is the most common in our region (78), followed by C.orthopsilosis (5) C. metapsilosis (4). There was no difference between the behavior of virulence by the three species, but noted that there is divergence in the susceptibility to antifungal agents. Isolates of C. parapsilosis sensu stricto were less susceptible to amphotericin B, itraconazole and caspofungin compared with the susceptibility patterns of C. orthopsilosis and C. metapsilosis. A percentage of 10.2% of the isolates of C. parapsilosis sensu stricto no were susceptible to caspofungin. This paper reports the first identification of species of the C. parapsilosis complex in the state of Goiás, Brazil, and shows the importance of determining antifungal susceptibility to appropriate therapy. / As espécies do gênero Candida estão relacionadas com manifestações clínicas que podem caracterizar desde infecções superficiais até um acometimento sistêmico. Espécies não-albicans, são consideradas emergentes, sendo que Candida parapsilosis é o principal agente etiológico em várias casuísticas. A amplificação do gene Secondary Alcohol Dehydrogenase (SADH) e a análise dos fragmentos de restrição pela enzima de digestão BanI, permite a diferenciação de C. parapsilosis em um complexo de espécies formado pela C. parapsilosis sensu stricto, C. orthopsilosis e C. metapsilosis, que podem apresentar comportamentos diferentes de virulência e resposta aos antifúngicos. Deste modo, este trabalho se propõe a identificar as espécies pertencentes ao complexo C. parapsilosis, obtidas da micoteca do Laboratório de Micologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, usando métodos moleculares, bem como a caracterização dos fatores de virulência, e perfil de suscetibilidade in vitro a diferentes agentes antifúngicos. Para a distinção entre as espécies foi realizado a reação em cadeia da polimerase (PCR) seguido de digestão pela enzima de restrição BanI. Após a identificação de 87 isolados obtidos de sangue (54) e de unhas (33), foi realizada a determinação dos fatores de virulência como proteinases, esterase, fosfolipase, hemolisinas, aderência, formação de biofilme e fenômeno switching. O perfil de suscetibilidade a anfotericina B, fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol e caspofungina foi realizado usando-se o método de Etest®. Os resultados mostraram que C. parapsilosis sensu stricto é a mais frequente na nossa região (78), seguido de C. orthopsilosis (5) e C. metapsilosis (4). Não se verificou diferença entre o comportamento de virulência pelas três espécies, mas foi observado que há divergência na suscetibilidade aos agentes antifúngicos. Isolados de C. parapsilosis sensu stricto foram menos suscetíveis a anfotericina B, itraconazol e caspofungina quando comparados com os padrões de suscetibilidade de C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Um percentual de 10,2% dos isolados de C. parapsilosis sensu stricto apresentaram-se não suscetíveis a caspofungina. Este trabalho relata pela primeira vez a identificação de espécies do complexo C. parapsilosis no estado de Goiás, Brasil, e mostra a importância de determinação de suscetibilidade antifúngica para uma terapia adequada.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-03Bitstream added on 2014-06-13T20:27:53Z : No. of bitstreams: 1 pires_rh_dr_ara_arafcf.pdf: 3367810 bytes, checksum: 13d0557a242d86f17d908b6bdf622fc0 (MD5) / Unidades de hemodiálise utilizam enormes quantidades de água potável para o funcionamento de rins artificiais”. Problemas microbiológicos com sistemas de distribuição de água potável são geralmente associados à presença de biofilmes formados por adesão e crescimento de microrganismos em superfícies. O patógeno humano Candida é capaz de crescer como biofilme na maioria dos aparatos médicos de uso corrente. Nos sistemas de hemodiálise, a formação de biofilme é relevante devido à contínua liberação de microrganismos que o compõe, os quais mostram fenótipo diverso daquele encontrado em seus homólogos de vida livre (forma planctônica de crescimento) com relação à transcrição gênica, velocidade de crescimento e habilidade de resistir a antimicrobianos e biocidas. Candida parapsilosis, atualmente dividida em três espécies distintas, tem sido associada às infecções decorrentes do uso de dispositivos médicos constituídos de material plástico e também de proliferar em soluções ricas em glicose, sendo que, tipicamente, tais infecções são relacionadas à formação de biofilmes. Assim, este trabalho teve como principais objetivos caracterizar molecularmente isolados identificados como C. parapsilosis advindos do circuito hídrico de uma Unidade de Hemodiálise coletados entre 2004 e 2006; verificar a capacidade de formação de biofilmes pelos mesmos; o efeito de produtos sintéticos e naturais, bem como a sensibilidade aos agentes antimicrobianos de uso clínico: anfotericina, fluconazol e voriconazol nos isolados. Por outro lado, técnicas proteômicas foram usadas para comparar o perfil de proteínas em isolados de C. parapsilosis capazes de crescerem no modo biofilme e em isolados que não apresentaram essa propriedade. Assim, 100 isolados fenotipicamente classificados como C. parapsilosis foram reclassificados por técnicas moleculares. Biofilmes foram... / Hemodialysis units use large amounts of water for the operation of artificial kidneys. Microbiological problems with distribution systems of drinking water are usually associated with the presence of biofilms formed by adhesion and growth of microorganisms on surfaces. The human pathogen Candida is able to grow as biofilm in most medical devices in current use. In hemodialysis systems, biofilm formation is relevant because of the continuous release of organisms that compose it, which have a phenotype different from their counterparts found in free-living (planktonic growth form) with respect to gene transcription, growth rate and ability to resist antibiotics and disinfectants. Candida parapsilosis, currently divided into three distinct species, has been linked to infections resulting from the use of medical devices made of plastic material and also to proliferate in glucose-rich solutions, and, typically, such infections are related to the formation of biofilms. The goals of the present study were to molecularly characterize isolates identified as C. parapsilosis coming from the water circuit of a hemodialysis unit between 2004 and 2006, assess at ability to form biofilms by these species, and to monitor the effect of synthetic and natural, as well the susceptibilities to antifungal agents in clinical use: amphotericin, fluconazole and voriconazole. Moreover, proteomic techniques were used to compare the profile of proteins isolated from C. parapsilosis able to grow in the biofilm mode and isolates that did not have this property. Thus, 100 strains classified as C. parapsilosis were identified by molecular techniques. Candida biofilms were formed in microplates and monitored by using colorimetric assay of tetrazolium salts reducing method (MTT), by the enumeration of colony forming units (CFU/mL), and by confocal scanning laser microscopy. The susceptibility to antifungal drugs... (Complete abstract click electronic access below)

Les lipases/acyltransférases homologues à CpLIP2 de Candida parapsilosis forment un groupe phylogénétique marqué (au moins 56% d’identité entre les séquences protéiques) . Elles partagent le phénotype d’une activité significative d’acyltransfert, et ce, même dans un milieu aqueux avec une forte activité thermodynamique de l’eau (aW > 0.95), mais diffèrent dans leurs spécificités de substrats. L’identification et la caractérisation de nouvelles lipases/acyltransférases, CalLAc8 et CalLAc5 de Candida albicans et CduLAc de Candida dublininensis, ont apporté de nouveaux éclaircissements sur les relations structure/fonction au sein de cette famille particulière. Dans un premier temps, une définition claire et une méthodologie simple pour évaluer la capacité des enzymes lipolytiques à catalyser l’acyltransfert ont été élaborées. Puis, une stratégie d’ingénierie des protéines, basée sur une analyse comparative des structures 3D et de la mutagénèse dirigée, a été appliquée dans le but d’identifier les déterminants structuraux impliqués dans l’activité d’acyltransfert et la spécificité de substrat des lipases/acyltransférases. Il a été démontré que le caractère hydrophobe d’une cavité située sous le site actif était déterminant pour l’activité de transfert en favorisant les nucléophiles moins polaires que l’eau dans l’étape de désacylation du mécanisme catalytique. Ainsi, des mutants améliorés de plusieurs enzymes sauvages ont pu être élaborés. En parallèle, des enzymes chimériques ont été construites sur la base d’échanges rationnels de sous-domaines (corps principal, chapeau et volet C-terminal). Leur caractérisation a confirmé le rôle du chapeau dans la spécificité de substrat et le rôle principal de « l’acyltransfer pocket » dans la capacité d’acyltransfert. Une potentielle protéine ancestrale de la famille PaleoLAc a également été conçue pour trouver de nouveaux résidus clés et donner un aperçu de l’histoire évolutive de la spécificité de substrats. / Lipases/acyltransferases homologous to CpLIP2 from Candida parapsilosis constitute a consistent phylogenetic subgroup with at least 56% identity. They share the phenotype of a significant acyltransfer activity, even in aqueous media with a high thermodynamic activity of water (aW > 0.95), but are divergent in their substrate specificities. The identification and the characterization of new lipases/acyltransferases, CalLAc8 and CalLAc5 from Candida albicans and CduLAc from Candida dublininensis, brought new enlightenments to the structure/function relationships in this peculiar family. After the elaboration of a clear definition and a simple methodology to assess the acyltransferase character of lipolytic enzymes, a rational design strategy, based on comparative 3D structure analysis and site-directed mutagenesis, was applied to find structural determinants of the acyltransfer ability and the substrate specificities of lipases/acyltransferases. It was evidenced that the hydrophobicity of a cavity located under the active site was determinant for the acyltransfer activity. This allowed the improvement of the acyltransfer activity of several natural enzymes. In parallel, chimeric enzymes with rational exchanges of protein subdomains (main core, cap and C-term flap) were designed, and their characterization confirmed the role of the cap in the substrates specificity and the main role of the acyltransfer pocket in the acyltransfer ability. A putative ancestral protein of the family PaleoLAc was also designed to find new key residues and to give insights on the evolutionary history of the substrate specificities.

por fatores químicos e físicos, promovendo infecções hospitalares relacionadas ao uso de cateteres e demais instrumentos hospitalares, elevando os índices de mortalidade e morbidade de pacientes. Portanto, garantir a correta desinfecção capaz de impedir contaminações e infecções em ambientes hospitalares é de extrema importância. Para este fim, neste estudo explorou-se a seleção de uma substância capaz de marcar e ser biocida contra biofilmes fúngicos em superfícies de aço inox, a partir de nove candidatos benzimidazóis fluorescentes, com códigos NB1 a NB9 e oito sais imidazólicos de corantes azóicos, denominados C4MImErioCr, C10MImMO, C16MImMO, (C10)2MImMO, C4MImMO, C10MImORANGEII, C16MImORANGEII e (C10)2MImORANGEII. Desenvolveu-se para este fim um roteiro metodológico para determinar quais destas substancias são capazes de marcar e eliminar biofilmes de forma eficaz e segura. Os métodos utilizados para avaliar as substâncias foram (1) a Concentração Mínima Inibitória (MIC) conforme protocolo do CLSI M27-A3, (2) microscopias verificando capacidade das substâncias em marcar células, (3) ensaios com deposição sobre superfície do corpo de prova (placas de aço inox) com biofilme, (4) verificação da atividade biocida sobre biofilmes utilizando microscopias e (5) ensaios de citotoxicidade. Essas substâncias foram testadas frente a nove cepas de Candida spp., incluindo C. tropicalis, C. albicans e C. parapsilosis Na avaliação das substâncias, SI de corantes azóicos inibiram o crescimento celular de fungos, já o benzimidazol fluorescente NB7 apresentou atividades simultâneas de detecção e ação biocida sobre o biofilme. Todas as cepas testadas foram sensíveis a essa substância. Além disso, os biofilmes formados pelas cepas ATCC 18804 (C. albicans,) ATCC 22019 (C. parapsilosis) e ATCC 750 (C. tropicalis) na superfície de aço inox 304 sofreram ação biocida, quando expostas por 15 segundos a NB7, sendo um potencial sanitizante. / Biofilms provide an environment capable of protecting microbial cells from damage by chemical and physical factors of the immune system, and hinder the penetration of various antimicrobial agents, promoting nosocomial infections related to catheters, increasing mortality and morbidity of patients. Therefore, it is important to ensure proper hygiene to prevent contamination and infections in hospital environments. For this purpose, this study explored the identification of a substance that both detects and have biocide activity against fungal biofilms on stainless steel surfaces. Both nine fluorescent benzimidazole substances, coded NB1 to NB9 and eight imidazolium salts of azo dyes, named denominados C4MImErioCr, C10MImMO, C16MImMO, (C10)2MImMO, C4MImMO, C10MImORANGEII, C16MImORANGEII e (C10)2MImORANGEII were tested as candidates. These substances were tested applying a methodology developed to determine if a substance is able detecting and have biocide activity against fungal biofilms. Overall, this study involved the following methods: (1) Minimum Inhibitory concentration test following the CLSI protocol (M27-A3; the substances were tested against nine fungal strains, including C. tropicalis, C. albicans and C. parapsilosis.), (2) microscopy to determine the marker capacity, (3) spraying tests of the substances on surfaces (stainless steel) with fungal biofilms, (4) tests to verify the capability of the substances to both stain and were biocide against fungal biofilms, applying microscopic techniques and (5) cytotoxicity tests Within the set of seventeen substances, benzimidazole derivative NB7 was identified with the desired capabilities, staining and biocide activity against fungal biofilms at the same time. All tested fungal strains were sensible to this substance. A biocide activity was identified on the biofilms of ATCC 18804 (C. albicans), ATCC 22019 (C. parapsilosis) and ATCC 750 (C .tropicalis), grown on stainless steel 304, when exposed fifteen seconds to substance NB7. Although this substance showed being cytotoxic, it represents a promising candidate for sanitization purposes, including medical tools.

Orientador: Eduardo Luiz Bagagli / Resumo: Infecções fúngicas causadas por leveduras constituem um dos maiores problemas em pacientes hospitalizados em todo o mundo e têm se tornado uma importante causa de morbidade e mortalidade. Embora Candida albicans seja a espécie mais frequentemente isolada e sua forma de infecção ocorra geralmente por translocação endógena, tem-se observado um aumento das espécies não-albicans, com destaque para o complexo C. parapsilosis, cuja principal forma de infecção é exógena, provavelmente pelas mãos dos profissionais de saúde. Este trabalho propôs estudar os aspectos microbiológicos e ambientais das candidemias, com especial atenção para o complexo Candida parapsilosis, no hospital terciário HC/FMB/UNESP, Botucatu, utilizando-se de métodos moleculares, busca ativa dos agentes no ambiente hospitalar (ar, superfícies e mãos de profissionais de saúde), bem como determinar os fatores de virulência e susceptibilidade aos antifúngicos destas espécies e associação com o desfecho clínico. Os isolados clínicos (obtidos de hemoculturas, período 2007-2015) e ambientais (período 2014-2015) de C. parapsilosis sensu lato foram identificados pelo meio CHROMagar Candida, Vitek-2, sequenciamento do rDNA e perfis dos inteins VMA e ThrRS. Fatores de virulência (produção de proteinase, fosfolipase e biofilme) e perfis de susceptibilidade aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol, voriconazol, caspofungina e micafungina foram estimados, e dados clínicos obtidos junto aos prontuários dos pacientes. Dentre ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fungal infections caused by yeasts are serious problems in hospitalized patients around the globe and have become a major cause of morbidity and mortality. Although Candida albicans is the most frequently isolated species and its infection usually occurs by endogenous translocation, an increase of non-albicans species has been observed, with emphasys for the C. parapsilosis complex, whose main route of infection is exogenous, probably by the hands of health professionals. This work proposes to study the microbiological and environmental aspects of candidemia, with special attention to the C. parapsilosis complex, in a public tertiary hospital HC/FMB/UNESP, in Botucatu, using the molecular methods, active search of agents in the hospital environment (air, surfaces and hands of health professionals), as well as to determine the virulence factors and susceptibility to the antifungals of these species and correlate with the patient clinical outcomes. The clinical isolates (obtained of the blood cultures, 2007-2015 period) and environmental (2014-2015 period) of the C. parapsilosis sensu lato were identified by CHROMagar Candida medium, Vitek-2, rDNA sequencing and VMA and ThrRS inteins profiles. Virulence factors (production of proteinase, phospholypase and biofilm) and profiles of susceptibility to antifungals amphotericin B, fluconazole, voriconazole, caspofungin and micafungin were estimated, and the clinical data were obtained from patient’s records. Among the clinical isolat... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor